Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Dit onderzoek werk ontvangen financiële steun van innovatieve geneesmiddelen gemeenschappelijke onderneming voor het initiatief verlenen overeenkomst no 115188, de Universiteit van Helsinki Doctoral programma biogeneeskunde beurzen (A.S.N.) en de Sigrid Juselius en Orion-Farmos stichtingen (E.W.V.). Wij bedanken onze PREDECT weefsel segment platform Consortiumleden (Taija af Hällström en Siv Knaappila voor steun bij het opzetten van de rotator-systeem en Riku Turkki voor ondersteuning bij de MATLAB-analyse. Jouko Siro is bedankte voor het vastleggen van de foto's van figuur 1. Wij danken het team FIMM WebMicroscope voor het scannen van de histologische dia's, en ondersteuning van het laboratorium dier centrum voor veeteelt.

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Auteurs verklaren geen belangenconflict.

Verschillende complexe in vitro tumor modellen, waaronder 3D culturen en organoids, zijn ontwikkeld om te recapituleren, de architectuur en oncogene functies van in vivo tumor weefsel29,30. Echter, de totstandbrenging van 3D culturen of organoids inhoudt weefsel dissociatie en selectieve groei van een eencellige type of co cultuur van een select aantal celtypes in een kunstmatige omgeving. Dientengevolge, vangen dergelijke modellen onvolledig de fijne kneepjes van tumor heterogeniteit en tumor-stroma interacties. Organotypic tumor segmenten, aan de andere kant, handhaven de weefsel architectuur en biologische complexiteit van de in situ tumor, zonder uitgebreide manipulatie. Dit vermogen van weefsel segmenten model tumorcellen in hun eigen communicatie maakt hen bijzonder aantrekkelijk voor preklinische studies. We eerder gemeld een geoptimaliseerde workflow voor de vaststelling en analyse van precisie-cut tumor segmenten, en toonde aan dat, in vergelijking met filter ondersteunt, een roterende incubatie-eenheid verbetering van de levensvatbaarheid van korte termijn lymfkliertest NKCLK segment culturen25 , 31. echter, teelt op roterende eenheden is technisch uitdagende en vereist een voortdurende controle. Wij presenteren hier een protocol voor tumor weefsel segment generatie en praktische gebruik van een roterende incubatie eenheid tot cultuur hen, evenals begeleidende methoden voor het controleren van de mogelijkheid van segmenten te vangen in situ tumor biologie, een voorwaarde voorafgaand aan drugs reactie testen.
Verschillende kritische stappen in het protocol garanderen van weefsel integriteit en levensvatbaarheid van de segmenten van de tumor. Als normale longweefsel de tumor omringt, kan de vibratome genereren segmenten met inconsistente dikte of schade van de segmenten, als gevolg van verschillen in textuur en stijfheid tussen normaal en tumor weefsels. Het is dus belangrijk om te verwijderen van het omliggende normale longweefsel vóór de tumor snijden. Een andere belangrijke stap is het snijden dikte, en die zorgvuldig moet worden geoptimaliseerd voor elk weefseltype. Bovendien, zodra gesneden, is het essentieel dat het segment ongeveer in het midden van het raster ligt, om zo ervoor te zorgen nauwkeurige intermitterende dompelen in cultuurmedium en zuurstof blootstelling. Tenslotte is het belangrijk dat u de positie van een segment volgt tijdens de geldigheidsduur van de rotatie, als een segment kan drop down in aan het medium; Als dit gebeurt, kunnen verdere acties worden ondernomen zoals beschreven in stap 3.6 van het protocol.
Naast weefsel die verwerken te verzekeren van de integriteit, zijn er ook kritische stappen in de analyse van de IHC te interpreteren hoe het segment lijkt op het oorspronkelijke weefsel. Onze vorige studie toonde aan dat lymfkliertest NKCLK tumoren tot ruimtelijke heterogeniteit uitgesproken intra-tumor in oncogene signalering activiteiten26 vertonen. Dit betekent dat het gebruik van ruimtelijk gescheiden weefsel voor besturingselementen segmenten of drug-behandelde monsters kunnen invloed hebben op betrouwbare experimentele data interpretatie, en vandaar nauw aangrenzende segmenten moeten worden gebruikt als besturingselementen en proefmonsters. We toonden dat verder terwijl proliferatie of oncogene phosphoprotein expressie in vers gesneden onbeschaafd 0 h plakjes waren vergelijkbaar met in situ tumoren, gekweekte segmenten toonde veranderde oncogene phosphoprotein expressie, specifiek veranderde p4EBP1 en pSRC, evenals gewijzigde proliferatie geanalyseerd door Ki67 IHC. Gewijzigde p4EBP1 expressie is ook aangetroffen in 24 h menselijke NKCLK en prostaatkanker slice culturen (Narhi et al.., aanvullende figuur S3B-S3C, S5 en S7)26. Deze bevindingen onderschrijven dat vergelijking van gekweekte segmenten met hun dichtstbijzijnde 0 h onbeschaafd segment cruciaal is voor het behoud van in situ tumor functies in gekweekte plakjes beoordelen.
