Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Denne forskning arbejde modtaget økonomisk støtte fra Innovative lægemidler initiativ fællesforetagendet giver aftalen no 115188, Helsinki Universitet ph.d.-programmet i biomedicin stipendier (A.S.N.) og Sigrid Juselius og Orion-Farmos fonde (E.W.V.). Vi takker vores PREDECT væv skive platform konsortiemedlemmer (Taija af Hällström og Siv Knaappila for støtte til oprettelse af rotator system og Riku Turkki for støtte med MATLAB analyse. Jouko Siro er takkede til at indfange figur 1 fotografier. Vi takker FIMM WebMicroscope holdet til scanning histologiske dias, og Laboratory Animal Center for dyrehold støtte.

Alle mus eksperimenter beskrevet i denne undersøgelse blev udført ved at følge retningslinjerne fra den finske nationale bestyrelsen dyr eksperimenter, og blev godkendt af den eksperimentelle dyr af universitetet i Helsinki og staten Provincial Office i det sydlige Finland (licens nummer ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. forberedelser før udskæring
<ol><li>Holde følgende materialer klar: vibratome præparatholderen, vibratome buffer bakke, 10 cm kultur plade, 24-godt plade, 10 mL pipette, pipette dreng, affald taske, 70% EtOH i en 50 mL tube desinficere instrumenter og væv lim.</li>
	<li>Forberede vibratome: tør klingeholder med 70% EtOH, vedhæfte en ny klinge, og udføre en vibrocheck ifølge vejledningen i håndbogen (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf). Bemærk: Det er vigtigt at udføre trinnet vibrocheck, da det minimerer den lodrette afbøjning af bladet og sikrer god kvalitet skiver.</li>
	<li>Fyld hver godt af 24-godt plade med 1 mL af Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) suppleret med 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin (HBSS + P/S); holde pladen på is.</li>
	<li>Forberede F12 næringssubstratet suppleret med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamax, 22 mM glukose og 10% føtal bovint serum (FBS). Bemærk: Tumor skive næringssubstratet og vækstfaktor kosttilskud kan variere afhængigt af tumor væv25.</li>
	<li>Forbered den nødvendige mængde af F12 medium for narkotikabehandling, ved hjælp af samme sammensætning som beskrevet i trin 1.4, men udelade FBS. Bemærk: Da vækstfaktorer i serum kan påvirke muterede signalering i kulturperler skiver, anbefales serumfrit medium for narkotika undertrykkelse af netbårne korttidsforsøg på tumor skiver. Hvis langsigtede skive kulturer analyseres, er det vigtigt at først vurdere effekten af serumfrit medium på væv levedygtighed og tumor-specifik markør udtryk i ubehandlet skive kulturer.</li>
</ol>2. indsamling af Tumor-bærende lungerne
<ol><li>Aflive en tumor-bærende mus af cervikal dislokation, når det viser symptomer på besværet vejrtrækning og tab af kropsvægt. Bemærk: CO2-medieret eutanasi er kendt for at inducere hypoksiske betingelserne i lungerne, som kan have en effekt på skive levedygtighed eller muterede aktiviteter via fremkalde en hypoksiske svar.</li>
	<li>Strække det aflivede mus på en Styrofoam låget ved at indsætte 30 G nåle i alle fire poter, således at brystet er udsat.</li>
	<li>Skar huden fra maven mod brystet, og halsregionen. Skære åbne brystkassen, og derefter membran til at udsætte lungerne og hjertet. Holde saksen i en vinklet position til at undgå vævsskader.</li>
	<li>Dissekere tumor-bærende lunger sammen med hjertet og placere dem i en 50 mL tube indeholder 30 mL iskold HBSS + P/S; holde røret iskold og gå videre til næste trin så hurtigt som muligt. Bemærk: Forsinkelser i behandlingen af lunge tumorer kan ændre onkogenisk funktioner, for eksempel signalering pathway aktiviteter.</li>
</ol>3. generation af præcision-cut lunge Tumor skiver
<ol><li>Overføre tumor-bærende lungerne i HBSS + P/S til en 10 cm vævskultur plade holdes inde en laminar hætte. Adskille lunge lapper ved hjælp af steril saks og pincet, og vælg lapper med tumorer på overfladen til udskæring. Bemærk: Tumorer > 3 mm i størrelse er velegnet til udskæring. Siden normal lungevæv omkring de store tumor kompromiser udskæring på grund af forskelle i væv stivhed, skal tumor væv gennemgår udskæring være adskilt fra den normale væv, sådan at en ryddet tumor regionen står over for vibratome bladet.</li>
	<li>Generere en flad væv stykke overflade ved at skære en del af normal lungevæv, der omgiver tumor væk med en steril skalpel, og dyp den flade dias i en dråbe Cyanocrylat lim. Montere denne side på vibratome's præparatholderen, således at tumor ansigter blade i en oprejst position. Lad limen tørre i 2-3 min. Bemærk: Normal lungevæv limet til præparatholderen griber ikke ind i tumor væv udskæring og udskæring er stoppet før den normale væv er nået. Tumor væv bøjer undertiden på grund af svampet teksturen af normal lungevæv limet til præparatholderen, gå på kompromis med sin oprejst position. Hvis dette sker, lim et stykke ekstra normale lunge støtte væv ved siden af den pre monteret normal lungevæv bevare tumor i en oprejst position (figur 1A iii).</li>
	<li>Placere præparatholderen i metal pufferkar og fyld den med kolde HBSS + P/S indtil væv er nedsænket i bufferen. Placer metal pufferkarret op på den hvide is bad og tilsæt is for at køle vævet mens udskæring.</li>
	<li>Tillægge vibratome hvide iskarret. Vælg passende udskæring indstillinger: amplitude spænder mellem 2,5-2,8, udskæring hastighed mellem 0,10-0,14 ms og skære tykkelse spænder mellem 160-250 µm. Bemærk: Udskæring indstillinger skal tilpasses hårdhed af væv. Hårde væv er lettere at skive end blødere væv og blødere væv kræver udskæring med lavere hastighed (0,1-0,12 ms) og højere amplitude (2,6-2,8). En 4-5 mm store tumor giver typisk 15-20 skiver af 200 µM tykkelse. I kort omdrift, kan murine tumorer være skåret under semi-sterile forhold uden for laminar hætten. Kliniske tumorer bør dog altid være skåret inde i en klasse II biosikkerhed laminar hood at undgå udsættelse for muligt smitstoffer i den menneskelige væv.</li>
	<li>Brug steril pincet, indsamle skiver i 1 mL af HBSS i separate brønde i en 24-godt pladen opbevares på is, nøje at holde styr på den rækkefølge, hvori skiver er skåret. Markere hver godt af 24-godt plade efter de eksperimentelle plan. For eksempel, narkotika mark sekventielle wells af en 24-godt plade som kultur tid point eller 0 h, køretøjet kontrol (C), behandlede (T) (figur 1B ii). Bemærk: Ikke forstyrre eller trække tumor væv mens indsamling en skive, som dette vil ændre den tumor orientering med hensyn til vinklen af vingen, fører til uoverensstemmelser i tykkelser af de efterfølgende skiver.</li>
