Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

هذا البحث العمل وتلقى الدعم المالي من "المشروع المشترك مبادرة الأدوية المبتكرة" منح اتفاق نس 115188، جامعة هلسنكي برنامج الدكتوراه في الطب الحيوي المنح الدراسية (A.S.N.)، وجوسيليوس سيغريد و أسس أوريون-فارموس (E.W.V.). ونحن نتقدم بخالص الشكر أعضائنا الكونسورتيوم منصة شريحة الأنسجة بريديكت (af تيجا هالستروم وسيف نابيلا لتقديم الدعم في إعداد نظام الدوار، وتركي Riku لدعم تحليل MATLAB. وشكر سيرو يوكو هو التقاط الصور الفوتوغرافية الرقم 1. ونشكر أيضا فريق "فم ويبميكروسكوبي" لمسح الشرائح النسيجي، ودعم "مركز" تربية الحيوانات المختبرية.

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

ويعلن المؤلف لا تضارب في المصالح.

وضعت المعقدة في المختبر الورم نماذج مختلفة، بما في ذلك الثقافات 3D وأورجانويدس، أن الخص بالهندسة المعمارية ووظائفها النمطان في فيفو ورم الأنسجة29،30. ومع ذلك، ينطوي إنشاء ثقافات 3D أو أورجانويدس تفكك الأنسجة والنمو الانتقائي من نوع خلية مفردة أو الثقافة المشتركة لتحديد بعض أنواع الخلايا في بيئة اصطناعية. نتيجة لذلك، التقاط هذه النماذج غير كامل بتعقيدات التفاعلات التغاير وورم-ستروما الورم. من ناحية أخرى، أن شرائح الورم أورجانوتيبيك، الحفاظ على الأنسجة البيولوجية والهندسة المعمارية تعقيدات الورم في الموقع ، دون التلاعب واسعة النطاق. هذه القدرة لشرائح الأنسجة إلى الخلايا السرطانية النموذجي في بهم المكروية الأصلية يجعلها جذابة خاصة للدراسات الإكلينيكية. أبلغنا سابقا لسير عمل أمثل لإنشاء وتحليل الورم دقة قطع شرائح، وأظهرت أنه، بالمقارنة مع تصفية يدعم، وحدة حضانة الدورية تحسين صلاحية قصيرة الأجل مورين NSCLC شريحة الثقافات25 , 31-بيد أن زراعة على تناوب الوحدات يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب الرصد المستمر. نقدم هنا بروتوكولا لورم الأنسجة شريحة الجيل والاستخدام العملي التناوب وحدة الحضانة الثقافة لهم، فضلا عن المصاحبة لأساليب رصد قدرة الشرائح لالتقاط في الموقع الورم البيولوجيا، شرطا أساسيا قبل المخدرات اختبار استجابة.
العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول بضمان سلامة الأنسجة وصلاحية الشرائح الورم. إذا أنسجة الرئة طبيعية تحيط بالورم، يمكن إنشاء شرائح بسمك غير متناسقة فيبرتوم أو تلف الشرائح، بسبب الاختلافات في نسيج وصلابة بين عادي وورم الأنسجة. وبالتالي من المهم لإزالة أنسجة الرئة الطبيعية المحيطة بها قبل تقطيع الورم. خطوة حاسمة أخرى هي سمك تشريح، الذي ينبغي أن يكون الأمثل بعناية لكل نوع من أنواع الأنسجة. وعلاوة على ذلك، بمجرد شرائح، من الأهمية بمكان أن يتم وضع الشريحة تقريبا في منتصف الشبكة، لذا لضمان دقة متقطعة الغمس في المتوسط الثقافة والتعرض للأوكسجين. أخيرا، من المهم اتباع موقف شريحة أثناء فترة التناوب، كما يمكن المنسدلة شريحة للمتوسط؛ إذا حدث هذا، اتخاذ مزيد من الإجراءات يمكن كما هو موضح في الخطوة 3، 6 من البروتوكول.
بالإضافة إلى معالجة لضمان سلامة الأنسجة، وهناك أيضا خطوات حاسمة في تحليل المدينة لتفسير كيف تمثل الشريحة الأنسجة الأصلية. وأظهرت دراستنا السابقة أن يحمل مورين NSCLC الأورام الورم داخل وضوحاً عدم التجانس المكاني في أنشطة إشارات النمطان26. هذا يعني أن استخدام أنسجة متميزة مكانياً شرائح لعناصر التحكم أو العينات المعالجة بالعقاقير يمكن أن تؤثر على تفسير البيانات التجريبية يمكن الاعتماد عليها، ومن ثم ينبغي أن تستخدم شرائح عن كثب المجاورة كضوابط وعينات الاختبار. ونحن كذلك أظهرت أن أثناء انتشار أو التعبير فوسفوبروتين النمطان شرائح طازجة قطع جاهل 0 ح كانت مشابهة للأورام في عين المكان ، شرائح مثقف وأظهرت فوسفوبروتين النمطان تغيير التعبير، على وجه التحديد غيرت p4EBP1 وبسرك،، فضلا عن انتشار غيرت تحليلها بواسطة Ki67 المدينة. وبالمثل تم الكشف عن التعبير p4EBP1 غيرت في ح 24 NSCLC البشري وسرطان البروستاتا شريحة الثقافات (ناري et al.، التكميلية الرقم S3B-S3C، S5 و S7)26. تؤيد هذه النتائج أن المقارنة بين شرائح المثقفين مع شريحة جاهل أقرب بهم 0 ح أمر حاسم لتقييم الحفاظ على في الموقع وظائف ورم في شرائح مثقف.
