Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Cet appui financier de recherche travail a reçu de l’entreprise commune Initiative médicaments innovants accorder accord no 115188, le Programme de doctorat Université de Helsinki en bourses (A.S.N.) de la biomédecine et la Sigrid Juselius et Orion-Farmos fondations (E.W.V.). Nous remercions sincèrement nos membres du consortium de plate-forme PREDECT tissu tranche (Cécile af Hällström et Siv Knaappila de soutien dans la mise en place du système de la coiffe et Riku Turkki pour le soutien à l’analyse MATLAB. Jouko Siro est remerciée pour capturer les photos de la Figure 1. Nous remercions l’équipe de FIMM WebMicroscope pour numérisation de diapositives histologiques, et soutenir le Centre d’Animal de laboratoire pour l’élevage.

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Auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Divers complexes en vitro tumeur modèles, y compris les cultures 3D et organoids, ont été développés pour récapituler l’architecture et les fonctions oncogéniques de in vivo la tumeur tissulaire29,,30. Cependant, la mise en place de cultures 3D ou organoïdes implique dissociation tissulaire et croissance sélective de cellules du même type ou de la co-culture d’un select quelques types de cellules dans un milieu artificiel. En conséquence, ces modèles capturent incomplètement la complexité des interactions de l’hétérogénéité et la tumeur-stroma tumoral. Tranches d’organotypique de tumeur, d’autre part, maintient les complexités d’architecture et biologique des tissus de la tumeur in situ , sans une vaste manipulation. Cette capacité des tranches de tissu de cellules tumorales modèle dans leur microenvironnement natif le rend particulièrement attrayant pour les études précliniques. Nous avons déjà indiqué un workflow optimisé pour la création et l’analyse des tranches de tumeur de la précision de coupe, et a montré que, comparé à filtre prend en charge, une unité rotative d’incubation améliorer la viabilité à court terme murine NSCLC tranche cultures25 , 31. Toutefois, qui intervient dans la rotation des unités est techniquement difficile et nécessite une surveillance constante. Nous présentons ici un protocole pour la génération de tranche pour le tissu tumoral et l’utilisation pratique d’une rotation unité d’incubation pour leur culture, ainsi qu’accompagnant les méthodes permettant de contrôler la capacité des tranches pour capturer en situ biologie tumorale, une condition sine qua non avant la drogue test de réponse.
Plusieurs étapes cruciales dans le protocole assurent l’intégrité des tissus et la viabilité des tranches tumeur. Si le tissu pulmonaire normale entoure la tumeur, le vibratome peut générer des tranches d’épaisseur incompatible ou endommager les tranches, en raison de différences dans la texture et la rigidité des tissus normaux et la tumeur. Il est donc important d’éliminer les tissus pulmonaires normales environnants avant tranchage de la tumeur. Une autre étape critique est l’épaisseur de tranchage, qui doit être soigneusement optimisé pour chaque type de tissu. En outre, une fois tranché, il est essentiel que la tranche est placée approximativement au milieu de la grille, donc pour assurer la précision intermittente immersion dans le milieu de culture et de l’exposition de l’oxygène. Enfin, il est important de suivre la position d’une tranche au cours de sa période de rotation, comme une tranche peut descendre vers le bas le milieu ; Si cela se produit, autres mesures peuvent être prises comme l’a expliqué à l’étape 3.6 du protocole.
Gérant de manière à assurer l’intégrité des tissus, s’ajoutent également des étapes critiques dans l’analyse de l’IHC à interpréter comment la tranche ressemble à du tissu natif. Notre étude antérieure a montré que les tumeurs murines NSCLC montrent l’hétérogénéité spatiale prononcé intra-tumeur oncogènes signalisation activités26. Cela signifie que l’utilisation de tissus distincts dans l’espace en tranches pour les contrôles ou les échantillons traités peuvent influer sur l’interprétation des données expérimentales fiables, et donc tranches proche voisins serve de contrôles et d’échantillons de test. De plus, nous avons démontré que tandis que la prolifération ou expression d’oncogènes phosphoprotéine en tranches fraîchement coupées inculte 0 h ressemblaient à des tumeurs in situ , tranches cultivées ont montré expression altérée phosphoprotéine oncogènes, spécialement modifiés p4EBP1 pSRC, ainsi altérée prolifération analysés par IHC Ki67. Expression p4EBP1 altérée a été de même décelée dans 24h NSCLC humaine et cancer de la prostate Tranchez des cultures (Narhi et al.., supplémentaire Figure S3B-S3C, S5 et S7)26. Ces constatations approuver que comparaison des tranches cultivées avec leur tranche inculte le plus proche de 0 h est essentielle pour évaluer la préservation in situ de fonctions tumorales en tranches cultivées.
