Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
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这项研究工作得到了《创新药物倡议联合承诺赠款协议 n 115188 》、赫尔辛基大学生物医学奖学金博士方案和 sigrid juselius 和猎户座基金会 (e. w. v.)。我们衷心感谢我们的 preed 组织切片平台联盟成员 (taija af hällström 和 siv knaappila 在建立旋转系统方面提供的支持, 以及在 matlab 分析方面提供的支持。感谢 jouko siiro 拍摄了图1的照片。我们感谢 fimm webmicroscope 团队扫描组织学幻灯片, 并感谢实验动物中心的畜牧业支持。

本研究中描述的所有老鼠实验都是按照芬兰国家动物实验委员会的指导方针进行的, 并得到了赫尔辛基大学实验动物委员会和省的批准芬兰南部办事处 (许可证号 ESAVI/9752/04.10.07/2015)。
1. 切片前的准备工作
<ol><li>保持以下材料准备好: 振动样品架, 振动体缓冲盘, 10 厘米培养板, 24 孔板, 10 毫升移液器, 移液器, 垃圾袋, 70% etoh 在一个50毫升管消毒仪器, 和组织胶。</li>
	<li>准备振动: 用 70% etoh 擦拭刀片支架, 连接新刀片, 并根据手册 (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) 中提供的说明执行振动检查。 注意: 执行振动检查步骤非常重要, 因为它最大限度地减少了刀片的垂直偏转, 并确保了高质量的切片。</li>
	<li>用1毫升的 hanks 平衡盐溶液 (hbss) 填充24孔板的每口井, 辅以 100 uml 青霉素和100μgml 链霉素 (hbss + psp);把盘子放在冰上。</li>
	<li>制备 f12 培养基, 辅以 100 u/ml 青霉素、100μgml 链霉素、2 mm 谷氨酰胺、22 mm 葡萄糖和10% 胎牛血清 (fbs)。 注: 肿瘤切片培养基和生长因子补充剂可能因肿瘤组织的不同而不同。</li>
	<li>准备所需数量的 f12 培养基进行药物治疗, 使用步骤1.4 中描述的相同成分, 但省略 fbs。 注: 由于血清中的生长因子可能会影响培养切片中的致癌信号, 因此建议使用无血清培养基对肿瘤切片进行短期药物摄动研究。如果对长期切片培养物进行分析, 重要的是首先评估无血清培养基对未经处理的切片培养物中组织活力和肿瘤特异性标记表达的影响。</li>
</ol>2. 收集带有肿瘤的肺
<ol><li>当发生呼吸困难和体重减轻的症状时, 用颈椎脱位对携带肿瘤的小鼠进行安乐死。 注: 已知二氧化碳介导的安乐死会诱发肺部缺氧的情况, 这可能会通过引起缺氧反应对切片的生存能力或致癌活动产生影响。</li>
	<li>将安乐死鼠标拉伸到泡沫塑料盖上, 在所有四个爪子中插入 30 g 针, 使胸部暴露在外。</li>
	<li>切开从腹部向胸部的皮肤, 并由颈部区域的皮肤。切开肋骨笼, 然后隔膜露出肺和心脏。将剪刀保持角度位置, 以避免组织损伤。</li>
	<li>将含肿瘤的肺与心脏一起解剖, 放入含有30毫升冰凉 hbss + psp 的50毫升管中;保持试管冰凉, 尽快进入下一步。 注: 肺肿瘤处理的延误可能会改变致癌功能, 例如信号通路活动。</li>
</ol>3. 精确切割的肺肿瘤切片的产生
<ol><li>将 hbss + p1 中的肿瘤肺转移到保持在层状罩内的10厘米组织培养板中。使用无菌剪刀和钳子分离肺裂片, 并选择表面有肿瘤的裂片进行切片。 注: 肿瘤和 gt;3 毫米大小适合切片。由于大肿瘤周围的正常肺组织由于组织刚度的差异而破坏切片, 因此应将正在进行切片的肿瘤组织与正常组织分离, 从而使清除的肿瘤区域面对振动细胞刀片。</li>
	<li>通过用无菌手术刀将肿瘤周围的部分正常肺组织切割掉, 并将平滑块浸入一滴氰基丙烯酸酯粘合剂中, 生成扁平的组织片表面。将这一侧安装到振动体的标本支架上, 使肿瘤以直立的位置面对刀片。让胶水干燥2-3分钟。 注: 粘附在标本支架上的正常肺组织不会干扰肿瘤组织切片, 并且在到达正常组织之前停止切片。肿瘤组织有时弯曲, 由于正常的肺组织粘在标本持有人的海绵状纹理, 损害其直立的位置。如果发生这种情况, 将一块额外的正常肺支撑组织粘在预先安装的正常肺组织旁边, 以保持肿瘤直立的位置 (图 1a iii)。</li>
	<li>将样品夹置放在金属缓冲盘中, 然后用冷 hbss + pss 填充, 直到组织浸入缓冲液中。将金属缓冲盘放在白色的冰浴上, 加入冰, 以便在切片时保持组织冷却。</li>