وعلى الرغم من تحسين الجدوى ل شرائح أورجانوتيبيك25، هناك قيود مع نظام التداول من حيث الجوانب التقنية. وضع شرائح الأنسجة على التيتانيوم الشبكات هو أكثر تحديا مقارنة للتصفية إدراج، ووحدة حضانة الدورية قد لا تكون متوفرة. وكبديل لذلك، يمكن أن يدعم تصفية الراكدة، ولكن في هذه الحالة فقط الجانب المعرضة للهواء من الشرائح ينبغي تحليله، كمرشح الهواء التدرجات في البقاء ونقص يقاس بالتعبير HIF1α تتشكل سريعاً في الشريحة المدعومة من تصفية الثقافات (ديفيز et al.، الرقم 5، والشكل 7A 7B)25. وقد أظهرنا كذلك أن الورم شريحة الثقافات يمكن أن يحمل انتشار غيرت وأنشطة إشارات النمطان مقارنة ب الأورام الأصلي على26، ربما بسبب الردود التئام الجروح أو التكيف الأيضي الشرائح إلى السابقين فيفو الثقافة32. على الرغم من أن الخصائص المورفولوجية الإجمالي من الأورام NSCLC مورين أبقى أثناء زراعة ح 72، قد تؤثر التغييرات التكاثري المستحثة بالثقافة على درجات دقة الشرائح المزروعة. وهكذا، ينبغي أن تستخدم شرائح الأنسجة فقط للدراسات الفنية قصيرة الأجل.
جزئيا على الأقل تنقذ استخدام وحدة الدورية لاحتضان شريحة داخل صلاحية أو العلامات البيولوجية التدرجات التعبير، لا سيما خلال 24 ساعة الأولى من الثقافة. بمجرد التحقق من سلامة ووظيفة، وهذا يوفر مواد النسيج للدراسات الفنية، مثل دراسات علاج المخدرات. بالإضافة إلى المخدرات استجابة التنميط، التعبير الهدف تغيير بعد العلاج من تعاطي المخدرات يمكن الاستفادة أيضا من التحقق من صحة جسم. هذا ذات الصلة وبخاصة للكشف عن مورين [ابيتوبس] مع الماوس [مونوكلونل]، كهذه تميل إلى إعطاء خلفية المصبوغة عالية. وباﻹضافة إلى ذلك، أجسام جيدا تم التحقق من صحتها مطلوبة لتحقيق بيانات موثوقة واستنساخه في إعدادات التشخيصية والعلاجية. وهكذا، يوفر التحوير لوفرة أو الفسفرة من ذات الصلة [ابيتوبس] بعد العلاج من تعاطي المخدرات في شرائح الأنسجة سهل تطبيق عملي في التحقق من صحة جسم. ميزة رئيسية للورم شريحة الثقافات هو القدرة على نموذج المهام موزعة مكانياً، بما في ذلك أنشطة إشارات النمطان أو استجابة المخدرات في الورم أو الخلايا اللحمية، مما يجعلها نموذجا جذاباً السابقين فيفو . ومع ذلك، تدوير الشرائح أثناء زراعة، وعملية زراعة أخرى يمكن أن تلحق الضرر الأنسجة خاصة عند الحواف. أنه ولذلك تحدي على وجه التحديد تراكب الصور المدينة الملطخة بالعلامات البيولوجية لشرائح 0 ح مع مناطق نخرية الكشف عن شرائح المثقفين، مما يهدد القدرة على الضبط ربط أنشطة المكانية العلامات البيولوجية للمخدرات واستجابة. وباﻹضافة إلى ذلك، ردود نخرية الورم الجوهرية، والناجمة عن ثقافة والمخدرات التي يسببها تمييزه على الأقل مورين شرائح الأنسجة NSCLC، المساس كوانتيتيشن دقيقة من الاستجابات المكانية المخدرات. وأخيراً، يسمح استخدام الثقافات شريحة الورم باحث إلى الاختبار مركبات متعددة على الورم نفسه، دون حاجة إلى علاج الحيوانات، وبالتالي صقل والحد، والاستعاضة عن التجارب التي أجريت على الحيوانات المختبرية.
كتطبيق مستقبلا، يمكن اعتماد البروتوكول وصف للعينات السريرية الأورام الصلبة. كذلك الأنسجة تعتمد على نوع التعديلات أو التحسينات مطلوبة المحتمل، بدءاً بإجراء تعديلات على إعدادات فيبرتوم بما في ذلك سرعة شريحة سمك والاهتزاز تحسين هذه لمادة ورم أو صلابة. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف متطلبات المغذيات وعامل النمو لانسجة الورم مختلفة. على سبيل مثال، قد تم مثقف شرائح سرطان الثدي مع الأنسولين تستكمل في المتوسط13،18. نظراً إلى أن يتم الحصول على مواد محدودة الأنسجة أثناء الجراحة أو خزعة، يمكن أن يكون تحديا الأمثل للثقافات شريحة الورم المستمدة من المريض بسبب الصعوبات في الحصول على عدد كاف من العينات نسخ متماثل. وعلاوة على ذلك، إمكانية تكرار نتائج البيانات هو أيضا تحدي وضوحاً عينة مريض لعدم التجانس، لا سيما في النسبة المئوية للخلايا السرطانية مقابل المناطق تليفية أو تتسرب stromal، فضلا عن مكونات النسيج المتنخر. وأخيراً، سيتطلب تطبيق شرائح ورم في إعدادات التشخيص التحقيق في المدى للمخدرات التي يطابق الردود في اكسبلانتس شريحة من خزعات قبل العلاج بعد العلاج في فيفو الاستجابات.