Malgré l’amélioration de la viabilité d’organotypique tranches25, il existe des limites avec le système de la coiffe en ce qui concerne les aspects techniques. Placer les tranches de tissus sur des grilles de titane est plus difficile par rapport pour filtrer les insertions, et une unité rotative d’incubation ne seront ne peut-être pas disponible. Comme alternative, supports de filtre stagnante peuvent être utilisés, mais dans ce cas que le côté exposés à l’air des tranches devrait être analysé, comme-à-filtre à air dégradés dans la viabilité et l’hypoxie mesurée par HIF1α expression sont forment rapidement en tranche de filtre pris en charge cultures (Davies et al., Figure 5 et Figure 7 a-7 b)25. De plus, nous avons montré que les cultures de tranche de tumeur peuvent montrer prolifération altérée et des activités de signalisation oncogènes par rapport à leurs tumeurs native26, peut-être à cause de la cicatrisation des réponses ou adaptation métabolique des tranches de ex vivo 32la culture. Bien que le bruts caractéristiques morphologiques des tumeurs murines NSCLC ont été maintenus pendant la culture de 72 h, prolifératives induite par la culture peuvent affecter un classement précis des tranches cultivées. Ainsi, tranches de tissus seulement soient utilisés pour des études fonctionnelles à court terme.
Utilisation de l’unité rotative d’incubation sauve au moins partiellement dégradés d’expression de viabilité ou biomarqueurs intra-tranche, surtout pendant les premières 24 heures de culture. Une fois validé pour l’intégrité et la fonction, cela fournit du matériel de tissu pour des études fonctionnelles, telles que des études sur les traitements médicamenteux. En plus de la réponse profilage des drogues, expression cible modifiée après traitement de la toxicomanie peut également bénéficier de validation d’anticorps. Cela est particulièrement pertinent pour la détection des épitopes murins avec anticorps monoclonaux de souris, que ceux-ci tendent à forte coloration de l’arrière-plan. En outre, les anticorps bien validées sont nécessaires pour atteindre des données fiables et reproductibles dans paramètres diagnostiques et cliniques. Modulation de l’abondance ou la phosphorylation des épitopes pertinentes après traitement de la toxicomanie dans les tranches de tissus fournit donc une pratique application pratique dans la validation des anticorps. Un avantage majeur des cultures de tranche de tumeur est la possibilité de fonctions distribuées dans l’espace du modèle, y compris les activités de signalisation oncogènes ou réaction aux médicaments dans la tumeur ou des cellules stromales, qui rend un modèle attrayant ex vivo . Toutefois, les tranches tournent pendant la culture, et le processus de la culture peut également endommager les tissus particulièrement sur les bords. Il est donc difficile de superposition précisément les images IHC biomarqueur teinté de tranches de 0 h avec les régions nécrotiques détectées en tranches cultivées, qui compromet la possibilité de relier avec précision les activités spatiales de biomarqueurs à la réaction aux médicaments. En outre, réponses nécrotiques tumorale intrinsèque, induite par la culture et médicamenteuse sont indiscernables au moins dans les tranches de tissus NSCLC murines, compromettre la quantification précise des réponses de drogue spatiale. Enfin, l’utilisation de cultures de tranche de tumeur permet un chercheur à l’essai plusieurs composés sur la tumeur même, sans avoir à traiter les animaux, donc affiner, réduire et remplacer les expériences sur animaux de laboratoire.
Comme une application future, on peut adopter le protocole décrit aux échantillons cliniques tumeur solide. Autres modifications de dépendant du type de tissu ou optimisations sont probablement nécessaires, commençant par les réglages vibratome incluant la tranche épaisseur et vibration pour optimiser ces pour la texture de la tumeur ou la raideur. En outre, des besoins en éléments nutritifs et de facteur de croissance peuvent varier pour tissus tumoraux différents. À titre d’exemple, tranches de cancer du sein ont été cultivées avec l’insuline complétée dans la moyenne13,18. Étant donné que le matériel tissulaire limité est obtenu au cours d’une intervention chirurgicale ou biopsie, optimisation des cultures de tranche de tumeur dérivée de patient peut être difficile en raison de difficultés à obtenir un nombre suffisant d’échantillons. En outre, reproductibilité des données est également contestée par prononcé l’hétérogénéité de l’échantillon de patient à patient, en particulier dans le pourcentage des cellules tumorales par rapport aux régions fibreuses ou infiltrats stromales, ainsi que des composants des tissus nécrosés. Enfin, application de tranches de tumeur dans les paramètres de diagnostics exigerait enquête l’ampleur drogues réponses dans la tranche des explants de prétraitement biopsies correspond aux réponses de post-traitement en vivo .