	<li>将白色的冰浴连接到振动体上。选择合适的切片设置: 振幅范围在2.5-2.8 之间, 切片速度在0.10-0.14 毫秒之间, 切割厚度在160-250 微米之间。 注: 切片设置需要根据组织的硬度进行调整。硬组织比柔软的组织更容易切片, 而较软的组织需要较低的速度 (0.1–0.12 ms) 和更高的振幅 (2.6-2.8) 切片。4-5 毫米大肿瘤通常提供15-20 片200μm 的厚度。对于短期培养, 小鼠肿瘤可以在半无菌条件下在层流罩外切片。然而, 临床肿瘤应始终切片在二级生物安全层流罩内, 以避免暴露在人体组织中可能的传染因子。</li>
	<li>使用无菌钳, 将片在 hbss 1 毫升的不同井中收集, 在冰上举行的24井板的不同井中, 密切跟踪切片的顺序。根据实验计划标记24井板的每一口井。例如, 将24孔板的顺序井标记为培养时间点或0小时, 车辆控制 (c)、药物处理 (t) (图 1b ii)。 注: 收集切片时不要干扰或拉肿瘤组织, 因为这会改变肿瘤相对于刀片角度的方向, 导致随后切片的厚度不一致。</li>
	<li>收集所有切片后, 将其转移到钛网格 (每个栅格2-3 片), 放置在6孔板中, 每个井含有2.5 毫升培养基。确保钛栅格和介质之间不形成气泡。<ol>
<li>要将切片加载到网格上, 请将6孔板保持在角度位置, 以便介质的一部分覆盖网格, 并将切片放置在网格上的介质中;使用钳子来传播切片, 如果它卷曲。将6井板加载到放置在加湿孵化器内的旋转孵化器上, 该孵化器的空气为 95%, co 为 5%, 并启动旋转循环 (图 1c i-ii)。 注: 在打开旋转装置之前, 金属网格和6孔板需要精确平衡重量。重要的是要将切片放置在网格的中间, 以便它们在旋转周期中在空气和液相之间完全交替。放置过低或过高的切片不会适当暴露于氧气或营养物质 (图 1c i), 这可能会损害组织的生存能力。在种植过程中, 跟踪切片在网格上的位置非常重要, 因为切片偶尔会向下滑动。如果这种情况发生在培养开始的1–2小时内, 请纠正其位置, 并记下此样品可能已损坏。应丢弃长时间错位的切片, 因为不适当的氧合和营养供应会显著影响组织的生存能力。</li>
	</ol>
</li>
	<li>收集与培养切片相邻的组织切片作为 0 h, 未培养, 参考。收集至少三个参考切片, 以表示被切片的组织的顶部、中部和中心。立即修复0h 切片, 并按照5.1 中所述进行处理。 注: 如果切片数量有限,例如, 如果进行了多种复合处理或技术复制, 则很难将每个经过处理的样品与其相邻的 0 h 样本进行比较。在这种情况下, 使用最近的 0 h 切片 (至少400-600μm 分开) 来评估相对组织的可行性或相关标记在培养开始时的表达。</li>
	<li>为了长期培养, 每天补充培养基。用无菌钳提起含有组织切片的网格, 并将其放置在6井板的空井中;用新鲜培养基代替70% 的培养基, 将栅格重新放置在培养基中。如步骤3.6 中所述, 继续旋转周期。</li>
</ol>4. 小分子抑制剂治疗肿瘤切片
<ol><li>在处理介质中制备所需的化合物浓度。通常情况下, 需要比细胞培养物中测量的 ic50 高10倍的药物浓度, 以实现组织切片中的目标抑制。为了避免不特异性的细胞毒性, 测试一系列浓度, 以获得每种化合物的最低有效浓度。在这里, 我们在小鼠 nsclc 切片上测试了 pij k/mtor 抑制剂 dactolisib 和0.05–0.5μm 的 mek 抑制剂 selumetinib。</li>
	<li>在6井板中加入2.5 毫升的介质, 用稀释后的药物或 dmso 或其他车辆控制。将钛网放入井中。</li>
	<li>按照步骤3.6 中的说明, 将组织切片放在网格上。</li>
	<li>对24小时进行车辆或药物治疗. 按照第5节的规定, 将切片进行组织固定和处理成石蜡块。 注: 药物治疗的持续时间可以根据实验的目标进行优化, 同时考虑到组织切片在培养期间保留原位组织功能的能力。</li>
</ol>5. 组织切片的固定和加工
<ol><li>小心地将未培养的0h 参考或培养的切片提升到浸泡在 pbs 中的滤纸上。<ol>
<li>要做到这一点, 在一个10厘米的板添加2-3 毫升的 pbs, 让切片漂浮在 pbs 和 "鱼" 它通过抬起切片到过滤纸上的钳子。</li>
		<li>将滤纸转移到组织化中, 并在组织切片顶部添加一滴稀释的血红素 (去离子水中的 1:1), 以便在随后的加工步骤中明显标记切片的位置 (图 1d)。</li>
		<li>关闭盒式磁带, 并将其转移到4% 中性缓冲福尔拉林溶液中。在4°c 下将组织固定一夜。 注: 将切片放在滤纸的顶部时, 请确保切片的顶部朝上;这是必要的遵循切片和分析中的顶部、中间和底部部分, 如步骤6.3 中所述。</li>
	</ol>
</li>
	<li>第二天, 将盒式磁带转移到 70% etoh 中, 并立即进行石蜡包埋组织处理步骤。</li>