أنسجة الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان الرئة، ويحمل التغايرية المظهرية والوراثية، وميناء ميكرونفيرونمينتس المعقدة1،2. التفاعل بين الخلايا السرطانية وتأثيرها المكروية المحيطة على المخدرات الحساسية والمقاومة آليات3. وهذا يبرز الحاجة إلى نماذج الإكلينيكية التي يمكن دقة نموذج تعقيدات البيولوجية ووظائف يعملون بأورام أصلية. دقة قطع شرائح المستمدة مباشرة من أورام جديدة توفر موردا فريداً، كما لديهم قدرة رئيسية لتمثيل في فيفو البيولوجيا، على الأقل لنافذة قصيرة من الزمن، بما في ذلك تعمل موزعة مكانياً في ورم فردية. مستأصل الأورام السريرية هي واحدة من العينات الشخصية القليلة التي يمكن الحصول عليها من مريض سرطان، واستخدام التشخيص تستحق التمحيص.
معلقة تاريخ أورجانوتيبيك الثقافات يعود تاريخها إلى القرنال 19 في وقت مبكر، عندما كانت الأورام داخل الجمجمة البشرية قطع اليد إلى قطع الأنسجة ومثقف باستخدام ما يسمى بأسلوب الإسقاط. أجزاء الأنسجة تم إرفاقه ساترة ويسمح لتراجع في البلازما البشرية هيبارينيزيد، مقلوب بعد ذلك كوفيرسليبس، ومختومة ومثقف لعدة أسابيع4. قطع الورم القطع منذ ذلك الوقت مثقف استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الأخرى، كما هو الحال في البلازما جلطات5، في وسائل الإعلام السائل6، أو على 0.45 ميكرومتر المسامية حجم مرشحات6يدوياً. استخدم مصطلح "أورجانوتيبيك" لأول مرة في عام 1954، في دراسة عن التمايز شبكية العين الجنين الفرخ7. وأعقب هذه الدراسات التي تستخدم explants أنسجة الرئة والقلب المستمدة من الأجنة الفرخ8، و explants الدماغ من الفئران الكبار9.
مختلف أساليب تشريح كانت المروحيات الموصوفة، هي دليل10،11، كرومديك الأنسجة تقطيع12،13و، فيبراتوميس11،،من1415 16. يولد تقطيع اللحم والأنسجة كرومديك الأنسجة أسطواني النوى، والتي هي شرائح ثم إلى شرائح دائرية الأنسجة باستخدام مبضع. من ناحية أخرى، يستخدم فيبرتوم، مبضع بليد تهتز. وفي دراسة عن شرائح الكبد، تبين أن يولد فيبرتوم إيكا شرائح استنساخه ويتفق أكثر مقارنة مع تقطيع كرومديك15. استخدمت سمك شريحة تتراوح ما بين 250 إلى 500 ميكرومتر، والدراسات تقرير الحفاظ على استمرارية والخصائص المورفولوجية بل حتى 16 يوما14،10،،من1718. ومع ذلك، أورام التشكيلات الجانبية الأيضية المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الاحتياجات من المغذيات، والمعلمات مثل تكوين مصفوفة وتصلب الأنسجة يمكن أن تؤثر في التهوية وتدفق المواد الغذائية. ولذلك فمن المرجح أن كل نوع من أنواع الأنسجة يتطلب الاستغلال الأمثل للظروف تشريح والثقافة.
وقد استخدمت أساليب زراعة مختلفة لدعم الثقافات شريحة: أنا) ثقافة الطور البيني ثابتة، وتسمى أيضا الثقافة الدعم الراكدة، التي توضع الشرائح فوق إدراج غشاء شبه مسامية منغمسين في الأجلين المتوسط والثقافة. في هذا الصدد، يتعرض أعلى الشرائح في الهواء، في حين تستكمل الجزء السفلي مع المواد الغذائية عن طريق ال14،إدراج مسامية19؛ ثانيا) الأسلوب مجرفة، وضعت أصلاً لأجهزة الثقافة كله أو شرائح الأنسجة الجنينية. في هذا الصدد، شرائح توضع على رأس ورقة القطن أو مرشح يدعمه شبكة معدنية، وهي غارقة في عامل التصفية على المديين المتوسط والثقافة. للحفاظ الأنسجة الرطبة، يتم إضافة طبقة رقيقة من المتوسطة أعلى الشرائح20،،من2122. وتسمى هذه الأولين حتى الطور البيني الهواء السائل الثقافات؛ ثالثا) الاسطوانة أنبوب الثقافات، التي توضع الشرائح داخل الجانب المسطح من أنبوب البلاستيك تحتوي على المتوسط، ويضمن التناوب أنبوب بطيء هو مغطاة المتوسطة خلال الجزء الأول من دورة الأنسجة، أو الرغوة أثناء الثاني23؛ رابعا) تناوب الوحدات الحضانة، التي تتعرض شرائح بشكل متقطع للمتوسطة مع المواد المغذية والتهوية. مختلفة من أنابيب الاسطوانة، وفي هذه الطريقة توضع الشرائح على رأس شبكات التيتانيوم مسامية توضع في لوحات 6-جيدا مع الثقافة المتوسطة24.