Tissus de tumeurs solides, y compris le cancer du poumon, présentent une hétérogénéité génétique et phénotypique et hébergent des micro-environnements complexe1,2. L’interaction entre les cellules tumorales et leur influence microenvironnement environnants sur drogues mécanismes de sensibilité et résistance3. Cela met en évidence la nécessité pour les modèles précliniques qui peuvent modéliser avec précision la complexité biologique et fonctions agissant dans les tumeurs natives. Précision de coupe tranches immédiatement dérivées de tumeurs fraîches constituent une ressource unique, car ils ont une capacité principale pour représenter en vivo biologie, au moins pour une courte fenêtre de temps, y compris les phénotypes spatialement distribuées dans une tumeur individuelle. Réséqués tumeurs cliniques sont l’un des quelques spécimens personnalisés peuvent être obtenus par un patient atteint de cancer, et leur usage diagnostique mérite un examen.
L’histoire de l’organotypique cultures remonte au début du 19e siècle, lorsque les tumeurs intracrâniennes humaines étaient taillés à la main en morceaux de tissus et d’élevage à l’aide de ce qu’on appelle pendaison méthode drop. Fragments de tissus étaient attachés à un lamelle couvre-objet et autorisés à puiser dans hépariné plasma humain, après quoi les lamelles ont été inversés, scellés et cultivées pendant plusieurs semaines4. Découper manuellement tumeur morceaux ont été cultivées en utilisant une variété d’autres méthodes, telles que les caillots plasma5, dans des milieux liquides6, ou sur 0,45 µm de porosité de filtres de taille6. Le terme « organotypic » a été tout d’abord utilisé en 1954, dans une étude sur la différenciation rétinienne du poussin embryon œil7. Elle a été suivie d’études qui utilisaient des explants de tissus pulmonaires et cardiaques dérivées d' embryons de poussins8et des explants de cerveau de rats adultes9.
Tranchage de diverses méthodes ont été décrites, à savoir manuel choppers10,11, Krumdieck tissu trancheuse12,13et vibratomes11,14,15, 16. La coupeuse de tissu Krumdieck génère des noyaux de tissu cylindrique, qui est ensuite coupées en tranches de tissu circulaire à l’aide d’un microtome. Un vibratome, en revanche, utilise un microtome de lame vibrante. Dans une étude sur les tranches de foie, il a été démontré que le vibratome Leica génère plusieurs sections reproductibles et cohérentes par rapport à la Krumdieck trancheuse15. Épaisseur de tranche allant de 250 à 500 µm ont été utilisés, et études font état de maintien de la viabilité et les caractéristiques morphologiques même jusqu'à 16 jours14,10,17,18. Cependant, les tumeurs ont des profils métaboliques variables pouvant affecter les besoins en éléments nutritifs et paramètres tels que la rigidité et la matrice de composition du tissu peuvent influer sur l’aération et flux des éléments nutritifs. Il est donc probable que chaque type de tissu nécessite optimisation des conditions de tranchage et de la culture.
Méthodes culturales différentes ont été utilisées pour soutenir les cultures tranche : J’ai) culture stationnaire interphase, aussi appelée support stagnante culture dans lesquels les tranches sont placés sur le dessus un insert membrane poreuse semi immergé dans le milieu de culture. À cet égard, le haut des tranches est exposé à l’air, tandis que le fond est additionné de nutriments via l’insertion poreux14,19; II) la méthode de la truelle, développée à l’origine d’organes entiers de la culture ou des tranches de tissu embryonnaire. À cet égard, tranches sont placés sur le dessus un drap en coton ou un filtre pris en charge par une grille en métal, et le filtre est trempé dans le milieu de culture. Pour garder les tissus humides, une mince couche de médium est ajoutée sur le dessus les tranches de20,21,22. Ces deux premiers est soi-disant cultures interphase air liquide ; III) rouleau tube cultures, où tranches sont placées dans le côté plat d’un tube en plastique contenant le support, et rotation lente tube veille à ce que le tissu est recouvert de moyenne pendant la première partie d’un cycle, ou aéré pendant le deuxième23; IV) unités d’incubation tournante, dans lesquelles les tranches sont exposés par intermittence au milieu avec les nutriments et l’aération. Différent de tubes roulés, dans cette méthode tranches sont placés sur le dessus de titane poreux grilles placées dans des boîtes de 6 puits avec milieu de culture24.