	<li>Når alle skiver er indsamlet, overføre dem på titanium gitre (2-3 skiver pr. gitter) placeret i en 6-godt plade der indeholder 2,5 mL af næringssubstratet pr. brønd. Sørg for, at ingen luftbobler er dannet mellem gitteret titanium og medium.<ol>
<li>At indlæse en skive på nettet, holde 6-godt plade i en vinklet position, således at en del af mediet dækker gitteret og placere skive i medium på nettet; bruge pincet til at sprede skive hvis det krøller. Indlæse 6-godt plader på den roterende inkubation enhed placeret inde en befugtet inkubator vedligeholdes ved 37 ° C med 95% luft og 5% CO2, og starter rotation cyklus (figur 1 c i-ii). Bemærk: Metallisk gitre og 6-godt pladerne skal være præcist vægt afbalanceret før du tænder den roterende enhed. Det er vigtigt at placere udsnittene i gitteret så de fuldt alternere mellem luft og væske faser under rotation cykler. Udsnit, der er anbragt for lavt eller højt udsættes ikke passende for ilt eller næringsstoffer (figur 1 c jeg), der kan kompromittere væv levedygtighed. Det er vigtigt at følge holdning af skive på nettet under dyrkning, som skive kan lejlighedsvis glide ned. Hvis dette sker inden for 1-2 h af kultur debut, rette sin holdning og notere, at denne prøve kan være beskadiget. Udsnit, der er mispositioned for en længere periode bør kasseres, da væv levedygtighed er væsentligt påvirket af uretmæssig iltning og næringsstofforsyning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indsamle en væv skive støder op til de kulturperler skiver som en 0 h, ukultiveret, reference. Indsamle mindst tre reference skiver repræsenterer toppen, midten og midten af de væv er skåret. Fix 0 h skiver straks og proces, som beskrevet i 5.1. Bemærk: Hvis antallet af skiver er begrænset, fx, hvis flere sammensatte behandlinger eller tekniske replikater er færdig, sammenligninger af hver behandlede prøve med dens nærliggende 0 h prøve kan være vanskeligt. I sådanne tilfælde skal du bruge den nærmeste 0 h Skive (mindst 400-600 µm apart) at vurdere relative væv levedygtighed eller udtryk for relevante markører på kultur debut.</li>
	<li>For langsigtet dyrkning, genopbygge næringssubstratet hver dag. Løft den gitter, der indeholder væv skiver ved hjælp af steril pincet, og placere den i en tom godt af 6-godt plade; erstatte 70% af mediet med friske næringssubstrat, og placere gitteret tilbage i medium. Fortsætte rotation cyklussen, som forklaret i trin 3.6.</li>
</ol>4. behandling af Tumor skiver med lille molekyle hæmmere
<ol><li>Forbered de nødvendige koncentrationer af forbindelser i behandling medium. Typisk, en 10-fold højere drug koncentration i forhold til IC50s målt i cellekulturer er forpligtet til at opnå målet hæmning i væv skiver. For at undgå uspecifik cytotoksicitet, afprøve en række koncentrationer at opnå minimalt effektiv koncentration for hvert stof. Her, vi testede 0,1-1 µM PI3K/mTOR hæmmer dactolisib og 0,05 – 0,5 µM i MEK hæmmer selumetinib på murine NSCLC skiver.</li>
	<li>Tilføje 2,5 mL af medier med det fortyndede lægemiddel eller DMSO eller andre køretøjet kontrol i 6-godt pladen. Placere titanium gitre i brøndene.</li>
	<li>Placer væv skiver på nettene, som beskrevet i trin 3.6.</li>
	<li>Udføre køretøj eller medicin behandlinger for 24 h. Fortsæt med væv fiksering og forarbejdning af skiver til paraffinblokke som beskrevet i afsnit 5. Bemærk: Varighed af narkotikabehandling kan optimeret afhængigt af formålet med forsøget, under hensyntagen til væv skiver evne til at bevare i situ væv funktioner analyseres periode kultur.</li>
</ol>5. fiksering og forarbejdning af væv skiver
<ol><li>Løft forsigtigt ukultiveret 0 h reference- eller kulturperler skive på et filtrerpapir, dyppet i PBS.<ol>
<li>For at gøre dette, tilsættes 2-3 mL PBS i en 10 cm plade, lad skive float i PBS og 'fiske' det ved at løfte skive på filter papir med et par pincet.</li>
		<li>Overføre filtrerpapir ind i en histocassette, og Tilføj en dråbe af fortyndede hæmatoxylin (1:1 i ionbyttet vand) på toppen af væv udsnittet synligt markere positionen af skive under de efterfølgende behandlingstrin (fig. 1 d).</li>
		<li>Lukke kassetten, og overføre det i 4% neutralt bufferet formalin løsning. Fix væv natten over ved 4 ° C. Bemærk: Samtidig med at placere skive på toppen af filtrerpapir, Sørg for, at den øverste del af skive vender opad; Det er nødvendigt at følge øverste, midterste og nederste del af en skive ved skæring og analyse som beskrevet i trin 6.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Den næste dag, overføre kassetter til 70% EtOH, og straks gå videre med den paraffin-embedding væv behandlingstrin.</li>
	<li>Inden væv forarbejdning, vaske histocasettes i 100% EtOH 2 x til 10 min. I dette tilfælde bruge en mikrobølgeovn station til væv forarbejdning. Vælg det program, der bruges til 1 mm væv tykkelse og følge vejledningen i håndbogen (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf). Bemærk: Når du bruger andre væv forarbejdning maskiner, bruge programmet egnet til tynde vævsprøver.</li>
	<li>Integrering af paraffin, at åbne en histocassette og bruger en skalpel til løft forsigtigt udsnit fra filtrerpapir. Kassér filtrerpapir, og overføre udsnittet i en støbeform, der indeholder flydende paraffin.<ol>
<li>Tryk på væv mod bunden af formen indlejring, for eksempel med en flad vægt, at sikre selv skæring. Placere den nederste del af histocasette på toppen af mold, lad mug afkøle på en kold pate i 30 min, og adskille formen fra paraffin blok. Bemærk: Som et alternativ til horisontal integrering, er det muligt at integrere tumor skive lodret positionering udsnittet i en oprejst position. Lodrette sektioner tillade let analyse af forløb i levedygtighed eller funktionelle markør udtryk på et enkelt afsnit 25. Gradient analyse med horisontalt integreret skiver kræver paraffin skæring som beskrevet i trin 6.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. behandling og analyse af Formalin-fast og Paraffin-embedded (FFPE) væv
<ol><li>Forbered 4 µm tynde sektioner af FFPE væv skive blokke ved hjælp af en mikrotom. Ved skæring, justere vinklen på blokken, således at overfladen af blokken er horisontalt orienteret med hensyn til klingen; Det er nødvendigt at opnå selv-afsnittene gennem hele væv.</li>
	<li>Hvis du vil aktivere erobringen af en potentiel kultur-induceret levedygtighed gradient, celle migration på tværs af skiver, eller forløb i biomarkør udtryk på tværs af kulturperler skiver, indsamle sektioner fra toppen, midten og bunden lag af hver af væv skive på objekt dias som forklaret nedenfor.</li>