شرائح الأنسجة المستمدة من الأورام الصلبة مستأصل منطقياً هذا نموذج جاذبية فيفو السابقين لاختبار الاستجابة للمعالجة العوامل المضادة للسرطان، كما أنها تسمح بتقييم الجدوى ويستهدف نشاط المسار، وملامح الجزيئية وجود ورم محدد حضور به الأم وورم المكروية. ومع ذلك، تقييم ما إذا كانت الردود المخدرات تقاس في شرائح الورم التنبؤية للردود في الموقع ، من المهم تقييم ما شرائح الأنسجة مدى الحفاظ على الوظائف البيولوجية الخاصة بالورم مثل انتشار الخلايا، تمايز الخلايا الخاصة بالتشريح المرضى أو أنشطة إشارات النمطان. أثر الإجهاد الميكانيكي وأثارت أثناء إعداد شريحة أو التعامل مع شريحة أدابتيونس الناجمة عن الثقافة في كل من الجودة والوظائف البيولوجية لشرائح الأنسجة هي المسائل الأساسية، مشددة مرتبطة بالقدرة على تنفيذ المستمدة من ورم شرائح للتشخيص الوظيفي.
لدينا مشروع اتحاد تموله IMI بريديكت (http://www.predect.eu) يحدد منهجياً العنوان هذه الأسئلة الأساسية، عن طريق دراسة explants شريحة من مجموعة متنوعة من المصادر. باستخدام شرائح المستمدة من نماذج سرطان الثدي والبروستاتا والرئة، استخدمت هذا الجهد المشترك read-outs النوعي، فضلا عن توضع الكمية وقراءات ويوزين (H & E)-على أساس إثبات شرط للأكسجين في الغلاف الجوي وتصفية راكدة وتؤيد للحفاظ على استمرارية شرائح مثقف حتى ح 72. وعلاوة على ذلك، كشفت التحاليل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) على شرائح مثقف التدرجات البقاء داخل شريحة، يتضح نخر التدرجات في شرائح المستمدة من مورين غير صغيرة خلية سرطان الرئة (NSCLC)، مستقبلات الإستروجين (ER)، HIF1α و γH2AX التدرجات في شرائح سرطان الثدي، أو تدرجات التعبير مستقبلات (ع) الاندروجين في سرطان البروستات شرائح25. من المثير للاهتمام، أنقذت شريحة داخل صلاحية التدرجات في الثقافات ح 24 من NSCLC مورين زراعة في وحدة الدورية لحضانة، ولدينا دراسة أجريت مؤخرا أظهرت أن بقاء مددت إلى 72 ح26. وظل لا سيما الجانب العلوي أصلح26، يؤيد أن تحاليل المخدرات ردا على شرائح تنفذ أفضل على هذا الجانب من الأنسجة.
حتى لو أنه يبقى سؤال كيف الآن شرائح الأنسجة يمكن إيجاز مهام ورم في الموقع ، وقد استخدمت على نطاق واسع لاختبار ردود على وكلاء المضادة للسرطان، بما في ذلك الأدوية المستهدفة، والأجسام المضادة ووكلاء العلاج الكيميائي 10،،من1113،14،،من1827. نحن أظهرت مؤخرا أن مورين NSCLC شرائح تظهر التغيرات الدينامية في الانتشار وشرائح النمطان أنشطة إشارات بعد زراعة عند مقارنتها بقطع طازجة 0 ح26. وهذا يشير إلى أن من المهم للتحقيق في ما إذا كانت الوظائف البيولوجية المستهدفة في الموقع يتم الاحتفاظ مناسب أثناء زراعة، قبل دراسات اضطراب. وعلى الرغم من هذه النتائج، واظهرنا أن شرائح الورم يمكن النموذج المكاني استجابة للعلاجات المستهدفة، خضم المخدرات تظل العلاجات موجزة (24 ساعة)، والتي بدأت في بداية استزراع26. البروتوكول التالي يصف مهمة التحقق من الجوانب ذات الصلة بإنشاء وتحليل الثقافات شريحة الورم، قبل تطبيقها في اختبار العقاقير الدوائية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

أورجانوتيبيك الأنسجة الأولية explant الثقافات، التي تشمل دقة قطع شرائح، تمثل بنية ثلاثية الأبعاد (3-D) الأنسجة، فضلا عن تفاعلات متعددة الخلايا من الأنسجة الأصلية. شرائح الأنسجة مباشرة قطع من الأورام مستأصل حديثا الحفاظ على الجوانب المكانية لتغاير إينتراتومور، مما يجعلها مفيدة الأمهات البديلات في فيفو البيولوجيا. دقيق الأمثل لظروف إعداد وزراعة شريحة الأنسجة الأساسية لإمكانات التشخيص التنبؤي للورم شريحة اكسبلانتس. وفي هذا الصدد، نماذج مورين قيمة، كما توفر هذه تدفق المواد الورم لإجراء تجارب استنساخه وتكرار متسقة. ويصف هذا البروتوكول استزراع شرائح الأنسجة المستمدة من ورم الرئة مورين استخدام وحدة