Tranches de tissus provenant de tumeurs solides réséquées logiquement présentes un modèle attrayant ex vivo permettant de tester la réponse au traitement des agents anticancéreux, car ils permettent l’évaluation de la viabilité, ciblé l’activité parcours et profils moléculaires d’une tumeur spécifique en présence de son microenvironnement tumeur native. Toutefois, afin de déterminer si les réponses de drogue mesurées dans des tranches de tumeur sont prédictifs d’in situ les réponses, il est important de déterminer dans quelles mesure tissu tranches préserver spécifique des fonctions biologiques telles que la prolifération des cellules, la différenciation des cellules spécifiques histopathologie ou activités de signalisation oncogéniques. L’impact des contraintes mécaniques induites au cours de la préparation de tranche, tranche manutention ou adaptations induites par la culture sur la qualité et les fonctions biologiques des tranches de tissus sont des questions fondamentales, étroitement liées à la capacité de mettre en œuvre dérivées de tumeurs tranches pour diagnostic fonctionnel.
Notre projet de consortium financé par IMI PREDECT (http://www.predect.eu) énonce à l’adresse systématiquement ces questions fondamentales, en étudiant les explants tranche d’une variété de sources. En utilisant des tranches dérivés des modèles de cancer du sein, la prostate et du poumon, cet effort commun utilisé afficheurs qualitatives ainsi que quantitative hématoxyline et lectures d’éosine (H & E) - basé pour démontrer une exigence pour l’oxygène atmosphérique et filtre stagnante supports pour maintenir la viabilité des tranches cultivés jusqu'à 72 h. En outre, analyses d’immunohistochimie (IHC) sur des tranches a révélé des gradients de viabilité intra-tranche, mis en évidence que les gradients de nécrose en tranches provenant de souris non à petites cellules cancer du poumon (NSCLC), récepteurs de œstrogènes (ER), HIF1α et γH2AX 25tranches de dégradés dans des tranches de cancer du sein, ou androgènes récepteurs (AR) expression dégradés dans le cancer de la prostate. Fait intéressant, les gradients de viabilité intra-tranche dans les cultures de 24h de NSCLC murin ont été secourus par culture dans une unité rotative d’incubation, et notre étude récente a montré que la viabilité a été étendue à 72 h26. Particulièrement le côté supérieur est resté plus viable26, soutenant que les analyses de réaction de drogue sur les tranches soient effectuées mieux sur ce côté du tissu.
Même s’il reste une question quant à la façon loin tranches de tissus peuvent récapituler in situ les fonctions de la tumeur, ils ont été largement utilisés pour tester les réactions aux agents anticancéreux, y compris les médicaments ciblés, des anticorps monoclonaux et des agents de chimiothérapie 10,11,13,14,18,27. Nous avons montré récemment que murins tranches NSCLC montrent des changements dynamiques dans la prolifération et tranches d’oncogènes activités signalisation après culture comparativement pour fraîchement coupé 0 h26. Cela indique qu’il est important d’examiner si les fonctions biologiques ciblés in situ sont correctement conservées pendant la culture, avant les études de perturbation. Malgré ces constatations, nous avons montré que les tranches de tumeur peuvent modéliser réponse spatiale aux thérapies ciblées, au milieu de la drogue traitements restent brèves (24h) et sont initiées au début de la mise en culture26. Le protocole suivant décrit les aspects importants de validation à la mise en place et l’analyse des cultures de tranche de tumeur, avant leur application dans le dépistage des drogues pharmacologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Cultures d’explants de tissu primaire organotypique, qui comprennent des tranches de coupe de précision, représentent l’architecture tridimensionnelle (3d) tissus ainsi que les interactions multicellulaires de tissu native. Tranches de tissus provoquer la coupure immédiate de tumeurs réséquées fraîchement préservent les aspects spatiaux de l’hétérogénéité de l’intratumor, ce qui les rend utiles substituts de in vivo de la biologie. Attention, optimisation des conditions de préparation et de la culture tranche tissulaire est fondamentale pour le potentiel de diagnostic prédictif de tumeur tranche des explants. À cet égard, les modèles murins sont précieuses, car elles fournissent un flux cohérent de matériel tumoral pour effectuer de répliquer et expériences reproductibles. Ce protocole décrit la mise en culture des tranches de tissu dérivées de tumeurs de poumon murine en utilisant une unité d’incubation tournante, un système qui permet une exposition intermittente des tissus à l’oxygène et de nutriments. Nos travaux antérieurs ont montré que l’utilisation des unités de l’incubation en rotation améliore la viabilité des tissus par rapport aux autres méthodes de culture, particulièrement flottant tranches et stagnante filtre prend en charge. Nous montrons ici, plus que l’épaisseur de la tranche influe sur la viabilité de tranches cultivées, ce qui suggère que l’optimisation de l’épaisseur de la tranche devrait être fait pour les types de tissus différents. Prononcez ITH en fonctions oncogéniques pertinentes, telles que la signalisation des activités, infiltration de cellules stromales ou l’expression de marqueurs de différenciation, nécessite des évaluations des tranches de tissus adjacents pour l’expression des marqueurs altérés par le traitement de la toxicomanie ou culture elle-même. En résumé, ce protocole décrit la génération de tranches de tumeur poumon murin et leur culture sur une unité rotative d’incubation et montre comment les tranches devraient être systématiquement analysés pour l’expression des marqueurs de tissu hétérogène, comme une condition sine qua non avant les études de drogue de réponse.

