Name: crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Bu araştırma tarafından sağlanan için finansman: Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme Çin Program (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin (31320103922, 31230061) ve proje, Ulusal temel araştırma (973) programı Çin (2015CB856500, 2015CB856504). Beamline BL17U1 Shanghai sinkrotron radyasyon tesisi (SSRF), personel için minnettarız.

1. Gen klonlama, Protein ifade ve arıtma
<ol><li>PCR yükseltmek için ilgi protein karşılık gelen DNA (DBM RyR, Genbank artıkları 1-205 Hayır Hes. AFW97408) ve klon ligasyonu bağımsız klonlama (LIC)25tarafından evde beslenen hayvan-28a-HMT vektör içine. Histidin etiketi, MBP etiket ve N-terminus bir TEV proteaz bölünme sitesinde bu vektör içerir15.
	<ol>
<li>Tasarım LIC astar hedef gen LIC uyumlu 5' uzantılı amplifikasyon için: LI...

<ol>
	<li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels.">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li><li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor/calcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li><li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+ryanodine+receptors:+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals.">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li><li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+spread,+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella.">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li><li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth,+Plutella+xylostella,+from+China.">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li><li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae).">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+(L.)+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole.">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li><li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth,+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae)+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li><li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer,+Tuta+absoluta+(Lepidoptera:+Gelechiidae).">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li><li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias.">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor.">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li><li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface.">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506 (2013).</li><li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain.">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397 (2014).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1.">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li><li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor.">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2.">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li><li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+Ca2+-activated+long-range+allosteric+channel+gating+of+RyR1.">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li><li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution.">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li><li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor.">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li><li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamondback+moth+ecology+and+management:+problems,+progress,+and+prospects.">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li><li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+&amp;#34;hot+spot&amp;#34;+loop.">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &amp;#34;hot spot&amp;#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors:+Insights+into+Disease+Mutations.">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography.">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li><li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HKL-3000:+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes.">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li><li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xtriage+and+Fest:+Automatic+assessment+of+X-ray+data+and+substructure+structure+factor+estimation.">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li><li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling,+prediction+and+analysis.">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li><li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites.">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li><li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor.">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li></ol>

Bu yazıda, recombinantly express, arındırmak, kristalize ve DBM RyR nöral tüp defekti yapısını belirlemek için bu yordamı açıklar. Kristalizasyon için yüksek çözünürlük, saflık ve homojenliği ile protein elde etmek çok önemli bir gereksinimdir. Bizim iletişim kuralında, bir hexahistidine etiketi ve MBP etiketi, ikisi de daha yüksek bir kat saflık elde etmek arıtma için yararlanılabilir içerdiğinden evde beslenen hayvan-28a-HMT vektör kullanmayı seçtiniz. Ayrıca, hedef protein çözün?...