Ondanks de verbetering van de levensvatbaarheid van organotypic plakjes25, zijn er beperkingen met de rotator-systeem in termen van technische details. Plaatsen van de plakjes weefsel op titanium rasters is moeilijker in vergelijking met filteren inzetstukken en een roterende incubatie-eenheid mogelijk niet beschikbaar. Als alternatief, stagnerende filter ondersteunt kunnen worden gebruikt, maar in dat geval alleen de lucht-blootgesteld kant van de segmenten moet worden geanalyseerd, zoals lucht-naar-filter verlopen in de levensvatbaarheid en hypoxie gemeten door HIF1α expressie worden snel gevormd in filter-ondersteunde segment culturen (Davies et al.., figuur 5 en figuur 7A-7B)25. We hebben verder aangetoond dat de tumor segment culturen vertonen kunnen veranderde proliferatie en oncogene signalering activiteiten ten opzichte van hun inheemse tumoren26, mogelijk vanwege de wondgenezing reacties of metabole aanpassing van de segmenten ex vivo 32cultuur. Hoewel bruto morfologische kenmerken van de lymfkliertest NKCLK tumoren werden onderhouden tijdens 72 h teelt, kan cultuur-geïnduceerde proliferatieve wijzigingen nauwkeurige sortering van de gecultiveerde segmenten. Dus, weefsel segmenten moeten alleen worden gebruikt voor korte termijn functionele studies.
Gebruik van een roterende incubatie-eenheid redt op zijn minst gedeeltelijk intra-delige levensvatbaarheid of biomerker expressie verlopen, met name tijdens de eerste 24 h van cultuur. Eenmaal gevalideerd voor integriteit en functie, biedt dit weefsel materiaal voor functionele studies, zoals drug behandeling studies. Naast de reactie drugsprofielen, kan gewijzigde doelwit expressie na medicamenteuze behandeling ook profiteren van antilichaam validatie. Dit is vooral relevant voor de detectie van lymfkliertest epitopen met muis monoklonale antilichamen, omdat deze de neiging om hoge kleuring achtergrond geven. Bovendien, zijn goed gevalideerde antilichamen noodzakelijk om betrouwbare en reproduceerbare gegevens in diagnostische en klinische instellingen. Modulatie van de overvloed of fosforylatie van relevante epitopes na medicamenteuze behandeling in weefsels plakjes biedt dus een handige praktische toepassing in antilichaam validatie. Een groot voordeel van tumor segment culturen is de mogelijkheid om model ruimtelijk-verdeelde functies, met inbegrip van oncogene signalering activiteiten of drug reactie in de tumor of stromale cellen, waardoor ze een aantrekkelijke ex vivo -model. Echter segmenten draaien tijdens de teelt, en het proces van de teelt kan verdere schade aan het weefsel met name aan de randen. Het is daarom uitdagend op juist overlay de biomerker gebeitste IHC beelden van 0 h segmenten met de necrotische regio's ontdekt in gekweekte plakjes, die de mogelijkheid maken juist ruimtelijke biomerker activiteiten naar een reactie van de drug in het gedrang brengt. Daarnaast, zijn tumor-intrinsieke-, cultuur-geïnduceerde en drug-geïnduceerde necrotische reacties niet te onderscheiden ten minste in lymfkliertest NKCLK weefsel segmenten, nauwkeurige kwantificatie van ruimtelijke drug reacties in gevaar te brengen. Tot slot, het gebruik van tumor segment culturen toelaat een onderzoeker aan de test meerdere verbindingen op de dezelfde tumor, zonder de noodzaak voor de behandeling van dieren, dus verfijnen, verminderen en experimenten met proefdieren vervangen.
Als een toekomstige toepassing, kan het protocol beschreven klinische solide tumor monsters worden vastgesteld. Verder zijn leveringsoptimalisatie of weefsel type-afhankelijke wijzigingen waarschijnlijk nodig, beginnend met de aanpassingen aan de instellingen van de vibratome met inbegrip van segment dikte en trillingen snelheid optimaliseren deze voor tumor textuur of stijfheid. Daarnaast kan nutriënt en groeifactor eis variëren voor verschillende tumor weefsels. Als voorbeeld hebben borst kanker segmenten zijn gekweekt met insuline aangevuld in de middelgrote13,-18. Gezien het feit dat beperkte weefsel materiaal wordt verkregen tijdens chirurgie of biopsie, kan optimalisatie van patiënt-afgeleide tumor segment culturen lastig zijn als gevolg van moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende aantallen monsters. Bovendien, reproduceerbaarheid van de gegevens is ook uitgedaagd door uitgesproken patiënt-te-patiënt voorbeeld heterogeniteit, met name in het percentage van tumorcellen versus fibrotische regio's of stromale infiltreert, alsmede onderdelen van necrotisch weefsel. Ten slotte zou de toepassing van tumor segmenten in Diagnostische instellingen onderzoek van de omvang aan welke drug reacties in segment explantaten voor de voorbehandeling biopsieën wedstrijden aan nabehandeling in vivo reacties vereisen.