La figure 1 représente le flux de travail pour la génération, la culture et l’analyse de précision de coupe tranches dérivées de tumeurs murines de CPNPC. Pour cette démonstration, nous avons utilisé des tumeurs d’un modèle de souris génétiquement modifiées (GEMM) hébergeant l’activation conditionnelle de KrasG12D ainsi que la perte de Lkb1 (également connu sous le nom de sérine/thréonine Kinase 11), ci-après dénommée KL. Initiation de tumeurs pulmonaires et de reproduction souris a été effectuée comme décrit dans26,28. Figure 2 a montre l’effet de l’épaisseur de tranche de tissu sur la viabilité des tranches cultivées pendant 24 h à l’aide d’une unité rotative d’incubation. Les résultats montrent que 160 µm fines tranches contiennent des vastes zones nécrotiques sur la tranche. En outre, fines tranches de 250 µm montrent une nécrose gradient à travers la tranche par rapport à 200 µm de fines tranches. Il est probable que la viabilité globale médiocre de la plus mince µm 160 est causée par une manipulation technique pendant le positionnement des tranches sur le dessus des grilles, puisque ceux-ci sont fragiles et ont tendance à friser. En revanche, lorsque les tranches sont trop épais, qu'ils peuvent devenir sujettes aux déficiences d’oxygène ou de nutriments diffusion à travers les tranches, qui en murine NSCLC explants témoigne que la mort nécrotique dégradé25. Toutefois, il est à noter que les tranches avec des épaisseurs variables peuvent être générés d’une tumeur, malgré l’utilisation des paramètres de vibratome identiques. Il est donc recommandé d’analyser plusieurs réplicats d’échantillons de tumeurs différentes. Ce qui est important, chaque type de tissu nécessite optimisation d’épaisseur de tranche de devenir viables maximale, car la texture du tissu et la dureté peuvent affecter l’oxygénation et flux des éléments nutritifs. Figure 2 b -2C illustre des analyses quantitatives de IHC d’expression NKX2-1, un marqueur de l’adénocarcinome du poumon bien différenciés (AC) dans les échantillons cultivés jusqu'à 72 h et appariés tranches 0 h. Les résultats montrent qu’expression NKX2-1 n’est pas significativement altérée en tranches cultivées par rapport à 0 h tranches incultes, ce qui suggère que le processus de la culture n’affecte pas ouvertement l’état de différenciation du tissu tumoral AC. Figure 2D démontre l’utilité des tranches de tissu de tumeur pour évaluer l’efficacité des médicaments ciblés. Nous avons montré récemment que Kras mutants murins ACs pièce forte expression de phosphorylés ERK1/2 (marquage une activité accrue de voie MAPK) par rapport aux tumeurs adénosquameux (ASC), tandis que l’expression de 4EBP1 phosphorylés (marquage activité mTOR ) est exprimé de la même façon dans les tumeurs C.A. et ASC. Pour vérifier si ces voies peuvent être efficacement ciblées sur des tranches de tissu, tranches de tissus KL AC ont été traités avec le DMSO ou titrés des quantités de composés, à savoir 0,1 – 1 µM dactolisib pour cibler la voie mTOR ou 0,05 à 0,5 µM selumetinib pour cibler la voie MAPK. Les résultats montrent que dactolisib de 1µm ou 0,5 µM de selumetinib sont efficaces pour inhiber la phosphorylation de 4EBP1 ou de ERK1/2, respectivement. En outre, une inhibition dose-dépendante des phosphoprotéines ciblées indique que les tranches de tissu peuvent également être utilisées pour valider des anticorps spécifiques à la phosphorylation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figure 1 : représentation schématique du flux de travail pour la mise en place et l’analyse des explants de tranche dérivées de tumeurs murines CPNPC. (A) schéma décrivant le prélèvement et la préparation des poumons avec tumeur pour trancher. Lobes du poumon sont récoltés