	<li>在组织处理之前, 请将组织共用 100% etoh 2倍清洗, 每次10分钟。在这种情况下, 使用微波站进行组织处理。选择用于 1 mm 组织厚度的程序, 并按照手册 (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) 中提供的说明进行操作。 注: 使用其他组织加工设备时, 请使用适用于薄组织样品的程序。</li>
	<li>对于石蜡包埋, 打开直方图, 然后使用手术刀小心地从滤纸上取下切片。丢弃滤纸, 并将切片转移到含有液体石蜡的模具中。<ol>
<li>将组织按在嵌入模具的底部, 例如重量平坦, 以确保甚至切片。将组织板的底部放在模具的顶部, 让模具冷却 30分钟, 并将模具与石蜡块分开。 注: 作为水平嵌入的替代方法, 可以通过将肿瘤切片垂直定位以垂直位置垂直嵌入肿瘤切片。垂直截面可随时分析可行性中的梯度或在单个第25款上的功能标记表达式。水平嵌入切片的梯度分析需要石蜡切片, 如步骤6.2 中所述。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 福尔马林固定和石蜡包埋 (ffpe) 组织的处理和分析
<ol><li>使用微生物制备 ffpe 组织切片块的4μm 薄部分。切片时, 调整块的角度, 使块的表面相对于刀片水平方向;这是必要的, 以获得均匀的部分, 整个组织。</li>
	<li>为了能够捕获潜在的区域性诱导的活力梯度、细胞在切片中的迁移或在培养的切片中的生物标志物表达的梯度, 在对象幻灯片上从每个组织切片的顶部、中心和底层收集部分如下所述。</li>
	<li>首先在玻璃滑梯的上半部分收集石蜡嵌入组织切片的顺序组织切片。继续将较深的组织层的部分收集到中间, 然后是玻璃幻灯片的底部部分 (图 1e)。 注: 要在玻璃滑梯上容纳三个部分, 请修剪周围嵌入组织切片的过多石蜡。</li>
	<li>允许部分在37°c 下连夜干燥, 并进行 h & amp; e 染色或免疫组织化学, 如下所述。 注: 当 ffpe 切片在高温下或长时间存储时, 可能会发生抗原性损失。石蜡切片应存放在 4°c, ihc 分析应在切片后6个月内进行。<ol>
<li>对于 h & amp; e 染色, 将石蜡切片进行如下调整和再补水: 二甲苯 3x 5分钟, 100% etoh 3倍 1分钟, 96% etoh 2x 1分钟, 70% etoh 1x 1分钟, 去离子水2倍。</li>
		<li>将新鲜过滤的血恶英溶液中的切片孵育 10分钟, 在自来水下清洗 5分钟, 将其浸入酸性酒精 (70% etoh 中的 1% hcl) 中, 浸泡 2次, 在自来水下清洗 5分钟, 然后用0.5% 的 eosin 孵育2米在中。</li>
		<li>按照 eosin 步骤, 通过将滑块浸入酒精和二甲苯溶液中, 使切片脱水, 如下所示: 96% etoh 2倍为 15秒, 100% etoh 3倍为 30秒, 二甲苯3倍为1分钟。最后, 将这些部分嵌入到基于二甲苯的安装介质中。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 组织活力与生物标志物表达分析
<ol><li>通过使用扫描仪生成 h & amp; e 染色幻灯片的整个幻灯片扫描, 获取高分辨率图像。为了评估组织的可行性, 请从代表切片顶部、中部和底部部分的组织扫描中拍摄快照。<ol>
<li>使用照片机械手软件, 手动绘制在组织的坏死区域的面具, 然后使用 matlab 对坏死区域进行定量。</li>
		<li>计算在不同时间点种植的切片与我们之前的研究中所做的最近的 0 h 切片 (närhi等人, 图 s2b和c)26的相对可行性。同样, 通过量化培养切片顶部、中部和底部的可行性来评估潜在的片内活力梯度, 并计算每个切片与其最近的 0 h 切片的相对活力。 注: 虽然单纯种植小鼠非小细胞肺癌切片会导致坏死细胞死亡, 但根据肿瘤组织的不同, 生物对体外培养条件的反应也会有所不同。例如, 在来自乳腺癌模型25的滤片支持的切片培养物中检测到 hif1α、er 和巨噬细胞中的梯度, 其标记为 fne 80。因此, 对于每种组织类型, 都需要考虑 h & amp; e-以及基于 ihc 的培养切片分析。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在石蜡部分执行 ihc。下面的 ihc 协议是一个起点, 需要对其他抗体进行进一步优化。简单地说, 将石蜡切片重新定位并补充如下: 二甲苯 3x 5分钟, 100% etoh 3倍 1分钟, 96% etoh 2倍 1分钟, 70% etoh 1x 1分钟, 去离子水 2倍, 脱水 2倍1分钟。<ol>
<li>为了暴露抗原表位, 在 pt 模块中使用 ph 6 时使用 10 mm 柠檬酸进行热介导抗原回收, 然后在 1x pbs 中用1% 的牛血清白蛋白 (bsa) 和10% 的正常山羊血清 (ngs) 在环境温度 (21-23°c) 下阻断30分钟。</li>