Solide tumor weefsel, met inbegrip van longkanker, genetische en fenotypische heterogeniteit vertonen, en haven van complexe microenvironments1,2. Het samenspel tussen de tumorcellen en hun omliggende communicatie invloed op drug gevoeligheid en resistentie mechanismen3. Dit wijst op de noodzaak voor preklinische modellen die kan nauwkeurig model van biologische complexiteit en functies handelen in native tumoren. Precisie-cut segmenten direct afgeleid van verse tumoren bieden een unieke bron, zoals ze een belangrijkste capaciteit om te vertegenwoordigen in vivo biologie, ten minste voor een korte venster van tijd hebben, met inbegrip van fenotypen ruimtelijk verspreid in een individuele tumor. Gereseceerd klinische tumoren zijn een van de paar gepersonaliseerde specimens die kunnen worden verkregen bij een kankerpatiënt, en hun diagnostisch gebruik verdient toetsing.
De geschiedenis van organotypic culturen dateert uit het begin 19e eeuw, toen de menselijke intracraniële tumoren waren hand-cut in weefsel stukjes en gekweekte met behulp van de zogenaamde opknoping drop, methode. Weefsel fragmenten werden gekoppeld aan een dekglaasje aan en kunnen duik in EDTA menselijk plasma, waarna de coverslips werden omgekeerd, verzegeld en gekweekte voor verscheidene weken4. Handmatig snijden tumor stukken hebben sinds gekweekt met behulp van een verscheidenheid van andere methoden, zoals op plasma stolsels5, in vloeibare media6, of op 0,45 µm porie grootte filters6. De term "organotypic" werd voor het eerst gebruikt in 1954, in een studie over retinale differentiatie van de chick embryo oog7. Dit werd gevolgd door studies die longen en hart weefsel explantaten afgeleid van chick embryo's8en hersenen explantaten van volwassen ratten9gebruikt.
Verschillende segmenteringshulplijnen methoden zijn beschreven, namelijk handmatig choppers10,11, Krumdieck weefsel slicer12,13en vibratomes11,14,15, 16. De Krumdieck weefsel slicer genereert cilindrische weefsel kernen, die vervolgens worden gesneden in plakjes van de circulaire weefsel gebruikend microtome. Een vibratome, aan de andere kant, maakt gebruik van een vibrerende microtoom blade. In een studie over de lever segmenten, werd aangetoond dat de Leica-vibratome meer reproduceerbare en consistente segmenten in vergelijking met de Krumdieck snijmachine15 genereert. Segment diktes variërend van 250 tot 500 µm zijn opgebruikt, en studies rapporteren onderhoud van uitvoerbaarheid en morfologische kenmerken zelfs tot 16 dagen14,10,17,18. Echter tumoren variabele metabolische profielen die voedingsstof eisen kunnen beïnvloeden, en parameters zoals weefsel stijfheid en matrix samenstelling kunnen invloed hebben op beluchting en nutriënten stroom. Het is daarom waarschijnlijk dat elk weefseltype optimalisatie van snijden en cultuur voorwaarden vereist.
Verschillende cultivatiemethoden zijn gebruikt ter ondersteuning van segment culturen: ik) stationaire interfase cultuur, een afkorting voor stagnerende ondersteuning cultuur, waarin segmenten worden geplaatst op de top van een semi-poreuze membraan invoegen ondergedompeld in het kweekmedium. In deze, wordt de top van de segmenten blootgesteld aan de lucht, terwijl de onderkant wordt aangevuld met voedingsstoffen via de poreuze invoegen14,19; II) de methode Troffel, oorspronkelijk ontwikkeld om cultuur hele organen of embryonaal weefsel segmenten. In deze segmenten worden geplaatst op de top van een blad van katoen of filter ondersteund door een metalen rooster en het filter is gedrenkt in het kweekmedium. Om het weefsel vochtig, wordt een dunne laag van medium toegevoegd op de top van de segmenten20,21,22. Deze eerste twee zijn zogenaamde lucht-liquid interfase culturen; III) roller buis culturen, waarin segmenten worden geplaatst binnen de platte kant van een plastic buis met middellange en langzame buis rotatie zorgt ervoor dat het weefsel is bedekt met middellange tijdens het eerste deel van de cyclus of tijdens de tweede23 belucht; IV) roterende incubatie eenheden, die segmenten met tussenpozen worden blootgesteld aan medium met voedingsstoffen en beluchting. Anders dan roller buizen, in deze methode segmenten worden geplaatst op de top van poreuze titanium rasters in 6-Wells-platen met voedingsbodem24geplaatst.