sur une souris et un tissu tumoral est disséqué des tissus normaux. La flèche noire et un astérisque indiquent environ 4 mm et des tumeurs de 1 mm, respectivement. La pointe de flèche blanche indique le tissu pulmonaire, collé à la surface de la porte-échantillon. La flèche rouge indique à un autre morceau de tissus de soutien de poumon normal de conserver la tumeur en position verticale. (B) Vibratome tranchage et collection de tissu. Flèche blanche indique la direction de tranchage. Collection de tranches séquentielles dans une plaque de 24 puits contenant froid HBSS + P/S. Les tranches peuvent être cultivées à des moments différents (ici, 24 à 72 h) afin d’évaluer l’expression du marqueur tumoral spécifique pendant la culture (rangée du haut), ou peuvent être utilisés pour effectuer des traitements médicamenteux. C: excipient, t : traitement de la toxicomanie. (C) Placer la tranche de tissu pour la culture en utilisant les unités rotatives d’incubation. Basculer la plaque 6 puits afin que quelque moyen couvre le haut de la grille, placez la tranche de tissu au milieu de la grille sur le dessus de la moyenne et tartinez la tranche avec une pincette. Assurez-vous que les plaques 6 puits sont poids équilibré pour un cycle de rotation sans heurt. X: indique incorrecte, et <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: indique un positionnement correct de la tranche. (D) photographie du bloc FFIP d’une tranche de la tumeur. Flèche noire à tranche de tissus inclus en paraffine colorés à l’hématoxyline. Schematics (E) montrant l’ordre sectionnement des tranches en blocs FFIP ; ces sections peuvent être traitées afin d’évaluer la viabilité des tissus et l’expression de biomarqueur spécifique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figure 2 : évaluation de l’expression de marqueur de viabilité et histotype spécifiques et pharmacothérapie ciblée sur les tranches de tissus CPNPC. Images (A) représentant H & E de tranches de NSCLC AC des épaisseurs indiquées cultivés pour des tranches fines de 24 h. 200 µm de maintiennent la viabilité mieux par rapport à 160 µm ou fines tranches de 250 µm. Bleu foncé représente H & E teinté tissu viable et rose indique pseudocolored régions nécrotiques. Bleu clair indique les régions exclues de l’analyse, soit en raison de la qualité des tissus pauvres ou présence du stroma fibreux. T1 et T2 représentent des réplicats biologiques provenant de deux différentes tumeurs. Echelle = 500 µm (B) IHC représentant les images d’expression NKX2-1 dans les tranches de AC cultivés pour les points de l’heure indiquée. La flèche indique la zone illustrée à fort grossissement. Les résultats montrent que l’expression NKX2-1 n’est pas altérée dans les tranches cultivées par rapport aux tranches de 0 h. Echelle = 500 µm et 50 µm pour des grossissements faibles et élevées, respectivement. (C) quantifier les données indiquées au point B. (D) représentant IHC images de 4EBP1 phosphorylé ou expression de la pERK1/2 en 0 h tranches, tranches traités avec le DMSO titré des quantités de dactolisib (dact, rangée du haut) ou ou phosphorylée pERK1/2 expression dans la tranche 0 h ou tranches traités avec le DMSO ou selumetinib (sel, rangée du bas). Boîtes carrées noires indiquent des zones indiquées au fort grossissement. Echelle = 1 mm ou 50 µm pour un grossissement faible ou élevé, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Nous fournissons une méthode pour la génération, la culture et l’analyse systématique des tranches organotypique dérivées de tumeurs pulmonaires murine. Nous décrivons également comment optimiser pour l’épaisseur de la tranche et comment sélectionner des concentrations du médicament pour traiter les tranches de la tumeur.