		<li>在 1% bsa 和 5% ngs 中稀释的初级抗体在 1x pbs 中稀释, 在环境温度下培养1-2小时。用抗兔二级抗体进行培养, 在环境温度下 30分钟, 然后使用 3, 3 '-二氨基苯并嗪 (dab) 进行检测。</li>
		<li>部分用血红素 (在去离子水中稀释至 1:10) 进行30分钟的反染, 在自来水下清洗 5分钟, 然后将滑块浸入酒精和二甲苯溶液中, 如下: 70% etoh 1x、96% etoh 2x、100% etoh 3x、二甲苯 3x (二甲苯 3x)每步 1分钟)。最后, 将这些部分嵌入到基于二甲苯的安装介质中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>获取 ihc 染色幻灯片的整个幻灯片扫描, 使用图像查看器以1:4 的放大倍率将其导出为 tiff 图像, 并使用 imagej 执行量化。 注: 作为扫描仪的替代方法, 可以获得20x 或40x 放大倍率的显微图像进行量化。图像放大倍率可以根据要量化的标记来选择;建议使用高放大倍率图像进行核染色, 而使用20x 图像可以量化细胞质或膜标记。<ol>
<li>为了量化核标记, 在这种情况下 nkx2-1 表达式, 使用 fiji-image 将每个图像转换为16位图像, 并上传图像进行图像分析。</li>
		<li>根据分析自定义图像分析管道。在本协议中, 使用以下管道对 nkx2-1 正核进行量化:识别主要对象测量物体强度筛选对象 (最小值 = 0.0025)计算数学.结果以 dob 染色核在原子核总数中的百分比表示。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

作者声明没有利益冲突。

各种复杂的体外肿瘤模型, 包括3d 培养和有机体, 已经开发出来, 以重述体内肿瘤组织 29, 30 的结构和致癌功能。然而, 建立3d 培养物或有机体涉及组织离解和选择性生长的单个细胞类型或在人工环境中的选定的少数细胞类型的共培养。因此, 这些模型不完全捕获肿瘤异质性和肿瘤间质相互作用的复杂性。另一方面, 有组织型肿瘤切片维持原位肿瘤的组织结构和生物复杂性, 无需广泛操作 。组织切片在其原生微环境中对肿瘤细胞进行建模的能力使其对临床前的研究特别有吸引力。我们以前报告了一个优化的工作流程, 用于建立和分析精确切割肿瘤切片, 并表明, 与过滤支持相比, 一个旋转的培养单元提高了短期小鼠 nsclc 切片培养物的生存能力25,31. 然而, 旋转装置的种植在技术上具有挑战性, 需要不断监测。我们在这里提出了一个方案, 肿瘤组织切片生成和实际使用一个旋转培养单位培养他们, 以及相应的方法来监测切片的能力, 在原位肿瘤生物学 , 先决条件之前, 药物响应测试。
该协议中的几个关键步骤确保了肿瘤切片的组织完整性和活力。如果正常的肺组织包围肿瘤, 振动可以产生厚度不一致的切片或损坏切片, 由于正常组织和肿瘤组织之间的纹理和刚度的差异。因此, 在肿瘤切片之前, 切除周围正常的肺组织是很重要的。另一个关键步骤是切片厚度, 应针对每种组织类型进行仔细优化。此外, 一旦切片, 这是至关重要的切片放置在大约中间的网格, 以确保准确的间歇性浸渍培养基和氧气暴露。最后, 重要的是要跟随切片在其旋转周期内的位置, 因为切片可以下降到介质;如果发生这种情况, 可以按照协议第3.6 步的说明采取进一步的措施。
除了组织处理以确保完整性之外, ihc 分析中还有一些关键步骤来解释切片如何类似于本机组织。我们先前的研究表明, 小鼠 nsclc 肿瘤在致癌信号活动中表现出明显的肿瘤内空间异质性26。这意味着, 使用空间上不同的组织切片进行控制或药物处理样品可能会影响可靠的实验数据解释, 因此应使用紧密相邻的切片作为控制和测试样本。我们进一步表明, 虽然增殖或致癌磷蛋白的表达在新鲜切割的非培养 0 h 切片类似于原位肿瘤, 培养的切片显示改变了致癌磷蛋白的表达, 特别是改变了 p4ebp1和 psrc, 以及由 ki67 ihc 分析的改变的扩散。在24小时人类非小细胞肺癌和前列腺癌切片培养物中也检测到了改变的 p4ebp1 表达 (narhi等人, 补充图 s3b-s3c、s5 和 s7)26。这些发现表明, 比较培养的切片与最近的 0 h 未培养切片是至关重要的评估保存原位肿瘤功能的培养切片。
尽管提高了有机切片25的可行性, 但旋转系统在技术上存在局限性。与滤芯相比, 将组织切片放置在钛网格上更具挑战性, 并且可能无法使用旋转培养单元。作为替代方法, 可以使用停滞滤清器支架, 但在这种情况下, 只应分析切片的空气暴露侧, 因为用 hif1α表达式测量的空气-过滤器梯度和低氧梯度在滤片支持的切片中迅速形成(davies等人, 图5和图 7a-7b)25。我们进一步表明, 肿瘤切片培养物与原生肿瘤相比, 可能表现出改变的增殖和致癌信号活动 26, 这可能是因为伤口愈合反应或切片对体外的代谢适应文化32。虽然在72小时的培养过程中保持了小鼠非小细胞肺癌肿瘤的总体形态特征, 但文化诱导的增殖变化可能会影响培养切片的准确分级。因此, 组织切片只能用于短期功能研究。