	<li>Indsamle sekventielle væv sektioner af paraffin-embedded væv skive først på den øverste del af glas lysbilleder. Fortsat indsamle dele af de dybere væv lag til midten efterfulgt af nederste del af glas dias (figur 1E). Bemærk: For at rumme tre sektioner på et glas dias, trimme væk overskydende paraffin omkring den indlejrede væv skive.</li>
	<li>Tillad sektioner til tørre natten over ved 37 ° C, og Fortsæt med H & E farvning eller Immunhistokemi som beskrevet nedenfor. Bemærk: Tab af antigenicity kan opstå, når FFPE sektioner er gemt ved høje temperaturer eller for længere perioder. Paraffinsnit anbefales skal opbevares ved 4 ° C, og IHC analyserne skal foretages senest 6 måneder efter skæring.<ol>
<li>H & E farvning, deparaffinize og rehydrere paraffin afsnit som følger: xylen 3 x i 5 min, 100% EtOH 3 x til 1 min, 96% EtOH 2 x for 1 min, 70% EtOH 1 x 1 min. og deioniseret vand 2 x for 1 min.</li>
		<li>Inkuber sektioner i frisk filtreret hæmatoxylin løsning i 10 min og vask under rindende vand i 5 min. dukkert afsnittene i syre alkohol (1% HCl i 70% EtOH) for 2 gange, og vask under rindende vand i 5 min. efterfulgt af inkubation med 0,5% eosin for 2 m i.</li>
		<li>Efter trinnet eosin dehydrere sektionerne ved at nedsænke dias i alkohol og xylen løsninger, som følger: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x til 30 s, xylen 3 x til 1 min. Endelig, integrere sektionerne i en xylol-baserede montering medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analyse af væv levedygtighed og biomarkør udtryk
<ol><li>Erhverve billeder i høj opløsning ved at generere hele dias scanninger af H & E-farvede dias ved hjælp af en scanner. For at vurdere væv levedygtighed, tage snapshots fra væv scanninger der repræsenterer de øverste, midterste og nederste dele af udsnittene.<ol>
<li>Brug foto manipulator software, manuelt tegne masker på områderne nekrotisk væv, efterfulgt af kvantificering af nekrotisk områder ved hjælp af MATLAB.</li>
		<li>Beregne den relative levedygtighed af skiver dyrkes til forskellige tidspunkter i forhold til den nærmeste 0 h skive som gjort i vores tidligere undersøgelse (Närhi et al., Figur S2B og C)26. Ligeledes vurdere potentielle intra-skive levedygtighed forløb af kvantificere levedygtighed i afsnittet toppen, midten og bunden i en kulturperler skive, og beregne den relative levedygtighed af hver sektion til sin nærmeste 0 h skive. Bemærk: Mens den blotte dyrkning af murine NSCLC skiver inducerer nekrotisk celledød, biologiske svar til ex vivo kultur betingelser afhænger af tumor væv. For eksempel, blev gradienter i HIF1α, ER og makrofager præget af F4/80 påvist i filter-støttede skive kulturer stammer fra en bryst kræft model25. H & E - samt IHC-baserede analyser af kulturperler skiver skal derfor anses for hver vævstype.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Udføre IHC på paraffinsnit. Følgende IHC protokol er et udgangspunkt, og kræver yderligere optimering for andre antistoffer. Kort, deparaffinize og rehydrere paraffin afsnit som følger: xylen 3 x i 5 min, 100% EtOH 3 x til 1 min, 96% EtOH 2 x for 1 min, 70% EtoH 1 x 1 min og deioniseret vand 2 x for 1 min.<ol>
<li>Til at afsløre de antigene epitoper, udføre varme-medieret antigen genfinding ved hjælp af 10 mM citronsyre på pH 6 i en PT modul, efterfulgt af blokering med 1% bovint serumalbumin (BSA) og 10% Normal ged Serum (NGS) i 1 x PBS i 30 min. ved stuetemperatur (21-23 ° C).</li>
		<li>Inkuber den primære antistof fortyndet i 1% BSA og 5% NGS i 1 x PBS, enten i 1 – 2 timer ved stuetemperatur. Inkuber med anti-kanin sekundær antistof, i 30 min. ved stuetemperatur, efterfulgt af påvisning ved hjælp af 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB).</li>
		<li>Sektioner er counterstained med hæmatoxylin (fortyndet til 1:10 i ionbyttet vand) til 30 s, og vaskes under vand fra hanen i 5 min, efterfulgt af dehydrering ved at nedsænke dias i alkohol og xylen løsninger, som følger: 70% EtOH 1 x 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xylen 3 x ( 1 min hvert skridt). Endelig, integrere sektionerne i en xylol-baserede montering medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhverve hele dias scanninger af IHC-farvede lysbilleder, eksportere dem som TIFF billeder på en forstørrelsesforhold på 1:4 benytter den benytter en billedfremviser og udføre kvantificeringer bruger ImageJ. Bemærk: som et alternativ til scanneren, mikroskopiske billeder på 20 X eller 40 X forstørrelse kan erhverves for kvantificeringer. Billede forstørrelse kan vælges afhængigt af markør til kvantificeres; høj forstørrelse billeder anbefales til nukleare farvning, mens cytoplasmatisk eller membran markører kan kvantificeres ved hjælp af 20 X billeder.<ol>
<li>Til kvantificering af nukleare markører, i dette tilfælde NKX2-1 udtryk, konvertere hver billede til 16-bit billeder ved hjælp af Fiji-ImageJ, og uploade billeder til billedanalyse.</li>
		<li>Tilpas billede analyse pipeline afhængigt af analysen. I denne protokol, kan bruge følgende rørledningen til kvantificering af NKX2-1 positiv kerner: identificere primære objekter | Måling objekt intensiteten | Filtrer objekter (minimal værdi = 0,0025) | Beregne Math. Resultaterne er repræsenteret som procenter af DAB-farvede kerner af antallet af kerner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Forskellige komplekse in vitro- tumor modeller, herunder 3D kulturer og organoids, er blevet udviklet for at sammenfatte arkitektur og muterede funktioner i vivo tumor væv29,30. Oprettelse af 3D kulturer eller organoids indebærer imidlertid væv dissociation og selektiv vækst af en enkelt celletype eller fælles kultur af en sluttet få celletyper i et kunstigt miljø. Som følge heraf fange sådanne modeller ufuldstændigt snørklede af tumor heterogenitet og tumor-stroma interaktioner. Organotypic tumor skiver, på den anden side bevare de væv arkitektur og biologiske kompleksitet i situ -tumor uden omfattende manipulation. Denne evne af væv skiver til model tumorceller i deres native mikromiljø gør dem særlig attraktive for prækliniske undersøgelser. Vi tidligere rapporteret en optimeret workflow for oprettelse og analyse af præcision-cut tumor skiver, og viste, at, i forhold til at filtrere understøtter, en roterende inkubation enhed forbedre levedygtigheden af kortsigtede murine NSCLC skive kulturer25 , 31. dog dyrkning på roterende enheder er teknisk udfordrende og kræver konstant overvågning. Her præsenterer vi en protokol for tumor væv skive generation og praktisk anvendelse af en roterende inkubation enhed for at kultur dem, som ledsager metoder til at overvåge skiver evne til at fange i situ tumor biology, en forudsætning før stof svar test.