حضانة الدورية، وهو نظام يمكن التعرض المتقطع من الأنسجة بالأكسجين والمواد الغذائية. أعمالنا السابقة أظهرت أن استخدام وحدات الحضانة بالتناوب ويحسن إمكانية مقارنة بالأساليب الأخرى الثقافة، لا سيما العائمة شرائح الأنسجة ويدعم تصفية الراكدة. هنا، نحن كذلك تظهر أن شريحة سمك يؤثر على استمرارية من شرائح المثقفين، مما يوحي بأن الاستغلال الأمثل لشريحة سمك وينبغي أن يتم لأنواع مختلفة من الأنسجة. وضوحاً ايث في وظائف النمطان ذات الصلة، مثل الإشارات الأنشطة، تسلل الخلايا اللحمية أو التعبير عن علامات التمايز، يتطلب تقييم شرائح النسيج المجاور للتعبير عن علامات تم تعديلها من قبل العلاج من تعاطي المخدرات أو زراعة نفسها. باختصار، هذا البروتوكول يصف توليد شرائح ورم الرئة مورين وثقافتهم في وحدة حضانة الدورية ويوضح كيف يجب أن يتم تحليل الشرائح بشكل منتظم للتعبير عن علامات النسيج غير المتجانس، كشرط مسبق قبل دراسات استجابة المخدرات.

ويمثل الشكل 1 سير العمل لتوليد وزراعة وتحليل الأنسجة دقة قطع شرائح المستمدة من موريني NSCLC الأورام. لهذه التظاهرة، علينا الاستفادة من الأورام من طراز ماوس المهندسة وراثيا (جيم) إيواء التنشيط الشرطي من كراسG12D جنبا إلى جنب مع فقدان Lkb1 (يعرف أيضا باسم سيرين/ثريونين كيناز 11)، يشار إلى كوالا لمبور. تم إجراء بدء ورم الرئة وتربية الماوس كما هو موضح في26،28. يوضح الشكل 2 ألف أثر الأنسجة شريحة سمك على بقاء شرائح مثقف عن 24 ساعة باستخدام وحدة الدورية لحضانة. وتبين النتائج أن 160 ميكرون شرائح رقيقة تحتوي على مناطق نخرية كبيرة عبر الشريحة. وباﻹضافة إلى ذلك، 250 ميكرون شرائح رقيقة إظهار نخر التدرج عبر الشريحة بالمقارنة مع 200 ميكرومتر شرائح رقيقة. ومن المرجح أن استمرارية عموما الفقراء ميكرومتر 160 أنحف الناجم عن التعامل مع التقنية أثناء تحديد المواقع الشرائح على رأس الشبكات، وهذه هي هشة وتميل إلى حليقة. من ناحية أخرى، التي في NSCLC مورين explants يدل عند الشرائح تكون سميكة جداً، يمكن أن تصبح عرضه للنقص في الأوكسجين أو نشر المواد الغذائية عبر الشرائح، كالموت نخرية التدرج25. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن شرائح بسمك متغير يمكن أن تتولد من ورم واحد، على الرغم من استخدام إعدادات فيبرتوم متطابقة. ولذلك يوصي بتحليل replicates العديد من عينات مختلفة من الورم. الأهم من ذلك، يتطلب كل نوع من أنواع الأنسجة شريحة سمك الأمثل تحقيق أقصى قدر من الجدارة، كما يمكن أن تؤثر على نسيج الأنسجة وصلابة الأوكسجين وتدفق المواد الغذائية. الشكل 2 -2C يوضح الكمية المدينة تحليلات للتعبير NKX2-1، علامة على الرئة المتمايزة جيدا غدية (AC) في عينات المزروعة تصل إلى 72 ساعة، ومطابقة شرائح 0 ح. وتبين النتائج أن التعبير NKX2-1 لم يغير كثيرا في شرائح مثقف بالمقارنة مع شرائح جاهل ح 0، مما يوحي بأن عملية زراعة لا يؤثر علنا حالة التمايز AC ورم الأنسجة. يوضح الشكل 2D الأداة المساعدة من ورم الأنسجة شرائح لتقييم فعالية العقاقير المستهدفة. نحن مؤخرا أظهرت أن كراس متحولة مورين ACs معرض عالية التعبير عن فوسفوريلاتيد ERK1/2 (وسم زيادة النشاط المسار MAPK) عند مقارنة بالأورام أدينوسكواموس (الرابطة)، بينما التعبير عن 4EBP1 فوسفوريلاتيد (وسم النشاط mTOR ) يعبر عن المثل بأورام التيار المتردد والرابطة. لاختبار ما إذا كان يمكن توجيه هذه المسارات فعلياً على شرائح الأنسجة، شرائح الأنسجة AC كوالا لمبور تعامل مع [دمس] أو معاير كميات من المركبات، أي 0.1 – 1 ميكرومتر داكتوليسيب لاستهداف المسار mTOR أو 0.05 – 0.5 ميكرومتر سيلوميتينيب لاستهداف MAPK المسار. وتبين النتائج أن داكتوليسيب 1 ميكرومتر أو 0.5 ميكرومتر من سيلوميتينيب فعالة في تثبيط الفسفرة 4EBP1 أو ERK1/2، على التوالي. وعلاوة على ذلك، يشير الجرعة تعتمد على تثبيط فوسفوبروتين