Weefsel segmenten afgeleid van gereseceerd stevige tumors logisch aanwezig een aantrekkelijke ex vivo model waarin voor het testen van de reactie van de behandeling van anti-kanker agenten, zoals zij toestaan dat de evaluatie van levensvatbaarheid, gerichte traject activiteit, en Moleculaire profielen van een specifieke tumor in aanwezigheid van de oorspronkelijke tumor communicatie. Om te beoordelen of de reacties van de drug gemeten in tumor segmenten voorspellende van in situ reacties zijn, is het echter belangrijk om te beoordelen in welke mate weefsel segmenten tumor-specifieke biologische functies zoals celproliferatie behouden, histopathologisch onderzoek-specifieke celdifferentiatie of oncogene signalering activiteiten. De gevolgen van mechanische stress ontlokte tijdens segment voorbereiding, segment behandeling of cultuur-geïnduceerde aanpassingen voor zowel de kwaliteit en de biologische functies van weefsel segmenten zijn fundamentele vragen, strak gekoppeld aan de mogelijkheid om de tumor afkomstige segmenten voor functionele diagnostiek.
Onze consortium IMI-gefinancierd project PREDECT (http://www.predect.eu) wordt systematisch adres deze fundamentele vragen, door het bestuderen van segment explantaten uit een verscheidenheid van bronnen. Segmenten die zijn afgeleid van borst-, prostaat- en longkanker-kanker-modellen te gebruiken, deze gezamenlijke inspanning gebruikt kwalitatieve read-outs evenals kwantitatieve haematoxyline en eosine (H & E) - gebaseerd uitlezingen om aan te tonen van een vereiste voor atmosferische zuurstof en stagnerende filter steunt om te houden van de levensvatbaarheid van gekweekte segmenten tot 72 uur. Bovendien, immunohistochemistry (IHC) analyses op gekweekte segmenten geopenbaard intra-delige levensvatbaarheid verlopen, blijkt als necrose verlopen in plakjes afgeleid van lymfkliertest niet-kleincellige longkanker (NKCLK), oestrogeen receptor (ER), HIF1α en γH2AX kleurovergangen in borst kanker plakjes of androgeen receptor (AR) expressie verlopen in prostaatkanker segmenten25. Interessant, intra-delige levensvatbaarheid verlopen in 24 h culturen van lymfkliertest NKCLK werden gered door de teelt in een roterende incubatie-eenheid, en onze recente studie toonde aan dat de levensvatbaarheid werd uitgebreid tot 72 h26. Met name de bovenzijde bleef meest haalbare26, onderschrijven dat drug reactie op segmenten zijn beste analyses uitvoeren aan deze kant van het weefsel.
Ook al blijft het een vraag hoe ver weefsel segmenten in situ tumor functies kunnen recapituleren, zij zijn uitgebreid gebruikt voor het testen van de reacties op de anti-kanker agenten, met inbegrip van gerichte drugs, monoklonale antilichamen en chemotherapie agenten 10,11,13,14,18,27. We toonden onlangs dat lymfkliertest NKCLK segmenten dynamische veranderingen in proliferatie tonen en oncogene signalering activiteiten na teelt in vergelijking met vers gesneden 0 h plakjes26. Dit geeft aan dat het belangrijk is te onderzoeken of de biologische functies gericht in situ op de juiste wijze worden bewaard tijdens de teelt, vóór perturbation studies. Ondanks deze bevindingen, we toonden dat tumor segmenten model kunnen maken ruimtelijke reactie op gerichte therapieën, Midden drug behandelingen blijven korte (24u) en worden gestart bij het begin van het kweken van26. Het volgende protocol beschrijft belangrijke validatie aspecten die relevant zijn voor de totstandbrenging en de analyse van tumor segment culturen, voorafgaand aan hun toepassing in farmacologische drug testen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic primaire explant weefselcultures, waaronder precisie-cut segmenten, vertegenwoordigen de drie-dimensionale (3-D) weefsel architectuur evenals de meercellige interacties van inheemse weefsel. Weefsel segmenten onmiddellijk gesneden uit vers gereseceerd tumoren behouden ruimtelijke aspecten van de heterogeniteit van de intratumor, waardoor ze nuttig surrogaten van in vivo biologie. Zorgvuldige optimalisatie van weefsel segment voorbereiding en teelt voorwaarden is van fundamenteel belang voor de voorspellende diagnostische mogelijkheden van tumor segment explants. In dit verband zijn lymfkliertest modellen waardevol, zoals deze bieden een consistente stroom van tumor materiaal repliceren en reproduceerbare experimenten uit te voeren. Dit protocol