Ryanodine reseptörleri (RyRs) Permeasyon Ca2 + iyonlarının kas hücrelerindeki sarcoplasmic retikulum (SR) membranlar arasında arabuluculuk belirli iyon kanalları vardır. Bu nedenle, işlem kaplin uyarma daralmaya önemli bir rol oynuyorlar. İşlevsel haliyle, bir homo tetramer moleküler kütlesi ile olarak RyR çeviren > her alt birim ~ 5000 amino asit kalıntıları eklenmesi oluşan ile 2 MDa. Memelilerde, üç izoformlarının vardır: RyR1 - kas iskelet tipi, RyR2 kalp kası tipi ve RyR3-ubiquitously farklı dokular1' dile getirdi.
Böcekler RyR, kas ve sinir dokusu2' de gösterilen tek bir türü yoktur. Böcek RyR memeli RyR2 bir sıra kimliğini yaklaşık % 47 ile daha benzer3. Diamide böcek RyR Lepidoptera ve Coleoptera hedefleyen geliştirilmiştir ve Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) ve Syngenta (cyantraniliprole) gibi büyük şirketler tarafından pazarlanan. Nispeten son başlatılmasından bu yana, diamide böcek böcek öldürücüler en hızlı büyüyen sınıf biri haline gelmiştir. Şu anda, bu üç böcek öldürücüler yıllık satış 2009 yılından bu yana (Agranova) 2 milyar ABD Doları % 50'den fazla bir büyüme oranı ile kesişti.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu böcek öldürücüler4,5,6,7,8kullanımı, birkaç kuşak sonra böceklerde direnç gelişimi bildirdin. Direnç mutasyonlar transmembran etki alanındaki RyRs diamondback güve (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) ve domates leafminer ilgili pozisyonlarda, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) bu bölge göster Bu bölge kanal4,8,9geçişi için kritik olduğu bilinmektedir olarak diamide böcek ilacı bağlamasında dahil olabilir. Bu alanda kapsamlı bir araştırma rağmen diamide böcek öldürücüler tam moleküler mekanizmaları zor kalır. Ayrıca, direnç mutasyonları diamides ile etkileşimi doğrudan veya allosterically etkiler belirsizdir.
Daha önceki çalışmalar memeli türlerden birkaç RyR etki alanı yapısını ve yapısı tam uzunlukta memeli RyR1 ve RyR2 x-ışını kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu, sırasıyla10,11tarafından bildirdin, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Ama şimdiye kadar hiçbir yapısını böcek RyR, bizi moleküler inceliklerini reseptör işlevinin yanı sıra böcek ilacı eylem moleküler mekanizmaları ve böcek ilacı direnç gelişimi anlamak yasaklayan bildirilmiştir.
Bu makale, biz N-terminal β-trefoil etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve, yıkıcı bir haşere turpgillerden bitkileri dünya çapında22bulaşmasını gelen yapısal karakterizasyonu için genel bir iletişim kuralı mevcut. Yapı dizayn edilmiştir yayımlanan tavşan RyR1 nöral tüp defekti kristal yapıları23,24ve cryo-EM yapısal modelleri16,17,18,19, göre 20 , 21. bu böcek RyR, hangi kanal geçişi için mekanizma ortaya çıkarır ve uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım kullanarak species-specific böcek öldürücüler geliştirmesi için önemli bir şablon sağlar için bildirilen ilk yüksek çözünürlüklü yapısıdır. Yapısı aydınlatma için 'altın standart' protein yapı tayini için atomik çözünürlük yakın olarak kabul edilir x-ışını kristalografisi çalıştırmaya başladık. Kristalizasyon işlem öngörülemeyen ve emek yoğun olmakla birlikte, adım adım bu protokolü araştırmacılar hızlı, arındırmak ve böcek RyR ya da herhangi bir diğer proteinler diğer etki alanlarındaki genel olarak karakterize etmek için yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pET-28a-HMT vector</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:941px;">This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli BL21 (DE3) strain</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td>69450-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrapHP column (5 mL)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylose resin column</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:129px;">E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q Sepharose high-performance column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon concentrators (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 26/600 gel-filtration column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automated liquid handling robotic system&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:129px;">Gryphon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR4-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puck dewar loading tool</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nano drop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal incubator</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD5-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-Ray diffractor</td>
			<td style="width:164px;">Rigaku</td>
			<td style="width:129px;">FRX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR machine</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">Nexus GX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid mini-prep kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:164px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SspI restriction endonuclease</td>
			<td style="width:164px;">NEB</td>
			<td style="width:129px;">R0132S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:164px;">Novagen</td>
			<td align="right" style="width:129px;">2868713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:164px;">Scientific Chemical</td>
			<td align="right" style="width:129px;">25389940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">367931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">7365459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:164px;">Genview</td>
			<td align="right" style="width:129px;">60242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Sorvall LYNX 6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonnicator</td>
			<td style="width:164px;">Scientz</td>
			<td style="width:129px;">II-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein purification system</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">Akta Pure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;">Nikon</td>
			<td style="width:129px;">SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IzIt crystal dye</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td>HR4-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">1658005EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker Incubator</td>
			<td style="width:164px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:129px;">ZWYR-D2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Index crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:129px;">HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Structure crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProPlex crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PACT premier crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JCSG-plus crystal screen</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:129px;">MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystal structure of the n-terminal domain of ryanodine receptor from plutella xylostella