المستهدفة أن شرائح الأنسجة يمكن أن تستخدم أيضا للتحقق من صحة أجسام الفسفرة على حدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> رقم 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل لإنشاء وتحليل مورين explants شريحة المستمدة من ورم NSCLC. تصف في جمع وإعداد الرئتين الورم الحاملة لتقطيع التخطيطي (A). يتم حصاد الفصوص الرئة من ماوس وهو تشريح أنسجة الورم بعيداً عن أنسجة طبيعية. السهم الأسود والنجمة تشير إلى حوالي 4 مم والأورام 1 مم، على التوالي. يشير رأس السهم الأبيض إلى أنسجة الرئة لصقها على السطح لصاحب العينة. يشير السهم الأحمر في قطعة إضافية من أنسجة الرئة طبيعية دعم الاحتفاظ بالورم في وضع رأسي. (ب) فيبرتوم تقطيع وجمع شرائح الأنسجة. السهم الأبيض يشير إلى اتجاه تشريح. مجموعة من شرائح متتابعة في لوحة 24-البئر الذي يحتوي على البارد حبس + P/s. الشرائح يمكن أن تكون أما مثقف لنقاط زمنية مختلفة (هنا، ح 24 – 72) لتقييم تعبير العلامة الخاصة باستئصال ورم من خلال زراعة (الصف العلوي)، أو يمكن استخدامها لإجراء العلاج بالعقاقير. C: التحكم بالسيارة، t: العلاج من تعاطي المخدرات. (ج) وضع شريحة الأنسجة لزراعة استخدام وحدات حضانة الدورية. إمالة لوحة 6-جيدا، حتى أن بعض المتوسطة ويغطي الجزء العلوي من الشبكة ومكان الشريحة الأنسجة في وسط الشبكة على أعلى من المتوسط، وانتشار شريحة استخدام الملقط. التأكد من وجود لوحات 6-جيدا وزن متوازنة لدورة تناوب سلس. X: يشير إلى غير صحيحة، و <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: يشير إلى الموضع الصحيح للشريحة. (د) صورة فوتوغرافية لكتلة FFPE شريحة الورم. يشير السهم الأسود في شريحة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة الهيماتوكسيلين. (ﻫ) تخطيطات عرض تقطيع ترتيب الشرائح في كتل فب؛ يمكن معالجة هذه المقاطع لتقييم صلاحية الأنسجة والتعبير العلامات البيولوجية الخاصة بالورم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> رقم 2: تقييم التعبير علامة السلامة وهيستوتيبي على حدة، والعلاج من تعاطي المخدرات المستهدفة على شرائح الأنسجة NSCLC. صور الممثل (A) ح & ه AC NSCLC شرائح من سمك المشار إليه مثقف ل 24 h. 200 ميكرومتر شرائح رقيقة من الحفاظ على استمرارية أفضل بالمقارنة مع 160 ميكرون أو 250 ميكرون شرائح رقيقة. أزرق داكن يمثل ح & ه الملون الأنسجة قابلة للاستمرار، والوردي يشير إلى مناطق نخرية بسيودوكولوريد. الضوء الأزرق يشير إلى المناطق التي استبعدت من التحليل، أما بسبب نوعية الأنسجة الفقيرة أو وجود ألياف ستروما. T1 و T2 تمثل replicates البيولوجية المستمدة من أورام مختلفة اثنين. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) ممثل المدينة صور التعبير NKX2-1 في شرائح AC مثقف للنقاط الزمنية المشار إليها. يشير السهم إلى منطقة سيظهر في أعلى التكبير. وتبين النتائج أن لا يتم تبديل تعبير NKX2-1 في شرائح مثقف مقارنة بشرائح 0 ح. شريط المقياس = 500 ميكرومتر و 50 ميكرون لتكبير المنخفضة والعالية، على التوالي. (ج) التحديد الكمي للبيانات المبينة في الفقرة (ب). (د) ممثل المدينة صور 4EBP1 فوسفوريلاتيد أو التعبير pERK1/2 في ح 0 الشرائح، أو الشرائح تعامل مع [دمس] أو معاير كميات من داكتوليسيب (داكت، الصف العلوي) أو فوسفوريلاتيد pERK1/2 التعبير في ح 0 شريحة أو شرائح تعامل مع [دمس] أو سيلوميتينيب (sel، الصف السفلي). مربعات سوداء مربعة تشير إلى المجالات التي تظهر في أعلى التكبير. مقياس بار = 1 مم أو 50 ميكرومتر للتكبير عالية أو منخفضة، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

نحن نقدم طريقة لتوليد وزراعة والتحليل المنهجي لشرائح أورجانوتيبيك المستمدة من أورام الرئة موريني. ونحن أيضا وصف كيفية تحسين لسمك الشريحة، وكيفية تحديد تركيزات العقاقير لعلاج الورم شرائح.