beschrijft het kweken van lymfkliertest Long weefsel tumor afkomstige segmenten met behulp van een roterende incubatie-eenheid, een systeem waarmee intermitterende blootstelling van weefsels aan zuurstof en voedingsstoffen. Onze vorige werk is gebleken dat het gebruik van de roterende incubatie eenheden de levensvatbaarheid van weefsel ten opzichte van andere methoden om cultuur verbetert, met name drijvende segmenten en stagnerende filter ondersteunt. Hier, laten we verder dat segment dikte de levensvatbaarheid beïnvloedt van gekweekte segmenten, suggereren dat optimalisatie met de dikte van het segment gedaan moet worden voor verschillende weefseltypes (HLA). Uitgesproken ITH in relevante oncogene functies, zoals activiteiten, stromale cellen infiltratie of expressie van differentiatie markers, signalering vereist evaluatie van aangrenzende weefsel segmenten voor de expressie van markers gewijzigd door medicamenteuze behandeling of teelt zelf. Kortom, dit protocol beschrijft de generatie van lymfkliertest Long tumor segmenten en hun cultuur op een roterende incubatie-eenheid en toont hoe segmenten moeten systematisch worden geanalyseerd voor de expressie van heterogene weefsel markers, als een voorwaarde voorafgaand aan de drug reactie studies.

Figuur 1 geeft de workflow voor de generatie, de teelt en de analyse van precisie-cut weefsel segmenten afgeleid van lymfkliertest NKCLK tumoren. Voor deze demonstratie vormt en we ingenomen zijn tumoren uit een genetisch gemanipuleerde muismodel (GEMM) herbergen voorwaardelijke activering van KrasG12D samen met het verlies van Lkb1 (ook bekend als Serine/Threonine Kinase 11), hierna te noemen KL. Muis fok- en longkanker tumor inleiding werd uitgevoerd zoals beschreven in26,28. Figuur 2A toont het effect van weefsel segment dikte op de levensvatbaarheid van segmenten gekweekte gedurende 24 uur met behulp van een roterende incubatie-eenheid. Uit de resultaten blijkt dat 160 µm dunne plakjes grote necrotische gebieden in het segment bevatten. Bovendien, tonen 250 µm dunne plakjes een necrose gradiënt over het segment ten opzichte van 200 µm dunne plakjes. Het is waarschijnlijk dat de slechte algehele levensvatbaarheid van de dunste 160 µm wordt veroorzaakt door technische behandeling tijdens de positionering van de segmenten op de top van de rasters, zoals deze kwetsbaar zijn en hebben de neiging te krullen. Aan de andere kant, wanneer segmenten te dik zijn zijn, dat kunnen ze naar voren gebogen aan tekortkomingen in zuurstof of voedingsstoffen verspreiding over de segmenten, die in lymfkliertest NKCLK explants blijkt als necrotic dood kleurovergang25. Echter moet worden opgemerkt dat segmenten met variabele dikte kunnen worden gegenereerd vanuit één tumor, ondanks gebruik van identieke vibratome instellingen. Het wordt daarom aanbevolen om meerdere replicatieonderzoeken uit verschillende tumor monsters analyseren. Bovenal vereist elke weefseltype segment dikte optimalisatie te bereiken maximale levensvatbaarheid, zoals de textuur van het weefsel en de hardheid oxygenatie en nutriënten stroom beïnvloeden kunnen. Figuur 2B -2C illustreert kwantitatieve analyses van de IHC van NKX2-1 expressie, een marker van Long goed gedifferentieerd adenocarcinoom (AC) in monsters verbouwd tot 72 h en gematched 0 h segmenten. Resultaten tonen aan dat NKX2-1 expressie niet aanzienlijk wordt gewijzigd in gekweekte plakjes in vergelijking tot 0 h onbeschaafd segmenten, suggereren dat het proces van de teelt niet openlijk de status van de differentiatie van AC tumor weefsel aantast. Figuur 2D toont het nut van tumor weefsel segmenten voor de beoordeling van de doeltreffendheid van gerichte drugs. We onlangs bleek dat Kras mutant lymfkliertest ACs tentoonstelling hoge uitdrukking van gefosforyleerd ERK1/2 (markering verhoogde MAPK traject activiteit) in vergelijking met adenosquamous (ASC) tumoren, terwijl uitdrukking van gefosforyleerd 4EBP1 (markering mTOR activiteit ) wordt eveneens uitgedrukt in zowel AC en ASC tumoren. Om te testen of deze trajecten kunnen effectief worden gericht op weefsel segmenten, KL AC weefsel segmenten werden behandeld met DMSO of getitreerd bedragen van verbindingen, namelijk 0.1 – 1 µM dactolisib richten op het mTOR traject of 0,05-0,5 µM selumetinib te richten op de MAPK-pathway. Resultaten tonen aan dat 1 µM