Flere kritiske trin i protokollen sikre væv integritet og levedygtighed af tumor skiver. Hvis normal lungevæv omgiver tumor, kan vibratome generere skiver med inkonsekvent tykkelse eller beskadige skiver, på grund af forskelle i tekstur og stivhed mellem normal og tumor væv. Det er således vigtigt at fjerne den omkringliggende normal lungevæv før tumor udskæring. En anden kritisk trin er den udskæring tykkelse, som omhyggeligt skal optimeres for hvert vævstype. Derudover når skiver, er det kritisk, at udsnittet er placeret cirka midt i gitteret, så at sikre nøjagtig intermitterende dypning i substratet og ilt eksponering. Endelig er det vigtigt at følge holdning af en skive i sin rotationsperiode, som en skive kan falde ned til medium; Hvis dette sker, kan yderligere foranstaltninger træffes som forklaret i trin 3.6 i protokollen.
Udover væv håndtering for at sikre integritet, er der også vigtige skridt i IHC analyse til at fortolke, hvordan udsnittets ligner det oprindelige væv. Vores tidligere undersøgelse viste, at murine NSCLC tumorer udviser udtalt intra-tumor rumlige heterogenitet i muterede signaling aktiviteter26. Dette betyder, at brugen af rumligt adskilte væv skiver for kontrolelementer eller stof-behandlede prøver kan påvirke pålidelige eksperimentelle data fortolkning, og dermed tæt tilstødende udsnit skal bruges som kontrol og prøver. Vi yderligere viste, at mens spredning eller muterede phosphoprotein udtryk i frisk skåret ukultiveret 0 h skiver var det samme i situ tumorer, kulturperler skiver viste ændrede muterede phosphoprotein udtryk, specielt ændret p4EBP1 og pSRC, samt ændrede spredning analyseret af Ki67 IHC. Ændrede p4EBP1 udtryk blev ligeledes påvist i 24 h menneskelige NSCLC og prostatakræft skær kulturer (Narhi mfl., supplerende figur S3B-S3C, S5 og S7)26. Disse resultater støtter, at sammenligning af kulturperler skiver med deres nærmeste 0 h ukultiveret skive er kritisk at vurdere bevaring af i situ tumor funktioner i kulturperler skiver.
Trods forbedre rentabiliteten af organotypic skiver25, er der begrænsninger med rotator system med hensyn til tekniske detaljer. Placere væv skiver på titanium gitre er mere udfordrende i forhold til at filtrere skær, og en roterende inkubation enhed muligvis ikke tilgængelige. Som et alternativ, stagnerende filter understøtter kan bruges, men i så fald kun den luft-udsatte side af skiver bør analyseres, som til luftfilter gradienter i levedygtighed og hypoxi målt ved HIF1α udtryk er hurtigt dannet i filter-støttede skive kulturer (Davies et al., figur 5 og figur 7A-7B)25. Vi har yderligere vist, at tumor skive kulturer kan udstille ændrede spredning og muterede signaling aktiviteter i forhold til deres oprindelige tumorer26, muligvis på grund af sårheling svar eller metaboliske tilpasning af skiver til ex vivo kultur32. Skønt brutto morfologiske træk af murine NSCLC tumorer blev opretholdt under 72 h dyrkning, kan kultur-induceret proliferativ ændringer påvirke præcis klassificering af de dyrkede skiver. Væv skiver bør således kun udnyttes til kortsigtede funktionelle studier.
Brug af en roterende inkubation enhed redder i det mindste delvist intra-skive levedygtighed eller biomarkør udtryk forløb, især i de første 24 timer af kultur. Når validerede for integritet og funktion, giver dette vævet materiale til funktionelle studier, såsom narkotika behandling undersøgelser. Ud over drug svar profilering, ændrede målet udtryk efter narkotikabehandling kan også drage fordel antistof validering. Dette er især relevant for påvisning af murine epitoper med musen monoklonale antistoffer, som disse har tendens til at give høj farvning baggrund. Derudover er godt validerede antistoffer forpligtet til at opnå en pålidelig og reproducerbar data i diagnostiske og kliniske indstillinger. Således giver graduering af overflod eller fosforylering af relevante epitoper efter narkotikabehandling i væv skiver en handy praktiske anvendelse i antistof validering. En stor fordel ved tumor skive kulturer er muligheden for at model rumligt distribueret funktioner, herunder muterede signaling aktiviteter eller narkotika svar i tumor eller stromale celler, hvilket gør dem en attraktiv ex vivo -model. Men skiver roterer under dyrkning, og processen med dyrkning kan yderligere skade væv især på kanterne. Det er derfor udfordrende at netop overlay biomarkør-farvede IHC billeder af 0 h skiver med regionerne nekrotisk opdaget i kulturperler skiver, som bringer evnen hen til netop link rumlige biomarkør aktiviteter til narkotika svar. Derudover er tumor-iboende, kultur-induceret og narkotika-induceret nekrotisk svar umulig at skelne mindst i murine NSCLC væv skiver, at kompromittere nøjagtig kvantificering af fysisk stof svar. Endelig tillader brugen af tumor skive kulturer en forsker på prøve flere forbindelser på samme tumor, uden behov for at behandle dyrene, dermed raffinering, reducere og erstatte forsøg med laboratoriedyr.