Güçlü ve verimli böcek böcek ryanodine reseptörleri (RyRs) hedefleme geliştirilmesi tarımsal haşere kontrolü alanında büyük ilgi olmuştur. , Birkaç diamide böcek haşere RyRs ticari hedefleme bugüne kadar olan 2 milyar dolarlık yıllık gelir elde. Ama eylem RyR hedefleme böcek öldürücüler, modu, anlama böcek RyR ilgili yapısal bilgi eksikliği ile sınırlıdır. Bu sırayla anlama zararlıları böcek ilacı direnç gelişimi sınırlar. Diamondback güve (DBM) da diamide böcek öldürücüler direnç göstermek için rapor yok turpgillerden bitkileri dünya çapında, yıkıcı bir zararlı olduğunu. Bu nedenle, roman böcek öldürücüler DBM RyR, özellikle geleneksel diamide bağlama Web sitesinden farklı bir bölge hedefleme hedefleme geliştirmek için pratik büyük önem taşımaktadır. Burada, yapısal olarak RyR DBM üzerinden N-terminal etki alanını tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. X-ışını kristal yapısı moleküler yedek bir çözünürlükte tarafından çözüldü 2,84 Å, hangi, bir beta-trefoil katlama motif ve bir kanat alpha sarmalının gösterir. Bu iletişim kuralı ifade, arıtma ve diğer etki alanları veya proteinler yapısal karakterizasyonu için genel olarak adapte edilebilir.

Arıtma
DBM RyR N-terminal etki hexahistidine etiketi, MBP etiket ve TEV proteaz bölünme site bir füzyon proteini olarak ifade edildi. Kristalizasyon amaç için uygun bir son derece saf protein elde etmek için beş adım arıtma strateji takip ettik. İlk başta, Füzyon proteini hücre lysate çözünür kısmını Ni-NTA sütun (HisTrap HP) tarafından saflaştırıldı. Ardından, Füzyon protein TEV proteaz bölünme için...

Watch this Scientific Journal Video about Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella at JoVE.com

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Bu makalede, protein ifade, arıtma, kristalizasyon ve yapı tayini N-terminal etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve (Plutella xylostella) üzerinden iletişim kuralları açıklar.