dactolisib of 0,5 µM van selumetinib zijn effectief in het remmen van de fosforylatie van 4EBP1 of ERK1/2, respectievelijk. Dosis-afhankelijke remming van de gerichte phosphoproteins geeft bovendien aan dat weefsel segmenten ook kunnen worden gebruikt voor het valideren van fosforylering-specifieke antilichamen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van de workflow voor de vaststelling en analyse van lymfkliertest NKCLK tumor verkregen slice explantaten. (A) schematische beschrijving van de collectie en de voorbereiding van tumor-dragende longen voor het snijden. Long lobben zijn geoogst van een muis en tumor weefsel is ontleed weg van normale weefsel. De zwarte pijlpunt en asterisk geven aan ongeveer 4 mm en 1 mm tumoren, respectievelijk. De witte pijlpunt geeft longweefsel vastgelijmd aan het oppervlak van de monsterhouder. De rode pijl wijst op een extra stuk van normaal longweefsel steun te behouden van de tumor in een verticale positie. (B) Vibratome snijden en verzameling van weefsel segmenten. Witte pijl geeft de richting van het snijden. Verzameling van opeenvolgende segmenten in een 24-well plaat met koude HBSS + P/S. De segmenten kunnen ofwel worden gekweekt voor verschillende tijdstippen (hier, 24-72 uur) te beoordelen van tumor-specifieke marker meningsuiting tijdens de teelt (bovenste rij), of kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van de drug behandelingen. C: voertuig controle, T: medicamenteuze behandeling. (C) het weefsel segment voor teelt met behulp van roterende incubatie eenheden plaatsen. Kantelen van de 6-well plaat, zodanig dat de bovenkant van het raster wordt bedekt door een medium, plaats het weefsel segment in het midden van het raster op de top van het medium en verspreid het segment met pincet. Ervoor zorgen dat de 6-Wells-platen gewicht uitgebalanceerd voor een soepele rotatie-cyclus. X: geeft onjuiste, en <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: geeft aan juiste positionering van het segment. (D) foto van het blok van de FFPE van een segment van de tumor. Zwarte pijl wijst op paraffine-ingebedde weefsel segment gekleurd met haematoxyline. (E) schema toont de vectorafbeeldingsbestanden volgorde van de plakjes in FFPE blokken; deze secties kunnen worden verwerkt om weefsel levensvatbaarheid en tumor-specifieke biomerker expressie te beoordelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figuur 2: beoordeling van de levensvatbaarheid en histotype-specifieke marker expressie en gerichte medicamenteuze behandeling op NKCLK weefsel segmenten. (A) vertegenwoordiger H & E beelden van AC NKCLK segmenten van de aangegeven diktes gekweekt voor 24 h. 200 µm dunne plakjes handhaven beter levensvatbaarheid in vergelijking met 160 µm of 250 µm dunne plakjes. Donkerblauw geeft H & E levensvatbare weefsel gekleurd en roze geeft pseudocolored necrotische regio's. Licht blauwe geeft aan regio's die zijn uitgesloten van de analyse, hetzij als gevolg van slechte weefsel kwaliteit of aanwezigheid van vezelig stroma. T1 en T2 vertegenwoordigen biologische replicatieonderzoeken afgeleid van twee verschillende tumoren. Schaal bar = 500 µm. (B) vertegenwoordiger IHC beelden van NKX2-1 expressie in AC plakjes gekweekt voor de aangegeven tijdstippen. Pijl geeft aan dat de ruimte die zijn genoemd in hogere vergroting. Resultaten tonen aan dat NKX2-1 expressie wordt niet gewijzigd in de gekweekte plakjes t.o.v. 0 h segmenten. Schaal bar = 500 µm en 50 µm voor lage en hoge vergrotingen, respectievelijk. (C) kwantificering van de gegevens in (B) worden weergegeven. (D) vertegenwoordiger IHC beelden van gefosforyleerd 4EBP1 of pERK1/2 expressie in 0 h segmenten, of segmenten behandeld met DMSO getitreerd bedragen van dactolisib (dact, bovenste rij) of pERK1/2 expressie in 0 h, of segmenten die zijn behandeld met DMSO phosphorylated of selumetinib (sel, onderste rij). Zwarte vierkante vakken geven aan gebieden in hogere vergroting weergegeven. Schaal bar = 1 mm of 50 µm voor lage of hoge vergroting, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Wij bieden een methode voor de generatie, de teelt en de systematische analyse van organotypic plakjes afgeleid van lymfkliertest Long tumoren. Ook beschrijven we hoe u kunt optimaliseren voor segment dikte en drug concentraties te behandelen tumor segmenten te selecteren.