إنشاء وتحليل لشريحة الورم Explants كشرط مسبق للاختبار التشخيصي

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث قبل الإكلينيكية ، حيث قد تخدم دراسات الاستجابة للأدوية في الخلايا الجرّة للورم أغراضًا تشخيصية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يمكن لشريحة explants نافذة قصيرة من الزمن نموذج البيولوجيا المعقدة للأنسجة الأصلية بما في ذلك وظائف موزعة مكانيا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في استخدام شرائح من أورام الرئة مورين، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنواع الأنسجة الأخرى بما في ذلك الأنسجة البشرية.للبدء، وإعداد هزاز وتنفيذ VibraCheck وفقا للتعليمات الواردة في الدليل. ثم ملء كل بئر من لوحة 24-جيدا مع ملليلتر واحد من حل الملح المتوازن هانك تكملها البنسلين وstreptomycin والحفاظ على لوحة على الجليد. إدراج الإبر 25 قياس في جميع الكفوف الأربعة من الماوس القتل الرحيم وضعت على غطاء الستايروفوم بحيث يتعرض الصدر وتمدد الحيوان.رش 70٪ الكحول على سطح الجلد المكشوف. استخدم المقص الموضوع في موضع الزاوية لقطع الجلد من البطن نحو الصدر وإلى منطقة الرقبة. تمدد الجلد على كلا الجانبين باستخدام ملقط وأدخل إبر قياس 25.قطع فتح منطقة البطن. ثم قطع فتح القفص الصدري والحجاب الحاجز لفضح الرئة والقلب. كشف القصبة الهوائية عن طريق قطع بعيدا الأنسجة المحيطة بها.تشريح الرئتين، جنبا إلى جنب مع القلب. ضع الأنسجة في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من الجليد البارد HBSS مكمّل مع Pen-Strep وضع على الجليد والمضي قدما إلى الخطوة التالية في أسرع وقت ممكن. الآن نقل الرئتين الحاملة للورم إلى لوحة زراعة الأنسجة 10 سنتيمترات.استخدام مقص معقمة والملقط لفصل فصوص الرئة وتحديد فصوص مع الأورام على السطح لشرائح. ضع فص الرئة مع نسيج الورم على قطعة من ورقة التصفية لتجنب الانزلاق وقطع جزء من الرئة العادية أو نسيج الورم إضافية التي تحيط بالورم باستخدام مشرط عقيم لتوليد سطح قطعة الأنسجة المسطحة. تراجع الجانب المسطح في قطرة من مادة السيانواكريلات لاصقة وجبله على حامل العينة هزاز بحيث يواجه الورم شفرة في وضع مستقيم، والسماح لها الجافة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.ضع حامل العينة الاهتزازية في علبة العازلة المعدنية. املأ الصينية بـ HBSS الباردة المكملة بالقلم العقدي حتى تغمر الأنسجة في المخزن المؤقت. غطي صينية العازلة بغطاء Plexiglas الذي يتم توفيره مع الأداة ووضع الدرج في حمام جليدي أبيض وإضافة الثلج للحفاظ على برودة الأنسجة أثناء التقطيع.إرفاق حمام الجليد الأبيض إلى هزاز. ثم حدد إعدادات التقطيع المناسبة وابدأ في التقطيع. جلب شفرة هزاز إلى موقف تشريح وتعيين نافذة تشريح.استخدام ملقط العقيمة لجمع شرائح في لوحة 24-well مليئة بميليلتر واحد من HBSS تكملها القلم-سترب في بئر والحفاظ على الجليد. مع الحفاظ على تتبع من أجل تشريح، علامة كل بئر من لوحة 24-جيدا وفقا للخطة التجريبية. جمع شريحة الأنسجة المجاورة لشرائح مثقف كساعة صفر أو مرجع غير مثقف.جمع ما لا يقل عن ثلاث شرائح مرجعية لتمثيل أعلى، مركز وأسفل الأنسجة. وبمجرد الانتهاء من تشريح، والاستمرار في تحديد وتجهيز. بعد ذلك، إعداد لوحة ستة بئر تحتوي على 2.5 ملليلتر من الثقافة المتوسطة في البئر عن طريق وضع شبكات التيتانيوم في ذلك.تأكد من عدم تشكيل فقاعات الهواء بين شبكة التيتانيوم والمتوسطة. لتحميل شريحة على الشبكة الحفاظ على لوحة ستة جيدا في وضع الزاوية بحيث يغطي جزء من المتوسطة الشبكة. ثم ضع الشريحة في الوسط على الشبكة واستخدم ملقط لنشرها.بعد وضع الشرائح، قم بتحميل لوحات الآبار الستة على وحدة الحضانة الدورية الموضوعة داخل حاضنة مرطبة يتم صيانتها عند 37 درجة مئوية مع 95٪ 02 و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بدء دورة التناوب. للزراعة على المدى الطويل تجديد المتوسطة الثقافة كل يوم باستخدام ملقط العقيمة لرفع الشبكة التي تحتوي على شرائح الأنسجة ووضعها في بئر فارغة من لوحة ستة جيدا.