Som en fremtidig anvendelse, kan den beskrevne protokol vedtages til klinisk solid tumor prøver. Yderligere er væv Typeafhængige ændringer eller optimeringer sandsynligvis kræves, begyndende med justeringer af vibratome indstillingerne herunder skive tykkelse og vibration hastighed til at optimere disse for tumor tekstur eller stivhed. Derudover kan næringsstof og vækstfaktor krav variere for forskellige tumor væv. Som et eksempel, har været kulturperler bryst kræft skiver med insulin suppleret i medium13,18. At begrænset væv materiale er fremstillet under operation eller biopsi, optimering af patient-afledte tumor skive kulturer kan være en udfordring på grund af vanskeligheder med at få tilstrækkelig antal Kontraprøverne, der udtages. Desuden er data reproducerbarhed også udfordret af udtales patient til patient prøve heterogenitet, især i procentdelen af tumorceller versus fibrotisk regioner eller stromale infiltrater, samt nekrotisk væv komponenter. Endelig ville anvendelsen af tumor skiver i diagnostisk indstillinger kræver undersøgelse af det omfang, som lægemidlet svar i Skive explants forbehandling biopsier svarer til efterbehandling i vivo svar.

Solid tumor væv, herunder lungekræft, udstille genetiske og fænotypiske heterogenitet og havnen komplekse microenvironments1,2. Samspillet mellem tumorceller og deres omgivende mikromiljø indflydelse på stof følsomhed og modstand mekanismer3. Dette understreger behovet for prækliniske modeller, der kan præcist model biologiske kompleksitet og funktioner optræder i native tumorer. Præcision-cut skiver straks afledt af frisk tumorer give en unik ressource, som de har en vigtigste evne til at repræsentere i vivo biologi, i det mindste for en kort vindue af tid, herunder fænotyper rumligt distribueret i en individuel tumor. Resektion kliniske tumorer er en af de få personlige enheder, som kan fås fra en kræftpatient, og deres diagnostisk brug fortjener kontrol.
Historien om organotypic kulturer kan dateres tilbage til det tidligt 19. århundrede, hvor menneskelige intrakranielle tumorer var hånd-cut i væv stykker og kulturperler, ved hjælp af den såkaldte hængende slip-metoden. Væv fragmenter var knyttet til en coverslip og lov til at dyppe i heparinized humant plasma, hvorefter coverslips var omvendt, forseglet og kulturperler for flere uger4. Manuelt skære svulsten stykker har siden været kulturperler ved hjælp af en række andre metoder, som på plasma blodpropper5, i flydende medier6, eller på 0,45 µm pore størrelse filtre6. Udtrykket "organotypic" blev første gang brugt i 1954, i en undersøgelse af retinale differentiering af kylling embryo øje7. Dette blev efterfulgt af undersøgelser, der anvendte lunge og hjerte væv explants stammer fra chick embryoner8, og hjernen explants fra voksne rotter9.
Forskellige udskæring metoder har været beskrevet, nemlig manuel choppers10,11, Krumdieck væv slicer12,13og vibratomes11,14,15, 16. Krumdieck væv slicer genererer cylindrisk væv kerner, som er derefter skåret i cirkulære væv skiver ved hjælp af en mikrotom. En vibratome, på den anden side bruger en vibrerende klinge mikrotomen. I en undersøgelse på leveren skiver, blev det vist, at Leica vibratome genererer mere reproducerbare og konsekvent skiver sammenlignet med Krumdieck slicer15. Skive tykkelser spænder fra 250 til 500 µm er blevet brugt, og undersøgelser rapport vedligeholdelse af levedygtighed og morfologiske funktioner selv indtil 16 dage14,10,17,18. Dog tumorer har variabel metaboliske profiler, der kan påvirke næringsstofbehov og parametre såsom væv stivhed og matrix sammensætning kan påvirke på beluftning og næringsstof flow. Det er derfor sandsynligt, at hver vævstype kræver optimering af udskæring og kultur.
Forskellige dyrkningsmetoder, der er blevet brugt til at støtte skive kulturer: Jeg) stationære interphase kultur, også kaldet stagnerende støtte kultur, hvor skiver placeres på toppen af en semi-porøse membran indsætte nedsænket i dyrkningsmediet. I denne, er toppen af skiver udsat for luft, mens nederst er suppleret med næringsstoffer via den porøse Indsæt14,19; II) den murske metode, oprindeligt udviklet til kultur hele organer eller embryonale væv skiver. I denne, skiver placeres oven på en bomuld ark eller filter understøttes af en metal gitter og filteret er gennemblødt i dyrkningsmediet. For at holde væv fugtig, føjes et tyndt lag af medium oven på skiver20,21,22. De første to er så kaldet air-liquid interphase kulturer; III) rulle tube kulturer, hvor skiver er placeret inde den flade side af et plastikrør, som indeholder medium, og langsomt rør rotation sikrer at vævet er dækket med medium under den første del af en cyklus, eller tilsat kulsyre under den anden23; IV) roterende inkubation enheder, hvor skiver er intermitterende udsat til medium med næringsstoffer og beluftning. Forskellige fra roller rør, i denne metode skiver er placeret på toppen af porøse titanium gitre placeret i 6-godt plader med næringssubstratet24.
Væv skiver stammer fra resektion solide tumorer logisk stede en attraktiv ex vivo model til at teste behandlingsrespons af anticancer-midler, som de tillader vurdering af levedygtighed, målrettet pathway aktivitet og molekylær profiler af en bestemt tumor i nærværelse af dens oprindelige tumor mikromiljø. For at vurdere, om stoffet svar målt i tumor skiver er forprogrammeret i situ svar, er det imidlertid vigtigt at vurdere, i hvilken udstrækning væv skiver bevare tumor-specifikke biologiske funktioner såsom celleproliferation, histopatologisk-specifikke Celledifferentiering eller muterede signaling aktiviteter. Virkningen af mekanisk stress fremkaldte under skive forberedelse, Skive håndtering eller kultur-induceret tilpasninger på både kvalitet og biologiske funktioner af væv skiver er grundlæggende spørgsmål, tæt forbundet med evnen til at gennemføre tumor-afledte skiver til funktionelle diagnostik.