Vaststelling en analyse van Tumor segment Explants als een voorwaarde voor het kenmerkende testen

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in preklinisch onderzoek, waar drug response studies in tumor slice explants diagnostische doeleinden kunnen dienen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat slice explants voor een korte tijd de complexe biologie van inheemse weefsels kunnen modelleren, inclusief ruimtelijk gedistribueerde functies. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het gebruik van plakjes van murine longtumoren, kan het ook worden toegepast op andere weefseltypen, waaronder menselijke weefsels.Om te beginnen moet u de vibratome voorbereiden en een VibraCheck uitvoeren volgens de instructies in de handleiding. Vul vervolgens elke put van de 24-put plaat met een milliliter van Hank's Balanced zout oplossing aangevuld met penicilline en streptomycine en houd de plaat op ijs. Steek 25-gauge naalden in alle vier poten van een geëuthanaseerde muis geplaatst op een piepschuim deksel, zodat de borst wordt blootgesteld en het dier wordt uitgerekt.Spray 70% alcohol op het oppervlak van de blootgestelde huid. Gebruik schaar geplaatst in een schuine positie om open te snijden de huid van de buik naar de borst en tot aan de nek regio. Strek de huid aan weerszijden met tangen en steek 25-gauge naalden.Snijd de buikstreek open. Snijd vervolgens de ribbenkast en het middenrif open om de long en het hart bloot te leggen. Bloot de luchtpijp door het wegsnijden van het omliggende weefsel.Ontleden de longen, samen met het hart. Plaats de weefsels in een buis van 50 milliliter met 30 milliliter ijskoude HBSS aangevuld met Pen-Strep geplaatst op ijs en ga zo snel mogelijk naar de volgende stap. Breng nu de tumordragende longen over naar een weefselkweekplaat van 10 centimeter.Gebruik steriele schaar en tangen om de longkwabben te scheiden en selecteer lobben met tumoren op het oppervlak voor het snijden. Plaats een longkwab met een tumorweefsel op een stuk filterpapier om te voorkomen dat uitglijden en uitgesneden een deel van de normale long of extra tumorweefsel dat de tumor omringt met behulp van een steriele scalpel om een plat weefsel stuk oppervlak te genereren. Dompel de platte kant in een druppel cyanoacrylaat lijm en monteer het op de vibratome specimen houder, zodat de tumor geconfronteerd met het blad in een rechte positie, en laat het drogen voor twee tot drie minuten.Plaats de vibratome specimen houder in de metalen buffer lade. Vul de lade met koude HBSS aangevuld met Pen-Strep totdat het weefsel wordt ondergedompeld in de buffer. Bedek de bufferlade met het plexiglasdeksel dat is voorzien van het instrument en plaats de lade in een wit ijsbad en voeg ijs toe om het weefsel koel te houden tijdens het snijden.Bevestig het witte ijsbad aan het vibratome. Selecteer vervolgens geschikte snijinstellingen en begin met snijden. Breng het vibratomeblad naar de snijpositie en stel het snijraam in.Gebruik steriele tangen om de plakjes te verzamelen in een 24-put plaat gevuld met een milliliter HBSS aangevuld met Pen-Strep per goed en houd op ijs. Terwijl u de snijvolgorde bijhoudt, markeert u elke put van de 24-putplaat volgens het experimentele plan. Verzamel een weefsel slice grenzend aan de gekweekte plakjes als een nul uur of onbeschaafde referentie.Verzamel ten minste drie referentiesegmenten om de bovenkant, het midden en de onderkant van het weefsel te vertegenwoordigen. En zodra het snijden is voltooid, doorgaan met de vaststelling en verwerking. Bereid daarna een zes-put plaat met 2,5 milliliter cultuurmedium per put door het plaatsen van titanium roosters in.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd tussen het titanium rooster en het medium. Om een plak op het rooster te laden, houdt u de zes-put plaat in een schuine positie, zodat een deel van het medium het rooster bedekt. Plaats vervolgens het segment in het medium op het rooster en gebruik tangen om het te verspreiden.Laad na het plaatsen van de plakjes de zes-putplaten op de roterende incubatieunit die in een bevochtigde couveuse wordt geplaatst die bij 95%02 en 5% CO2 wordt gehandhaafd. Start de rotatiecyclus. Voor langdurige teelt vul het kweekmedium elke dag aan door steriele tangen te gebruiken om het rooster met de weefselschijfjes op te tillen en in een lege put van de zesputtenplaat te plaatsen.Vervang 70% van het medium door vers cultuurmedium en plaats het raster er weer in. Doorgaan met de rotatiecyclus zoals voorheen. Voor medicamenteuze behandeling op de tumor plakjes voeg 2,5 milliliter media met de verdunde drug of voertuig controle in de zes-put plaat.Plaats