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Ryanodine reseptör etki alanının yapısını çözmek, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmasını, insektisit eylemini ve insektisit direnci gelişimini anlamamıza yardımcı olabilir. Bu ölçü, yakın atomik çözünürlükte protein yapısı tayini için altın standart olarak kabul edilen yapı illüstrasyonu için X-ışını kristalografisinin kullanılmasını ifade eder. Böcek ryanodin reseptör etki alanının bu yüksek çözünürlüklü yapısı kanal gating mekanizmasını ortaya koymaktadır ve yapı tabanlı ilaç tasarım yaklaşımları kullanarak türe özgü insektisitlerin gelişimi için önemli bir şablon sağlar.Potansiyel protein kristalografları biyokimya, biyofizik, bilgisayar bilimleri ve matematik te yeterli olmalıdır, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek. Polimeraz zincir reaksiyonu ile ilgi proteinine karşılık gelen DNA'yı yükselterek başlayın. Reaksiyonsonunda, reaksiyon karışımının tümünü %2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre jel çıkarma kiti ile DNA ayıklayın.Daha sonra, vektör DNA'sının 20 mikrolitresini 6 mikrolitre 10X reaksiyon tamponu ve 4 mikrolitre SspI restriksiyon enzimini 30 mikrolitre çift distile su ile karıştırarak LIC vektör DNA'sını doğrusallaştırın. Bu reaksiyon karışımını 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti ile doğrusallaştırılmış vektör DNA çıkarma, bir % 1 agarose jel üzerinde tüm reaksiyon karışımı çalıştırın.Daha sonra, standart protokollere göre doğrusallaştırılmış vektör DNA'sının 5 mikrolitresi ve PCR güçlendirilmiş insert DNA üzerinde ayrı T4 DNA polimeraz tedavileri yapın. Oda sıcaklığında 40 dakika kuluçka, ardından 75 santigrat derecede 20 dakikalık enzim ısı inaktivasyonu. Ligasyondan bağımsız klonlama reaksiyonunu, oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için T4'ün 2 mikrolitresi ile t4 tedavi edilen insert DNA'sının 2 mikrolitresini birleştirerek gerçekleştirin.BL21(DE3)E. Coli hücrelerini rekombinant plazmid ile dönüştürmek için, buz üzerindeki 50 mikrolitre yetkili hücreyi eritin ve tüpe yaklaşık 1 mikrolitre annelik plazmid ekleyin. Hücreleri ve DNA'yı karıştırmak için tüpü 2-3 kez hafifçe kaydırın ve tüpü 20 dakika boyunca tekrar buza yerleştirin.Kuluçka sonunda, 42 santigrat derecedeki hücreleri 40 saniye boyunca ısı şoku, ardından iki dakika sonra buza geri döndü. Sonra, tüp oda sıcaklığında LB orta bir mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece 45 dakika boyunca 250 RPM shaker hücreleri yerleştirin. Sallayarak kuluçka sonunda, plaka 150-200 mikrolitre bu karışımın seçim plakaları üzerine, ve 37 santigrat derece bir gecede plakaları ters.Ertesi gün, kültür 2-YT orta 100 mililitre tek bir koloni, kanamisin ile takviye, bir shaker inkübatör bir gecede 37 derece santigrat. Ertesi sabah, 2-YT orta bir litre inoculate, kanamisin ile takviye, gecede kültür 10 mililitre ile, ve OD600 okuma yaklaşık ulaşana kadar sallayarak 37 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, IPTG ile kültürü 0.4 milimolar son konsantrasyona ikna ve 30 santigrat derece beş saat boyunca hücreleri büyümek.Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj le hasat edin ve peleti 40 mililitre likis tampon konsantrasyonu başına 10 gram bakteriye yeniden askıya alın. Hücre duvarlarını %65 genlikte sonication ile bozun ve bir saniye kapalı bir saniye, sekiz dakika boyunca. Santrifüj ile hücre enkaz kaldırın.Ardından, 22 mikrometrelik bir filtre olsa da süpernatant'ı filtreleyin ve çözümü bir örnek döngüye yükleyin. Füzyon proteinini arındırmak için, örnek döngüden filtrelenmiş süpernatantı 20 ila 250 milimolar imidazol lineer gradyan ile arıtma sistemi üzerinde beş mililitrenini-nitrolotriacetic kolona enjekte edin. Cleave tütün etch virüs proteaz ile eluted hedef protein, bir-to-50 oranı, bir gecede 4 santigrat derece, ve bir amylose reçine sütunüzerinde dekolte reaksiyon karışımı arındırın, ve bir nikel-nitroriacetic sütun, etiketi ve tütün etch virüs proteaz kaldırmak için.Tuz konsantrasyonunu azaltmak için diyaliz tamponuna karşı nikel-nitrolotriacetic kolondan akan akışı diyalize verin ve elüsyon tamponunda 20 ila 500 milimolar potasyum klorür lineer bir degrade ile bir aniyon değişim sütunundaki numuneyi arındırın. Sonra, bir santrifüj konsantratörü protein