使用旋转培养单元至少部分拯救片内的活力或生物标志物表达梯度, 特别是在培养的前24小时。一旦验证的完整性和功能, 这提供了组织材料的功能研究, 如药物治疗研究。除了药物反应分析外, 药物治疗后目标表达的改变也有利于抗体的验证。这对于检测小鼠单克隆抗体的小鼠表位尤其重要, 因为这些抗体往往会给出较高的染色背景。此外, 需要经过验证的抗体, 以便在诊断和临床环境中获得可靠和可重现的数据。因此, 在组织切片药物治疗后, 调节相关表位的丰度或磷酸化, 为抗体验证提供了方便的实际应用。肿瘤切片培养的一个主要优点是能够模拟空间分布的功能, 包括肿瘤或基质细胞中的肿瘤信号活动或药物反应, 这使得它们成为一个有吸引力的体外模型。然而, 切片在培养过程中旋转, 而培养过程会进一步损害组织, 特别是边缘。因此, 将 ph 切片的生物标志物染色 ihc 图像精确覆盖在培养切片中检测到的坏死区域是一项艰巨的挑战, 这损害了将空间生物标志物活动与药物反应精确地联系起来的能力。此外, 肿瘤固有、培养引起和药物引起的坏死反应至少在小鼠非小细胞肺癌组织切片中无法区分, 从而影响了空间药物反应的准确定量。最后, 使用肿瘤切片培养物允许研究人员在同一肿瘤上测试多种化合物, 而无需治疗动物, 从而提炼、减少和取代实验室动物的实验。
作为今后的应用, 所述方案可应用于临床实体肿瘤样本。可能需要进一步的组织类型相关的修改或优化, 从调整振动组设置开始, 包括切片厚度和振动速度, 以优化这些肿瘤纹理或刚度。此外, 不同肿瘤组织对营养和生长因子的要求可能会有所不同。例如, 乳腺癌切片已培养与胰岛素补充在培养基 13,18。鉴于有限的组织材料是在手术或活检过程中获得的, 优化患者衍生的肿瘤切片培养可能具有挑战性, 因为很难获得足够数量的复制样本。此外, 数据重现性还受到明显的患者对患者样本异质性的挑战, 特别是在肿瘤细胞相对于纤维化区域或基质浸润以及坏死组织成分的百分比方面。最后, 在诊断环境中应用肿瘤切片需要调查治疗前活检切片外植体中的药物反应在多大程度上与体内治疗后反应相匹配。

固体肿瘤组织, 包括肺癌, 表现出遗传和表型异质性, 并具有复杂的微环境1,2。肿瘤细胞与其周围微环境的相互作用对药物敏感性和耐药机制的影响3。这突出了临床前模型的必要性, 这些模型能够准确地模拟生物复杂性和在原生肿瘤中的作用。从新鲜肿瘤中立即提取的精确切割切片提供了一种独特的资源, 因为它们具有在体内生物学中表示的主要能力, 至少在很短的时间内是如此, 包括在单个肿瘤中空间分布的表型。切除的临床肿瘤是为数不多的可以从癌症患者身上获得的个性化标本之一, 其诊断用途值得审查。
有机培养的历史可以追溯到19世纪初, 当时人类颅内肿瘤被手工切割成组织块, 并使用所谓的悬挂法进行培养。组织碎片被贴在覆盖片上, 并允许浸入肝素化的人血浆中, 之后盖板被倒置、密封和培养了 4周.自那时以来, 手动切割的肿瘤块已被培养使用各种其他方法, 如等离子凝块 5, 在液体介质6, 或在0.45μm 孔径过滤器6。"有机型" 一词最早是在 1954年, 在一项关于鸡胚胎眼视网膜分化的研究中使用的。随后进行了研究, 使用了从鸡胚胎8中提取的肺和心脏组织外植体, 以及从成年大鼠9中提取的大脑外植体。
描述了各种切片方法, 即手动切割机10,11, 克鲁姆迪克组织切割机12,13和振动组 11,14,15, 16岁krumdieck 组织切割机产生圆柱形组织芯, 然后用微体将其切割成圆形组织切片。另一方面, 振动体使用振动刀片微孔。在一项关于肝切片的研究中, 研究表明, 与克鲁姆迪克切片师15相比, leica 振动体产生的切片重现性更强,一致性更一致。使用了250至500μm 的切片厚度, 研究报告说, 即使在 14天、10天、17、18,以下时间, 还保持了活力和形态特征。然而, 肿瘤有不同的代谢分布, 可以影响营养需求, 参数, 如组织刚度和基质组成可以影响通气和营养流动。因此, 每种组织类型都可能需要优化切片和培养条件。
不同的培养方法被用来支持切片培养: i) 静止间相培养, 也称为停滞支持培养, 其中切片被放置在半多孔膜插入物的顶部浸没在培养介质中。在这一点上, 切片的顶部暴露在空气中, 而底部通过多孔插入 14,19补充营养;(ii) trowel 方法, 最初是用来培养整个器官或胚胎组织切片的。在这种情况下, 切片被放置在由金属网格支持的棉片或过滤器的顶部, 并且滤清器被浸泡在培养基中。为了保持组织湿润, 在20、21、22 片的顶部添加了一层薄薄的介质。前两种被称为气液间培养;iii) 滚子管培养物, 其中切片被放置在含有介质的塑料管的平面一侧内, 缓慢的管旋转可确保组织在循环的第一部分被介质覆盖, 或在第二23 部分加气;(四) 旋转培养装置, 其中切片间歇性地暴露在含有营养物质和曝气的培养基中。与滚子管不同的是, 在这种方法中, 切片被放置在培养基为24的6孔板上的多孔钛网格上。