Vores IMI-finansieret konsortium projekt PREDECT (http://www.predect.eu) sætter til systematisk adresse disse grundlæggende spørgsmål, ved at studere skive explants fra en række kilder. Bruger skiver stammer fra bryst-, prostata- og lunge cancer modeller, udnyttet denne fælles indsats kvalitative udlæsning samt kvantitative hæmatoxylin og eosin (H & E) - baseret udlæsninger at demonstrere et krav om atmosfæriske ilt og stagnerende filter understøtter for at opretholde rentabiliteten af kulturperler skiver indtil 72 h. Derudover Immunhistokemi (IHC) analyser på kulturperler skiver afslørede intra-skive levedygtighed gradienter, fremgår som nekrose gradienter i skiver afledt af murine ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), østrogen receptor (ER), HIF1α og γH2AX gradienter i bryst kræft skiver, eller androgen receptor (AR) udtryk gradienter i prostata cancer skiver25. Interessant, intra-skive levedygtighed gradienter i 24 h kulturer af murine NSCLC blev reddet af dyrkning i en roterende enhed, inkubation, og vores seneste undersøgelse viste, at rentabiliteten blev udvidet til 72 h26. Især oversiden forblev mest levedygtige26, godkende, at narkotika respons analyser på skiver er bedst foretages på denne side af væv.
Selv om det fortsat er et spørgsmål, hvordan langt væv skiver kan sammenfatte i situ tumor funktioner, de har været flittigt brugt til at teste svar til anticancer-midler, herunder målrettede lægemidler, monoklonale antistoffer og kemoterapi agenter 10,11,13,14,18,27. Vi viste for nylig at murine NSCLC skiver Vis dynamiske ændringer i udbredelsen og muterede signaling aktiviteter efter dyrkning når sammenlignet med frisk skåret 0 h skiver26. Dette indikerer, at det er vigtigt at undersøge, om de målrettede i situ biologiske funktioner bevares korrekt under dyrkning, før undertrykkelse af netbårne undersøgelser. Trods disse resultater viste vi, at tumor skiver kan model rumlige svar på målrettede behandlinger, midt drug behandlinger forbliver kort (24 h) og indledes i begyndelsen af dyrkning af26. Følgende protokol beskriver vigtige validering aspekter relevante til oprettelse og analyse af tumor skive kulturer, forud for deres anvendelse i farmakologiske dopingkontrol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic primære væv eksplantat kulturer, som omfatter præcision-cut skiver, repræsenterer tre-dimensionelle (3-D) væv arkitektur samt de flercellede interaktioner af indfødte væv. Væv skiver straks skæres fra frisk resektion tumorer bevare rumlige aspekter af intratumor heterogenitet, hvilket gør dem nyttige surrogater i vivo biologi. Omhyggelig med optimering af væv skive forberedelse og dyrkning betingelser er grundlæggende for den prædiktive diagnostiske potentiale af tumor skive explants. I denne henseende er murine modeller værdifulde, da disse giver en konsekvent strøm af tumor materiale til at udføre replikat og reproducerbare eksperimenter. Denne protokol beskriver dyrkning af murine lunge tumor-afledte væv skiver ved hjælp af en roterende inkubation enhed, et system, der giver mulighed for periodisk eksponering af væv til ilt og næringsstoffer. Vores tidligere arbejde viste, at brug af roterende inkubation enheder forbedrer levedygtigheden af væv i forhold til andre metoder til kultur, navnlig flydende skiver og stagnerende filter understøtter. Her viser vi yderligere, at skive tykkelse påvirker levedygtigheden af kulturperler skiver, tyder på, at optimering af skive tykkelse skal gøres for forskellige vævstyper. Udtales ITH i relevante muterede funktioner, såsom at signalere aktiviteter, stromale celle infiltration eller udtryk for differentiering markører, nødvendiggør evaluering af tilstødende væv skiver for udtryk markører ændret af narkotikabehandling eller dyrkning, selv. Sammenfattende denne protokol beskriver generation af murine lunge tumor skiver og deres kultur på en roterende inkubation enhed og demonstrerer, hvordan skiver systematisk bør analyseres for udtryk for heterogen væv markører, som en forudsætning forud for drug svar undersøgelser.

Figur 1 repræsenterer arbejdsgangen for den generation, dyrkning og analyse af præcision-cut væv skiver afledt af murine NSCLC tumorer. For denne demonstration udnyttede vi tumorer fra gensplejsede musemodel (CLAUSS) husly betinget aktivering af KrasG12D sammen med tabet af Lkb1 (også kendt som Serin/Threonin Kinase 11), herefter kaldet KL. Musen avl og lunge tumor indledningen blev udført som beskrevet i26,28. Figur 2A viser effekten af væv skive tykkelse på levedygtigheden af skiver kulturperler i 24 timer ved hjælp af en roterende inkubation enhed. Resultaterne viser, at 160 µm tynde skiver indeholder store nekrotiske områder på tværs af udsnittet. Derudover viser 250 µm tynde skiver en nekrose gradient på tværs af udsnittet i forhold til 200 µm tynde skiver. Det er sandsynligt, at den fattige overordnede rentabilitet af de tyndeste 160 µm er forårsaget af tekniske håndtering under placering af skiver på toppen af gitre, da disse er skrøbelige og har tendens til at krølle. På den anden side når skiver er for tyk, kan de blive udsat for mangler i ilt eller næringsstoffer diffusion på tværs i skiver, fremgår som i murine NSCLC explants som nekrotisk død gradient25. Dog skal det bemærkes, at skiver med varierende tykkelser kan genereres fra en tumor, trods anvendelse af identiske vibratome indstillinger. Det anbefales derfor at analysere flere gentagelser fra forskellige tumor prøver. Vigtigere, kræver hver vævstype skive tykkelse optimering til at opnå maksimal rentabilitet, som væv tekstur og hårdhed kan påvirke iltning og næringsstof flow. Figur 2B -2C illustrerer kvantitative IHC analyser af NKX2-1 udtryk, en markør for godt differentieret lunge adenocarcinom (AC) i prøver dyrkes op til 72 h og matches 0 h skiver. Resultaterne viser, at NKX2-1 udtryk ikke er væsentligt ændret i kulturperler skiver i forhold til 0 h ukultiveret skiver, tyder på, at processen med dyrkning ikke åbenlyst påvirker differentiering status af AC tumor væv. Figur 2D viser nytten af tumor væv skiver for at vurdere effektiviteten af målrettede lægemidler. Vi viste for nylig at Kras mutant murine ACs udstille højt udtryk af fosforyleres ERK1/2 (mærkning øget MAPK pathway aktivitet) i forhold til adenosquamous (ASC) tumorer, mens udtryk af fosforyleres 4EBP1 (mærkning mTOR aktivitet ) er ligeledes udtrykt i både AC og ASC tumorer. For at teste, hvis disse veje kan målrettes effektivt