Mise en place et l’analyse de la tumeur tranche Explants comme une condition préalable à des tests de Diagnostic

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la recherche préclinique, où les études de réponse médicamenteuse dans les explants de tranches tumorales peuvent servir à des fins diagnostiques. Le principal avantage de cette technique est que les explants de tranches peuvent pour une courte fenêtre de temps modéliser la biologie complexe des tissus indigènes, y compris les fonctions réparties spatialement. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’utilisation de tranches de tumeurs pulmonaires murines, elle peut également être appliquée à d’autres types de tissus, y compris les tissus humains.Pour commencer, préparez le vibratome et effectuez un VibraCheck selon les instructions fournies dans le manuel. Remplissez ensuite chaque puits de la plaque de 24 puits d’un millilitre de solution de sel équilibré de Hank complétée par de la pénicilline et de la streptomycine et gardez la plaque sur la glace. Insérez des aiguilles de calibre 25 dans les quatre pattes d’une souris euthanasié placées sur un couvercle en polystyrène afin que la poitrine soit exposée et que l’animal soit étiré.Vaporiser 70% d’alcool à la surface de la peau exposée. Utilisez des ciseaux placés en position inclinée pour couper la peau de l’abdomen vers la poitrine et jusqu’à la région du cou. Étirez la peau de chaque côté à l’aide de forceps et insérez des aiguilles de calibre 25.Coupez la région abdominale. Ensuite, coupez la cage thoracique et le diaphragme pour exposer le poumon et le cœur. Exposer la trachée en coupant les tissus environnants.Disséquer les poumons, avec le cœur. Placez les tissus dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de HBSS glacé complété par pen-strep placé sur la glace et passez à l’étape suivante aussi rapidement que possible. Maintenant, transférez les poumons porteurs de tumeurs dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres.Utilisez des ciseaux stériles et des forceps pour séparer les lobes pulmonaires et sélectionner les lobes avec des tumeurs à la surface pour trancher. Placez un lobe pulmonaire avec un tissu tumoral sur un morceau de papier filtre pour éviter de glisser et de découper une partie du poumon normal ou du tissu tumoral supplémentaire qui entoure la tumeur à l’aide d’un scalpel stérile pour générer une surface plate de morceau de tissu. Tremper le côté plat dans une goutte d’adhésif cyanoacrylate et le monter sur le porte-spécimen vibratome de sorte que la tumeur fait face à la lame en position verticale, et laisser sécher pendant deux à trois minutes.Placez le porte-spécimen vibratome dans le bac tampon métallique. Remplissez le plateau de HBSS froid complété par Pen-Strep jusqu’à ce que le tissu soit immergé dans le tampon. Couvrir le plateau tampon avec le couvercle en plexiglas fourni avec l’instrument et placer le plateau dans un bain de glace blanche et ajouter de la glace pour garder le tissu au frais pendant le tranchage.Attachez le bain de glace blanche au vibratome. Sélectionnez ensuite les réglages de tranchage appropriés et commencez à trancher. Amenez la lame vibratoire à la position de tranchage et réglez la fenêtre de tranchage.Utilisez des forceps stériles pour recueillir les tranches dans une assiette de 24 puits remplie d’un millilitre de HBSS complétée par Pen-Strep par puits et garder sur la glace. Tout en gardant une trace de l’ordre de tranchage, marquer chaque puits de la plaque de 24 puits selon le plan expérimental. Recueillir une tranche de tissu adjacente aux tranches de culture comme une référence zéro heure ou inculte.Recueillir au moins trois tranches de référence pour représenter le haut, le centre et le bas du tissu. Et une fois le tranchage terminé, continuer avec la fixation et le traitement. Après cela, préparez une plaque de six puits contenant 2,5 millilitres de milieu de culture par puits en y plaçant des grilles de titane.Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est formée entre la grille de titane et le milieu. Pour charger une tranche sur la grille garder la plaque de six puits dans une position inclinée de sorte qu’une partie du milieu couvre la grille. Ensuite, placez la tranche dans le milieu sur la grille et utilisez des forceps pour la répandre.Après avoir placé les tranches, chargez les plaques de six puits sur l’unité d’incubation rotative placée à l’intérieur d’un incubateur humidifié maintenu à 37 degrés Celsius avec 95%02 et 5%CO2. Démarrez le cycle de rotation. Pour la culture à long terme reconstituer le milieu de la culture tous les jours en utilisant des forceps stériles pour soulever la grille contenant les tranches de tissu et le placer dans un puits vide de la plaque de six puits.Remplacez 70% du milieu par un milieu de