konsantre. Homojenliği kontrol etmek için konsantre proteini Superdex 200 26/600 jel filtrasyon sütununa enjekte edin ve proteinin saflığını %15 SDS-PAGE ile değerlendirin.Proteini kristalizasyona hazırlamak için, saflaştırılmış protein örneğini santrifüj konsantratöründe mililitre başına 10 miligrama konsantre edin ve 80 santigrat derece depolamadan önce tampon değişimini kristalizasyon tamponuna verin. Kristalizasyon taraması yapmak için, 295 Kelvin'de birkaç kristalizasyon kitleri ve 96 kuyulu formatta otomatik sıvı işleme sistemi ile oturma damlası buhardifüzyon yöntemini kullanın. Damla ayarının sonunda, buharlaşmayı önlemek ve rezervuar tamponu içindeki protein damlasının dengelemesini sağlamak için 96 kuyulu kristalizasyon plakasını kapatın.Plakaları 18 derecede kristal bir kuluçka makinesine yerleştirin. Kristal oluşumunu ve büyümesini izlemek için plakaları ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edin. Tuz kristalleri protein kristalleri ayırt etmek için, hedef damla protein kristal boyabir mikrolitre ekleyin ve bir saat sonra mikroskop altında kristalleri gözlemlemek.Protein kristalleri mavi görünür. Kristalleri daha da optimize etmek için, pozitif kristalizasyon koşullarını ve 24 kuyulu plakalarda asılı damla buhardifüzyon yöntemini kullanın, ardından 18 santigrat derecede kristal kuluçka makinesinde kuluçka yada. Protein yapısını belirlemek için, sıvı nitrojende flaş soğutma için bir ışık mikroskobu altında bir kriyoloop kristalleri monte ve depolama ve taşıma için bir unibuck kristalleri yerleştirin.Kristalleri monte etmek ve merkeze almak için manuel merkezleme işlevini kullanarak, kristalleri şirket içi X-ışını difaktöründe ön ekrana getirin. Ardından, verileri toplamak için X-ışını kırınım yazılımını kullanın. HKL-2000 paketini kullanarak veri kümesini dizine koymak, tümleştirmek ve ölçeklendirmek için önce dedektörü seçin ve veri kümesini yükleyin.Daha sonra, kırınım lekeleri bulmak için tepe arama işlevini yürütmek. Noktaları dizine dizine ekin, doğru boşluk grubunu seçin ve en yüksek tümleştirmeyi gerçekleştirin. Ardından, veri kümesini ölçeklendirin.Hata modelini yeniden ayarlayın ve ölçeklendirin. Çıktı sca dosyasını kaydedin. Phenix yazılım paketini kullanarak yapıyı belirlemek için yeni bir proje oluşturun.İlk olarak, asimetrik birimdeki protein moleküllerinin olası kopya sayısını hesaplamak için Extriage'ı sca dosyasıyla çalıştırın. Daha sonra, moleküler değiştirme ile faz problemini çözmek için Phaser'ı çalıştırın, kırınım veri dosyasını kullanarak Phaser'ı çalıştırın, hedef protein olarak yüksek sıralı kimlik ve yapısal benzerliğe sahip şablon yapı dosyası ve çözüm bulmak için protein dizisi dosyası. Phaser'dan gelen çıktı dosyasını ve hedef proteinden gelen sıra dosyasını kullanarak ilk modeli oluşturmak için Phenix'te otomatik yapı yı gerçekleştirin.Yapıyı COOT kullanarak modifiye edilmiş deneysel elektron yoğunluğuna elle oluşturun ve yinelemeli döngülerde Phenix rafine kullanarak rafine edin. Phenix'teki doğrulama araçlarını kullanarak son modeli doğrulayın. Bu temsili deneyde, diamondback güve ryanodin reseptör proteininin son terminal etki alanının saflaştırılması, gösterildiği gibi, STS-PAGE analizi ile yaklaşık 21 kilodalton tek bir bant vermiştir.Jel filtrasyon sütunundan gelen elüsyon hacmi saflaştırılmış ryanodin reseptör son terminal etki alanının monomer olduğunu doğruladı. Kristalizasyon için, yüksek kaliteli plaka şeklinde kristallerin oluştuğu en uygun koşullar pH 7'nin 1 azı HEPESi ve 1.6 molar amonyum sülfat varlığında ydı. Gösterildiği gibi yazılımları kullanan kırınım veri setinden protein yapısının belirlenmesi, 1'den 205'e kadar kalıntıları kapsayan diamondback güve ryanodin reseptör son terminal etki alanını ortaya çıkarmıştır.Büyük bozukluğu, esnek bölgeleri veya zayıf yakınlıkları olan proteinlerkristalize etmek zordur. Bu senaryolarda, yüzey entropisi azaltma, döngü kesilme ve çapraz bağlama gibi protein mühendisliği stratejileri, daha iyi protein kristalleri elde etme olasılığını artırabilir. Yüksek çözünürlüklü protein yapılarını ortaya çıkarmanın yanı sıra, X-ışını kristalografisi de protein-pestisit etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir, hangi yapı tabanlı pestisit tasarımı ile yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...