mod væv skiver, KL AC væv skiver blev behandlet med DMSO eller titreres mængder af forbindelser, nemlig 0,1-1 µM dactolisib at målrette mTOR sti eller 0,05 – 0,5 µM selumetinib at målrette MAPK pathway. Resultaterne viser, at 1 µM dactolisib eller 0,5 µM af selumetinib er effektive til at hæmme fosforylering af 4EBP1 eller ERK1/2, henholdsvis. Derudover angiver dosisafhængig hæmning af de målrettede fosfoproteiner, at væv skiver kan også bruges til at validere fosforylering-specifikke antistoffer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figur 1: skematisk fremstilling af arbejdsgangen til oprettelse og analyse af murine NSCLC tumor-afledte skive explants. (A) skematisk beskrive indsamling og udarbejdelse af tumor-bærende lungerne for udskæring. Lunge fliger er høstet fra en mus og tumor væv er dissekeret fra normale væv. Sort pilespids og stjerne angiver ca 4 mm og 1 mm tumorer, henholdsvis. Den hvide pilespids angiver lungevæv Limes til overfladen af prøveholder. De røde pil peger på et ekstra stykke af normal lungevæv støtte til at bevare tumor i en oprejst position. (B) Vibratome udskæring og indsamling af væv skiver. Hvid pil angiver retningen udskæring. Samling af sekventielle skiver til en 24-godt plade der indeholder kold HBSS + P/S. Skiver kan enten være kulturperler for forskellige tidspunkter (her, 24-72 timer) at vurdere tumor-specifik markør udtryk under dyrkning (øverste række), eller kan bruges til at udføre lægemiddelsbehandlinger. C: køretøj kontrol, T: narkotikabehandling. (C) placere væv skive for dyrkning ved hjælp af roterende inkubation enheder. Tilt 6-godt plade, så nogle medium dækker toppen af nettet, placere væv skive i midten af gitter oven på mellemlang og sprede skive med pincet. Sikre, at 6-godt plader vægt afbalanceret til en glat rotation cyklus. X: angiver forkert, og <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: angiver korrekt placering af skive. (D) fotografi af FFPE blok af en tumor skive. Sort pil peger på paraffin-embedded væv skive farves med hæmatoxylin. (E) skemaer viser skæring rækkefølgen af skiver i FFPE blokke; disse sektioner kan behandles for at vurdere væv levedygtighed og tumor-specifik biomarkør udtryk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figur 2: vurdering af levedygtighed og histotype-specifikke markør udtryk og målrettet behandling på NSCLC væv skiver. (A) repræsentant H & E billeder af AC NSCLC skiver af de angivne kulturperler for 24 h. 200 µm tynde skiver opretholde bedre levedygtighed i forhold til 160 µm eller 250 µm tynde skiver. Mørkeblå repræsenterer H & E farves levedygtige væv, og pink angiver pseudocolored nekrotisk regioner. Lyseblå angiver regioner udelukket fra analyse, enten på grund af dårlig væv kvalitet eller tilstedeværelsen af fibrøst stroma. T1 og T2 repræsenterer biologiske replikater stammer fra to forskellige tumorer. Skalalinjen = 500 µm. (B) repræsentative IHC billeder af NKX2-1 udtryk i AC skiver kulturperler for de angivne tidspunkter. Pilen angiver det område vises i højere forstørrelse. Resultaterne viser, at NKX2-1 udtryk ikke er ændret i kulturperler skiver i forhold til 0 h skiver. Skalalinjen = 500 µm og 50 µm for lave og høje forstørrelser, henholdsvis. (C) kvantificering af de data, der vises i (B). (D) repræsentant IHC billeder af fosforyleres 4EBP1 eller pERK1/2 udtryk i 0 h skiver eller skiver behandlet med DMSO titreres mængder af dactolisib (dact, øverste række) eller fosforyleret pERK1/2 udtryk i 0 h, eller udsnit behandlet med DMSO eller selumetinib (sel, nederste række). Sort firkantede kasser angiver områder vist i højere forstørrelse. Skalalinjen = 1 mm eller 50 µm til lav eller høj forstørrelse, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Vi leverer en metode for generation, dyrkning og systematisk analyse af organotypic skiver afledt af murine lunge tumorer. Vi beskriver også, hvordan du optimerer til skive tykkelse, og hvordan du vælger stof koncentrationer til behandling af tumor skiver.

Oprettelse og analyse af Tumor skive Explants som en forudsætning for diagnostiske test

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i præklinisk forskning, hvor narkotika respons undersøgelser i tumor skive explants kan tjene diagnostiske formål. Den største fordel ved denne teknik er, at skive explants kan for et kort vindue af tid model den komplekse biologi indfødte væv, herunder rumligt fordelte funktioner. Selv om denne metode kan give indsigt i brugen af skiver fra murine lungetumorer, Det kan også anvendes til andre vævstyper, herunder humane væv.Til at begynde, forberede vibratome og udføre en VibraCheck i henhold til instruktionerne i manualen. Fyld derefter hver brønd af 24-brøndpladen med en milliliter af Hanks Balanced saltopløsning suppleret med penicillin og streptomycin og hold pladen på is. Indsæt 25-gauge nåle i alle fire poter af en aflivet mus placeret på en styrofoam låg, således at brystet er udsat, og dyret er strakt.Spray 70% alkohol på overfladen af den eksponerede hud. Brug en saks placeret i en vinklet position til at skære åbne huden fra maven mod brystet og op til halsregionen. Stræk huden på begge sider ved hjælp af snævler og indsæt 25-gauge nåle.Skær maveregionen op. Skær derefter ribbet og mellemgulvet op for at eksponere lungen og hjertet. Udsæt luftrøret ved at skære det omgivende væv væk.Disseker lungerne, sammen med hjertet. Vævene anbringes i et 50-milliliterrør indeholdende 30 milliliter iskold HBSS suppleret med Pen-Strep placeret på is og gå videre til næste trin så hurtigt som muligt. Nu overføre tumor-bærende lunger i en 10-centimeter væv kultur plade.Brug sterile saks og kraftæceser til at adskille lungeflipper og vælge lapper med tumorer på overfladen til udskæring. Placer en lunge lap med en tumorvæv på et stykke filterpapir for at undgå at glide og skære en del af den normale lunge eller yderligere tumorvæv, der omgiver tumoren ved hjælp af en steril skalpel til at generere en flad væv stykke overflade. Dyp den flade side i en dråbe cyanoacrylat lim og montere den på vibratome prøveholderen, så tumoren vender mod bladet i opretstående stilling, og lad det tørre i to til tre minutter.Sæt vibratomholderen i metalbufferbakken. Fyld bakken med kold HBSS suppleret med Pen-Strep, indtil vævet er nedsænket i bufferen. Dæk bufferbakken med plexiglaslåget, der er forsynet med instrumentet, og anslå bakken i et hvidt isbad, og tilsæt is for at holde vævet køligt under udskæringen.Fastgør