从切除的实体肿瘤中提取的组织切片在逻辑上呈现了一个有吸引力的体外模型, 用于测试抗癌药物的治疗反应, 因为它们允许评估可行性、靶向途径活性和分子特征在其原生肿瘤微环境中存在的特定肿瘤。然而, 要评估在肿瘤切片中测量的药物反应是否可以预测原位反应, 重要的是要评估组织切片在多大程度上保留肿瘤特异性的生物功能, 如细胞增殖,组织病理学特异性细胞分化或致癌信号活动。在切片制备、切片处理或培养诱导的适应过程中产生的机械应力对组织切片的质量和生物学功能的影响是基本问题, 与实施肿瘤衍生的能力密切相关用于功能诊断的切片。
我们由 imi 资助的财团项目 preed (http://www.predect.eu) 旨在通过研究来自各种来源的切片外植体, 系统地解决这些基本问题。利用来自乳腺癌、前列腺癌和肺癌模型的切片, 这一共同努力利用定性读数以及定量血红素和基于 eosin (h & amp; e) 的读数来证明对大气氧气和停滞过滤器的需求支持维持培养切片的活力, 直到72小时。此外, 对培养切片的免疫组织化学 (ihc) 分析显示切片内的活力梯度, 证明为小鼠非小细胞肺癌 (nsclc)、受体 (er)、hif1α和γh2ax 切片的坏死梯度乳腺癌切片中的梯度, 或前列腺癌切片中的雄激素受体 (ar) 表达梯度25。有趣的是, 在一个旋转的孵化单元中培养, 在24小时培养的小鼠非小细胞肺癌的片内生存能力梯度得到了拯救, 我们最近的研究表明, 生存能力被延长到 72小时26。特别是顶部仍然是最可行的26, 赞同药物反应分析切片是最好的在这一侧的组织进行。
尽管组织切片能在多大程度上反映原位肿瘤功能仍是个问题, 但它们已被广泛用于测试对抗癌药物的反应, 包括靶向药物、单克隆抗体和化疗药物10,11,13,14,18, 27.我们最近显示, 与新鲜切片的 0 h 切片26相比, 小鼠非小细胞肺癌切片在种植后显示出增殖和致癌信号活动的动态变化。这表明, 在进行扰动研究之前, 重要的是要研究在种植过程中是否适当地保存了目标的原位生物功能。尽管有这些发现, 但我们表明, 肿瘤切片可以模拟对靶向疗法的空间反应, 中间药物治疗仍然很短 (24小时), 并在培养26开始时启动。下面的协议描述了重要的验证方面有关的建立和分析肿瘤切片培养之前, 其应用于药物测试。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

组织型原代组织外植体培养物, 包括精密切割切片, 代表三维 (三维) 组织结构以及本地组织的多细胞相互作用。立即从新切除的肿瘤中切割的组织切片保留了肿瘤内异质性的空间方面, 从而使它们成为体内生物学的有用代孕者。仔细优化组织切片制备和培养条件是肿瘤切片外植体预测诊断潜力的基础。在这方面, 小鼠模型是有价值的, 因为这些模型提供了一致的肿瘤材料流动, 以进行复制和可复制的实验。该协议描述了使用旋转培养单元培养小鼠肺肿瘤生成组织切片的过程, 该系统能够使组织间歇性地暴露于氧气和营养物质。我们以前的研究表明, 与其他培养方法相比, 使用旋转培养单元可以提高组织的可行性, 特别是漂浮切片和停滞过滤器支架。在这里, 我们进一步表明切片厚度影响培养切片的可行性, 建议对不同的组织类型进行切片厚度的优化。宣布注射性犯罪在相关的致癌功能, 如信号活动, 间质细胞浸润或分化标记的表达, 需要评估相邻的组织切片的表达改变药物治疗或种植本身。总之, 该方案描述了小鼠肺肿瘤切片的生成及其培养在一个旋转的孵化单元, 并演示了如何系统地分析切片的表达异质性组织标记, 作为先决条件在药物反应研究之前

图 1显示了从小鼠 nsclc 肿瘤中提取的精确切割组织切片的生成、培养和分析的工作流程。在这次演示中, 我们利用了具有 krasg12d 有条件激活的基因工程小鼠模型 (gemm) 的肿瘤, 以及lkb1 (也称为 serinysinine kinase 11) 的损失, 以下称为Kl。如26、28 中所述, 小鼠繁殖和肺肿瘤发生。图 2a显示了组织切片厚度对使用旋转培养单元培养24小时的切片的活力的影响。结果表明, 160μm 薄片在切片上含有较大的坏死区域。此外, 250μm 薄片在切片上显示出坏死梯度, 而薄片为200微米薄片。最薄的160μm 的整体可行性差很可能是由于在网格顶部定位切片的过程中的技术处理造成的, 因为这些切片是脆弱的, 往往会卷曲。另一方面, 当切片太厚时, 它们会容易出现氧缺乏或营养扩散的成分, 在小鼠 nsclc 外植体中, 这些都被证明是坏死死亡梯度25。然而, 应该注意的是, 具有可变厚度的切片可以从一个肿瘤生成, 尽管使用相同的振动组设置。因此, 建议分析来自不同肿瘤样本的多个复制。重要的是, 每种组织类型都需要优化切片厚度, 以实现最大的活力, 因为组织的质地和硬度会影响氧合和营养流。图 2 b-2c显示了 nkx2-1 表达的定量 ihc 分析, 这是在72小时培养并匹配的 0 h 切片的样本中分化良好的肺腺癌 (ac) 的标志。