culture frais et replacez la grille. Continuez le cycle de rotation comme précédemment. Pour le traitement médicamenteux sur les tranches de tumeur ajouter 2,5 millilitres de médias avec le médicament dilué ou le contrôle du véhicule dans la plaque de six puits.Placez les grilles de titane dans les puits, puis placez les tranches sur les grilles comme cela a été fait précédemment. Après avoir effectué les traitements pendant 24 heures, continuer avec la fixation et le traitement. Pour commencer à fixer la tranche désirée, transférez-la soigneusement à l’aide de forceps dans une plaque de 10 centimètres contenant un papier filtre trempé rempli de deux à trois millilitres PBS et laissez-la flotter.Soulevez ensuite le papier filtre avec une paire de forceps et placez-le dans une cassette histo. Transférer le papier filtre dans une cassette histo. Ajouter une goutte d’hématoxyline diluée sur le dessus de la tranche de tissu pour marquer la position de la tranche pour les étapes suivantes.Fermez la cassette et transférez-la dans une solution formaline tamponnée neutre de 4 % et laissez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après le lavage et le traitement de la cassette tel que décrit dans le protocole, ouvrez la cassette d’histo et utilisez un scalpel pour soulever soigneusement la tranche fixe du papier filtre. Jeter le papier filtre et transférer la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide.Utilisez un poids plat pour appuyer sur le tissu contre le fond du moule d’intégration pour assurer même la section. Placez la partie inférieure de la cassette histo sur le dessus du moule. Ajouter la paraffine liquide sur le dessus.Et laisser refroidir le moule sur une plaque froide pendant 30 minutes. Après cela séparer le moule refroidi du bloc de paraffine. Utilisez un microtome pour préparer des sections minces de quatre micromètres des blocs de tranches de tissu FFPE.Coupez l’excès de paraffine entourant le tissu. Pour obtenir des sections différentes dans tout le tissu ajuster l’angle du bloc de sorte que la surface du bloc est orientée horizontalement par rapport à la lame. À l’aide d’une fine brosse recueillir des sections séquentielles de tissu de la tranche de tissu paraffine intégrée à partir de la partie supérieure des glissières en verre.Continuez à recueillir les sections des couches tissulaires plus profondes jusqu’au milieu, suivies de la partie inférieure des glissières de verre. La collecte de sections de différentes couches de chaque tranche de tissu aux diapositives d’objet est effectuée pour permettre la capture des gradients potentiels induits par la culture dans la viabilité, la migration cellulaire ou l’expression des biomarqueurs. Après avoir recueilli les sections continuer avec leur traitement et une analyse plus approfondie comme décrit dans le protocole.L’épaisseur des tranches de tissu peut influencer la viabilité des tranches de culture. Dans ce cas, les tranches épaisses de 250 micromètres montrent des gradients de nécrose accrus par rapport aux tranches épaisses de 200 micromètres dues à des tranches plus épaisses qui deviennent sujettes à des carences en oxygène ou en éléments nutritifs dans les tranches. Cependant, les tranches minces de 160 micromètres contiennent de grandes zones nécrotiques probablement causées par la manipulation technique lors du positionnement des tranches car celles-ci sont fragiles et ont tendance à se courber.L’analyse de NKX2-1, un marqueur de l’adénocarcinome pulmonaire bien différencié, montre que son expression n’est pas sensiblement altérée dans les tranches de culture par rapport aux tranches non cultivées de zéro heure. L’analyse quantitative de l’expression NKX2-1 a également confirmé que l’expression n’a pas été sensiblement modifiée dans les tranches cultivées par rapport aux tranches non cultivées, suggérant que le processus de culture n’affecte pas visiblement le statut de différenciation du tissu d’adénocarcinome. Pour vérifier si des tranches de tissu tumoral peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité des médicaments ciblés, elles ont été traitées avec du DMSO ou des quantités titrées de composés.Lorsqu’il est traité avec un dactolisib micromolaire qui cible la phosphorylation de la voie mTOR de 4EBP1 a été inhibé. 0.5 selumetinib de micromolaire qui cible la voie de kinase de MAP était efficace en inhibant la phosphorylation d’ERK1/2. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de travailler avec et d’analyser de façon critique les tranches fraîchement coupées à partir de tissus tumoraux précieux.Notre ancien postdoc, Katja Narhi, a contribué de manière significative à la mise en place de cette méthode en collaboration avec des collègues de la plate-forme IMI Predect Consortium Tissue Slice.

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