de titanium roosters in de putten en plaats de plakjes op de roosters zoals eerder gedaan. Na het uitvoeren van de behandelingen gedurende 24 uur, blijven met de vaststelling en verwerking. Om te beginnen met de vaststelling van de gewenste plak zorgvuldig overbrengen met behulp van tangen in een 10-centimeter plaat met een geweekt filter papier gevuld met twee tot drie milliliter PBS en laat het drijven.Til vervolgens het filterpapier met een paar tangen op en plaats het in een histo cassette. Zet het filterpapier in een histo cassette. Voeg een druppel verdunde hematoxylin op de top van het weefsel slice om de positie van de slice voor de volgende stappen te markeren.Sluit de cassette en breng deze over in een 4% neutrale gebufferde formalin-oplossing en laat 's nachts op vier graden Celsius. Na het wassen en verwerken van de cassette zoals beschreven in het protocol, open je de histocassette en gebruik je een scalpel om het vaste plak voorzichtig uit het filterpapier te tillen. Gooi het filterpapier weg en breng het plakje over in een mal met vloeibare paraffine.Gebruik een vlak gewicht om het weefsel tegen de bodem van de inbeddingsvorm te drukken om zelfs sectie te verzekeren. Leg het onderste deel van de histo cassette op de top van de mal. Voeg vloeibare paraffine op de top van het.En laat de mal afkoelen op een koude plaat voor 30 minuten. Daarna scheiden de gekoelde schimmel van de paraffine blok. Gebruik een microtome voor te bereiden vier-micrometer dunne delen van de FFPE weefsel slice blokken.Trim weg de overmaat van paraffine rond het weefsel. Om gelijkmatige secties in het weefsel te verkrijgen, pas de hoek van het blok aan, zodat het oppervlak van het blok horizontaal is gericht ten opzichte van het blad. Met behulp van een dunne borstel verzamelen sequentiële weefselsecties van de paraffine-ingebedde weefsel slice vanaf het bovenste deel van de glazen dia's.Ga verder met het verzamelen van de delen van de diepere weefsellagen naar het midden, gevolgd door het onderste deel van de glazen dia's. Het verzamelen van secties van verschillende lagen van elk weefselsegment tot de objectdia's wordt gedaan om potentiële door cultuur geïnduceerde gradiënten in levensvatbaarheid, celmigratie of biomarkerexpressie vast te leggen. Na het verzamelen van de secties blijven met hun verwerking en verdere analyse zoals beschreven in het protocol.Weefsel slice dikte kan invloed hebben op de levensvatbaarheid van gekweekte plakjes. In dit geval, 250-micrometer dikke plakjes tonen verhoogde necrose gradiënten in vergelijking met 200-micrometer dikke plakjes als gevolg van dikkere plakjes steeds gevoelig voor tekorten in zuurstof of nutriënten diffusie over de plakjes. Echter, 160-micrometer dunne plakjes bevatten grote necrotische gebieden waarschijnlijk veroorzaakt door technische behandeling tijdens de positionering van de plakjes als deze zijn kwetsbaar en hebben de neiging om te krullen.Analyse van NKX2-1, een marker van goed gedifferentieerd longadenocarcinoom, toont aan dat de expressie ervan niet significant is veranderd in gekweekte plakjes in vergelijking met nul uur onbeschaafde plakjes. Kwantitatieve analyse van NKX2-1 expressie bevestigde verder dat de uitdrukking niet significant was veranderd in gekweekte versus onbeschaafde plakjes, wat suggereert dat het teeltproces de differentiatiestatus van adenocarcinoomweefsel niet zichtbaar beïnvloedt. Om te testen of de plakjes van het tumorweefsel kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van gerichte geneesmiddelen te evalueren, werden ze behandeld met DMSO of getitreerde hoeveelheden verbindingen.Wanneer behandeld met een micromolar dactolisib die zich richt op de mTOR-route fosforylatie van 4EBP1 werd geremd. 0,5 micromolar selumetinib die zich richt op de MAP kinase route was effectief in het remmen van de fosforylatie van ERK1/2. Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe om te werken met en kritisch analyseren plakjes vers gesneden uit kostbare tumorweefsels.Onze voormalige postdoc, Katja Narhi, heeft in samenwerking met collega's van het IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform een belangrijke bijdrage geleverd aan de totstandkoming van deze methode.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

A-CFSE gebaseerde test om de migratie van de huid van muizen dendritische cellen Onderzoek naar drainerende lymfeklieren tijdens infectie met<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse van 18FDG-PET/CT Imaging als een hulpmiddel voor studeren Mycobacterium tuberculosis infectie en behandeling in niet-menselijke primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...