استبدال 70٪ من المتوسطة مع ثقافة جديدة المتوسطة ووضع الشبكة مرة أخرى في. متابعة دورة التدوير كما كان سابقاً. لعلاج المخدرات على شرائح الورم إضافة 2.5 ملليلتر من وسائل الإعلام مع المخدرات المخفف أو السيطرة على السيارة في لوحة ستة جيدا.ضع شبكات التيتانيوم في الآبار ثم ضع الشرائح على الشبكات كما كان عليه في السابق. بعد إجراء العلاجات لمدة 24 ساعة، استمر في التثبيت والمعالجة. لبدء تحديد الشريحة المطلوبة نقل بعناية باستخدام ملقط في لوحة 10 سنتيمترات تحتوي على ورقة مرشح غارقة مليئة برنامج تلفزيوني ملليلتر 2-3 والسماح لها تطفو.ثم ارفع ورق التصفية مع زوج من ملقط وضعه في كاسيت هستو. نقل ورقة عامل التصفية إلى كاسيت هستو. إضافة قطرة من الهماوكسيلين المخفف على رأس شريحة الأنسجة للاحتفال موقف شريحة للخطوات اللاحقة.أغلق الكاسيت، ثم قم بنقله إلى 4٪ حل buffered buffered 4٪ وترك بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد غسل ومعالجة الكاسيت كما هو موضح في البروتوكول، افتح كاسيت الهستو واستخدم مشرطًا لرفع الشريحة الثابتة بعناية من ورق التصفية. تجاهل ورقة التصفية ونقل شريحة إلى قالب يحتوي على البارافين السائل.استخدام الوزن المسطح للضغط على الأنسجة ضد الجزء السفلي من القالب تضمين لضمان حتى قسم. ضع الجزء السفلي من كاسيت histo على رأس القالب. إضافة البارافين السائل على أعلى منه.ودع القالب يبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك فصل العفن المبرد من كتلة البارافين. استخدام microtome لإعداد أربعة ميكرومتر أجزاء رقيقة من كتل شريحة الأنسجة FFPE.تقليم بعيدا عن فائض من البارافين المحيطة الأنسجة. للحصول على أقسام حتى في جميع أنحاء الأنسجة ضبط زاوية كتلة بحيث سطح كتلة هو اتجاه أفقيا فيما يتعلق شفرة. باستخدام فرشاة رقيقة جمع أقسام الأنسجة المتتابعة من شريحة الأنسجة البارافين جزءا من بدءا من الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية.مواصلة جمع أقسام من طبقات الأنسجة أعمق إلى الوسط، تليها الجزء السفلي من الشرائح الزجاجية. يتم تجميع المقاطع من طبقات مختلفة من كل شريحة نسيج إلى شرائح الكائن لتمكين التقاط التدرجات التي تسببها الثقافة المحتملة في قابلية البقاء أو ترحيل الخلايا أو التعبير العلامات الحيوية. بعد جمع الأقسام مواصلة تجهيزها ومزيد من التحليل على النحو المبين في البروتوكول.يمكن أن يؤثر سمك شريحة الأنسجة على صلاحية الشرائح المستزرعة. في هذه الحالة، تظهر شرائح سميكة 250 ميكرومتر زيادة التدرجات النخر بالمقارنة مع شرائح سميكة 200 ميكرومتر بسبب شرائح أكثر سمكا تصبح عرضة لنقص في الأكسجين أو نشر المغذيات عبر الشرائح. ومع ذلك، تحتوي شرائح رقيقة 160 ميكرومتر على مناطق نخرية كبيرة ربما يكون سببها المعالجة التقنية أثناء تحديد المواقع من الشرائح لأن هذه هي هشة وتميل إلى حليقة.تحليل NKX2-1، علامة على سرطان الرئة المتمايزة جيدا، ويبين أن التعبير لا يتغير بشكل كبير في شرائح مثقف بالمقارنة مع شرائح صفر ساعة غير ثرثرة. كما أكد التحليل الكمي للتعبير NKX2-1 أن التعبير لم يتغير بشكل كبير في الشرائح المستزرعة مقابل الشرائح غير المُزَوَّجة، مما يشير إلى أن عملية الزراعة لا تؤثر بشكل واضح على حالة التمايز في أنسجة الغدة السرطانية. لاختبار ما إذا كان يمكن استخدام شرائح أنسجة الورم لتقييم فعالية الأدوية المستهدفة ، تم علاجها مع DMSO أو كميات من المركبات.عندما تعامل مع dactolisib واحد من الميكرومولار الذي يستهدف مسالك mTOR تم تثبيط 4EBP1. 0.5 سيلوميتينيب ميكرومولار الذي يستهدف مسار كيناز MAP كان فعالاً في تثبيط فسفور ERK1/2. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العمل مع وتحليل شرائح قطع طازجة من أنسجة الورم الثمينة.ساهم لدينا ما بعد الدكتوراه السابقة، كاتيا ناري، بشكل كبير في تأسيس هذه الطريقة بالتعاون مع الزملاء في منصة شريحة الأنسجة IMI Predect Consortium.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

باستخدام الماوس BLT إنساني وساق الموديل خلية مقرها جين ورم العلاج

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

تحليل 18"فدج التصوير" PET/CT كأداة لدراسة بكتريا السل العدوى والعلاج في الإنسان عدم الرئيسات

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...