结果表明, 与 0 h 未培养切片相比, nkx2-1 在培养切片中的表达无明显改变, 表明培养过程对 ac 肿瘤组织的分化状态没有明显影响。图 2d显示了肿瘤组织切片在评估靶向药物有效性方面的效用。我们最近发现, 与腺鳞瘤 (asc) 肿瘤相比, kras突变小鼠的磷酸化 erk半 (标记 mTOR 通路活性增加) 的表达较高, 而磷酸化 4ebp1 (标记 mtor 活性) 的表达) 在 ac 和 asc 肿瘤中也有类似的表达。为了测试这些途径是否可以有效地针对组织切片, kl ac 组织切片使用 dmso 或滴定量的化合物, 即 0.1μm dactolisib 以 mtor 通路为目标, 或以 mTOR 为靶向的-0.5μm selumetinib。结果表明, 1μm dactolisib 或0.5μm 的 selumetinib 分别有效地抑制4ebp1 或 erk半的磷酸化。此外, 剂量依赖性抑制目标磷酸蛋白表明, 组织切片也可用于验证磷酸酶特异性抗体。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> 图 1: 小鼠非小细胞肺癌肿瘤衍生的切片外植体的建立和分析工作流的原理图表示.(a) 描述用于切片的含肿瘤肺的收集和准备的示意图。肺裂片从老鼠身上取出, 肿瘤组织从正常组织中解剖。黑色箭头和星号分别表示大约4毫米和1毫米肿瘤。白色箭头表示粘附在标本支架表面的肺组织。红色箭头指向另一块正常的肺支撑组织, 以保持肿瘤直立的位置。(b) 振动体切片和组织切片的收集。白色箭头表示切片方向。将顺序切片收集到一个24孔板, 其中包含冷 hbss + pss。切片可以在不同的时间点 (此处为24–72小时) 进行培养, 以评估培养过程中肿瘤特有的标记表达, 也可以用于进行药物治疗。c: 车辆控制, t: 药物治疗。(c) 使用旋转培养装置放置组织切片进行培养。倾斜6孔板, 使某些介质覆盖网格的顶部, 将组织切片放置在栅格的中间, 放在介质顶部, 并使用钳子展开切片。确保6孔板的重量平衡, 以实现平稳的旋转周期。x: 表示不正确, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg">并且: 指示切片的正确位置。(d) 肿瘤切片 ffpe 块的照片。黑色箭头指向用血红素染色的石蜡嵌入组织切片。(e) 在 ffpe 块中显示切片顺序的原理图;这些部分可以被处理, 以评估组织的活力和肿瘤特异性生物标志物的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> 图 2: 评估非小细胞肺癌组织切片的可行性和组织肌素特异性标记表达, 并有针对性地进行药物治疗.(a) 与160μm 或250μm 薄片相比, 为 24h. 200 微米薄片培养的已指示厚度的 ac nsclc 切片的代表性 h & amp; e 图像保持了更好的生存能力。深蓝色代表 h & amp; e 染色的可行组织, 粉红色表示假彩色坏死区。浅蓝色表示由于组织质量差或纤维间质存在而被排除在分析之外的区域。t1 和 t2 代表从两个不同的肿瘤中提取的生物复制物。刻度条 = 500μm. (b) 代表 ihc 图像的 nkx2-1 表达在交流切片中培养的指示的时间点。箭头表示以更高的放大倍率显示的区域。结果表明, 与 0 h 切片相比, 培养的切片中 nkx2-1 表达式没有改变。刻度杆 = 500μm 和 50μm, 分别用于低放大倍率和高放大倍率。(c) (b) 所示数据的量化。(d) 具有代表性的 ihc 图像, 在 0 h 切片中进行磷酸化4ebp1 或 perk半 e 表达, 或用 dmso 或滴定量的 dmso 或滴定量的 dactolisib (dact, top row) 或磷酸化皮克半表达在0小时中处理的切片, 或用 dmso 或经过处理的切片塞鲁梅替尼 (sel, 底部行)。黑框表示以较高的放大倍率显示的区域。刻度杆 = 1 毫米或 50μm, 分别用于低或高放大倍率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

为小鼠肺肿瘤的组织型切片的生成、培养和系统分析提供了一种方法。我们还描述了如何优化切片厚度, 以及如何选择药物浓度来治疗肿瘤切片。

肿瘤切片提取物的建立与分析是诊断检测的前提

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