det hvide isbad til vibratomen. Vælg derefter passende udskæringsindstillinger, og begynd at skære. Bring vibratomebladet til snittepositionen og sæt snittevinduet.Brug sterile pincet til at samle skiverne i en 24-brøndplade fyldt med en milliliter HBSS suppleret med Pen-Strep pr. brønd og holde på is. Mens du holder styr på udskæring orden, markere hver brønd af 24-brønd plade i henhold til den eksperimentelle plan. Saml en vævsskive ved siden af de kultiverede skiver som nul timer eller ukultiv reference.Saml mindst tre referenceskiver for at repræsentere det øverste, midterste og nederste af vævet. Og når udskæringen er afsluttet, fortsætte med fastsættelse og forarbejdning. Derefter forberedes en seks-brøndplade indeholdende 2,5 milliliter kulturmedium pr. brønd ved at placere titaniumgitre i den.Sørg for, at der ikke dannes luftbobler mellem titaniumgitteret og mediet. Hvis du vil lægge et udsnit på gitteret, skal du holde seks-brøndpladen i en vinklet position, så en del af mediet dækker gitteret. Placer derefter skiven i mediet på gitteret, og brug vicesser til at sprede det.Efter at skærene er placeret, lægges de seks brøndplader på den roterende inkubationsenhed, der er placeret inde i en befugtet inkubator, der holdes ved 37 grader Celsius med 95%02 og 5% CO2. Start rotationscyklussen. For langsigtet dyrkning genopbygge kultur medium hver dag ved hjælp af sterile tang til at løfte nettet indeholder væv skiver og placere den i en tom brønd af seks-brønd plade.Erstat 70% af mediet med frisk kultur medium og placere nettet tilbage i. Fortsæt rotationscyklussen som tidligere. For narkotika behandling på tumor skiver tilføje 2,5 milliliter af medier med fortyndet stof eller køretøj kontrol i seks-brøndpladen.Placer titanium gitre i brøndene og derefter placere skiver på gitrene som gjort tidligere. Efter at have udført behandlingerne i 24 timer, fortsætte med fastsættelse og forarbejdning. For at begynde at fastgøre den ønskede skive forsigtigt overføre det ved hjælp af sniver i en 10-centimeter plade, der indeholder en gennemblødt filterpapir fyldt med to til tre milliliter PBS og lad det flyde.Løft derefter filterpapiret ud med et par vicesser og læg det i en histokassette. Overfør filterpapiret til en histokassette. Der tilsættes en dråbe fortyndet hæmatoxylin oven på vævsskivet for at markere skivens placering for de efterfølgende trin.Luk kassetten, og overfør den til 4% neutral buffer formalin opløsning og lad natten over ved fire grader Celsius. Efter vask og behandling af kassetten som beskrevet i protokollen, åbne histo kassette og bruge en skalpel til omhyggeligt at løfte den faste skive fra filterpapiret. Kassér filterpapiret og overfør skiven i en form, der indeholder flydende paraffin.Brug en flad vægt til at trykke vævet mod bunden af indlejringsformen for at sikre en jævn tykkelse. Placer den nederste del af histo kassette på toppen af formen. Tilsæt flydende paraffin oven på den.Og lad formen køle af på en kold tallerken i 30 minutter. Efter at adskille den afkølede mug fra paraffin blok. Brug en mikrotom til at forberede fire-mikrometer tynde dele af FFPE væv skive blokke.Trim væk overskydende paraffin omkring vævet. For at opnå lige sektioner i hele vævet justere vinklen på blokken, således at overfladen af blokken er vandret orienteret med hensyn til bladet. Ved hjælp af en tynd børste indsamle sekventiel væv dele af paraffin-indlejret væv skive starter ved den øverste del af glasset dias.Fortsæt med at indsamle dele af de dybere vævslag til midten, efterfulgt af den nederste del af glasdiasene. Samlingen af sektioner fra forskellige lag af hvert vævsudsnit til objektdiasene sker for at muliggøre optagelse af potentielle kulturinducerede gradienter i levedygtighed, cellemigrering eller biomarkørudtryk. Efter indsamling af sektioner fortsætte med deres behandling og yderligere analyse som beskrevet i protokollen.Væv skive tykkelse kan påvirke levedygtigheden af dyrkede skiver. I dette tilfælde, 250-mikrometer tykke skiver viser øget nekrose gradienter sammenlignet med 200-mikrometer tykke skiver på grund af tykkere skiver bliver tilbøjelige til mangler i ilt eller næringsstof diffusion på tværs af skiver. Men 160-mikrometer tynde skiver indeholder store nekrotiske områder sandsynligvis forårsaget af teknisk håndtering under positionering af skiverne, da disse er skrøbelige og har tendens til at krølle.Analyse af NKX2-1, en markør for godt differentieret lungeadenocarcinom, viser, at dens udtryk ikke ændres væsentligt i dyrkede skiver sammenlignet med nul timers udlede skiver. Kvantitativ analyse af NKX2-1 udtryk bekræftede yderligere, at udtrykket ikke var væsentligt ændret i kultiveret versus eksletiverede skiver, hvilket tyder på, at dyrkningsprocessen ikke synligt påvirker differentieringsstatus for adenocarcinomvæv. At teste, om tumorvæv skiver kan bruges til at vurdere effekten af målrettede lægemidler, de blev behandlet med DMSO eller titrerede mængder af forbindelser.Når det behandles med en mikromolar dactolisib, som er rettet mod mTOR vej fosforylering af 4EBP1 blev hæmmet. 0,5 mikromolar selumetinib, som er rettet mod MAP-kinasevejen, var effektivt til at hæmme fosforylenationen af ERK1/2. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man arbejder med og kritisk analysere skiver frisk skåret fra dyrebare tumorvæv.Vores tidligere postdoc, Katja Narhi, bidrog i høj grad til etableringen af denne metode i samarbejde med kolleger fra IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Brug af BLT Humaniseret Mouse som en stamcelle baseret genterapi tumormodel

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimering af en High Throughput Setup til at studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserede Assay til at studere den Migration af murine Skin dendritiske celler i drænende lymfeknuder Under Infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Anvendelse af kapsler til negativ farvning af virale prøver inden for biokonduktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse af 18FDG PET/CT billeddannelse som et redskab til at studere Mycobacterium tuberculosis infektion og behandling i ikke-menneskelige primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus specifikke diagnostiske epitop opdagelse

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening-værktøjer for identifikation af Viral hæmmende og vært Antiviral faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...