这种方法可以帮助回答临床前研究中的关键问题，其中肿瘤切片外植的药物反应研究可能有助于诊断目的。该技术的主要优点是切片外植可以在短时间内模拟本地组织的复杂生物学，包括空间分布功能。虽然这种方法可以提供从穆林肺肿瘤切片的使用洞察，它也可以应用于其他组织类型，包括人体组织。首先，准备振动器，并按照手册中提供的说明执行 VibraCheck。然后用汉克平衡盐溶液一毫升，辅以青霉素和链霉素，将盘子放在冰上。将 25 针插入安乐死小鼠的所有四爪，放在发泡胶盖上，使胸部暴露，动物被拉伸。在暴露的皮肤表面喷洒 70% 的酒精。使用放置在倾斜位置的剪刀将皮肤从腹部切开，切到胸部，一直切开到颈部区域。使用钳子拉伸两侧的皮肤，并插入 25 个量表的针头。切开腹部区域。然后切开肋骨笼和隔膜，露出肺和心脏。通过切割周围组织暴露气管。解肺，连同心脏。将组织放入含有 30 毫升冰冷 HBS 的 50 毫升管中，并辅以放在冰上的 Pen-Strep，然后尽快进入下一步。现在将带有肿瘤的肺转移到10厘米的组织培养板中。使用无菌剪刀和钳子分离肺叶，并选择表面有肿瘤的叶进行切片。将带肿瘤组织的肺叶放在一张滤纸上，以避免滑倒，并切掉肿瘤周围的部分正常肺或其他肿瘤组织，使用无菌手术刀生成扁平组织片面。将扁平的一滴氰丙烯酸酯粘合剂浸入一滴白化硅胶粘剂中，并安装到振动组试样支架上，使肿瘤以直立位置面对刀片，并让它干燥两到三分钟。将振动器试样支架放入金属缓冲盘中。用用笔链补充的冷HSS填充托盘，直到组织浸入缓冲液中。用仪器提供的 Plexiglas 盖盖住缓冲盘，将托盘放入白色冰浴中，并添加冰，以保持组织在切片过程中保持凉爽。将白色冰浴连接到振动器上。然后选择合适的切片设置并开始切片。将振动器刀片带到切片位置并设置切片窗口。使用无菌钳收集切片在24井板充满一毫升的HPSS补充每井的Pen-Strep，并保持冰上。在跟踪切片顺序的同时，根据实验计划标记24井板的每个井。收集与培养切片相邻的组织切片，作为零小时或未培养的参考。收集至少三个参考切片，以表示组织的顶部、中心和底部。切片完成后，继续修复和处理。之后，通过将钛网格放入中，准备一个包含每井2.5毫升培养介质的六井板。确保钛栅格和介质之间没有形成气泡。将切片加载到网格上，使六井板保持倾斜位置，使介质的一部分覆盖网格。然后将切片放在网格上的介质中，并使用钳子进行摊铺。放置切片后，将六孔板装载到放置在加湿培养箱内的旋转孵化单元上，该培养箱保持在 37 摄氏度，二氧化碳为 95%02 和 5%。开始旋转循环。为了长期栽培，每天使用无菌钳子来补充培养媒介，以提升含有组织切片的网格，并放在六井板的空井中。用新鲜培养介质替换 70% 的介质，然后重新放置网格。继续旋转周期，如以前一样。用于肿瘤切片的药物治疗，将稀释药物或车辆控制添加2.5毫升的介质，进入六井板。将钛网格放入孔中，然后像以前一样将切片放入网格上。进行24小时治疗后，继续修复和处理。开始修复所需的切片小心地将其转移到一个 10 厘米的板中，其中包含填充两到三毫升 PBS 的浸泡滤纸，并让它浮动。然后用一对钳子把滤纸提起，放在一个纸盒里。将滤纸放入一个轮盘盒中。在组织切片上加入一滴稀释的赤氧树脂，以标记切片的位置，以完成后续步骤。关闭盒式磁带，将其转移到 4% 中性缓冲形式溶液中，并在 4 摄氏度下过夜。在按协议所述清洗和处理盒式磁带后，打开磁带盒，并使用手术刀小心地从滤纸中提起固定切片。丢弃滤纸，将切片转移到含有液体石蜡的模具中。使用平量将组织压在嵌入模具的底部，以确保均匀的分段。将轮盘盒的底部放在模具顶部。在上面加入液体石蜡。让模具在冷盘上冷却30分钟。之后，将冷却的模具与石蜡块分离。使用微切器准备 FFPE 组织切片块的四微米薄部分。修剪掉组织周围多余的石蜡。在整个组织中获得均匀部分，请调整块的角度，使块的表面与刀片水平方向。使用薄刷子收集从玻璃滑梯上部开始的石蜡嵌入组织切片的顺序组织部分。继续收集深层组织层的部分到中间，然后是玻璃滑梯的底部。从每个组织切片的不同层到对象幻灯片的部分的集合，是为了在生存能力、细胞迁移或生物标志物表达中捕获潜在的培养诱导梯度。收集各节后，继续处理和进一步分析，如协议中所述。组织切片厚度会影响培养切片的可行性。在这种情况下，250微米厚的切片显示坏死梯度增加，而200微米厚的切片由于较厚的切片容易在切片中缺氧或营养扩散。然而，160微米薄片包含较大的坏死区域，可能是由于在切片定位过程中的技术处理造成的，因为这些切片很脆弱，容易卷曲。NKX2-1是分化良好的肺腺癌的标记，分析表明，与零小时未培养切片相比，其表达在培养切片中没有显著变化。NKX2-1表达的定量分析进一步证实，该表达在培养中与未培养的切片相比没有显著变化，这表明培养过程没有明显影响腺癌组织的分化状态。为了测试肿瘤组织切片是否可用于评估靶向药物的疗效，它们被DMSO或滴定量的化合物治疗。当用一个微摩尔dactolisib治疗时，它的目标为4EBP1的mTOR通路磷酸化被抑制。0.5 以 MAP 激酶通路为目标的微摩尔黄豆酰胺有效抑制 ERK1/2 的磷酸化。看完这个视频后，你应该有一个很好的理解，如何工作，并批判性地分析切片新鲜切从珍贵的肿瘤组织。我们的前博士后Katja Narhi与IMI预处理联盟组织切片平台的同事合作，为这种方法的建立做出了贡献。

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