Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
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Diese Forschung Arbeit erhielt finanzielle Unterstützung von der Innovative Medicines Initiative gemeinsamen Unternehmens gewähren Vereinbarung no 115188, Universität Helsinki Doctoral Programm in Biomedizin Stipendien (A.S.N.) und Sigrid Juselius und Orion-Farmos Stiftungen (E.W.V.). Wir danken unseren PREDECT Gewebe Slice Plattform Mitglieder des Konsortiums (Taija af Hällström und Siv Knaappila für Unterstützung bei der Einrichtung des Systems Rotator und Riku Turkki für Unterstützung mit der MATLAB-Analyse. Jouko Siro ist bedankte sich für die Erfassung der Abbildung 1-Fotografien. Wir danken dem FIMM WebMicroscope-Team für das Scannen von histologischen, und das Labor Tier Zentrum für Tierhaltung unterstützen.

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	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Verschiedene komplexe in-vitro- Tumor-Modelle, einschließlich 3D Kulturen und Organellen, wurden entwickelt, um die Architektur und onkogenen Funktionen von in Vivo Tumor Gewebe29,30rekapitulieren. Allerdings beinhaltet die Errichtung von 3D Kulturen oder Organellen Gewebe Dissoziation und selektives Wachstum von einem einzigen Zelltyp oder Kokultur eine wählen Sie einige Zelltypen in einer künstlichen Umgebung. Als Folge erfassen solcher Modelle unvollständig die Feinheiten des Tumor-Heterogenität und Tumor-Stroma-Interaktionen. Organotypischen Tumor Scheiben, halten auf der anderen Seite die Gewebe Architektur und biologischen Komplexität der Tumor in Situ ohne umfangreiche Manipulation. Diese Fähigkeit des Gewebe-Scheiben, Modell Tumorzellen in ihrer nativen Mikroumgebung macht sie besonders attraktiv für präklinische Studien. Wir berichteten bereits einen optimierten Workflow für die Einrichtung und Analyse der Tumor präzise geschliffenen Scheiben und zeigten, dass, im Vergleich um zu filtern, unterstützt, eine Inkubation Dreheinheit verbessern die Lebensfähigkeit der kurzfristigen murinen NSCLC Slice Kulturen25 , 31. jedoch Anbau auf rotierenden Einheiten ist technisch anspruchsvoll und erfordert eine ständige Überwachung. Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für Tumor-Gewebe-Slice-Generation und praktischen Einsatz einer rotierenden Inkubation Einheit um ihnen Kultur, sowie begleitende Methoden, um die Fähigkeit der Scheiben, in Situ Tumorbiologie Voraussetzung vor der Droge erfassen überwachen Antwort-Tests.
Mehrere wichtige Schritte im Protokoll sicherzustellen Gewebe Integrität und Lebensfähigkeit der Tumor Scheiben. Wenn normale Lungengewebe den Tumor umgibt, kann der Vibratome mit inkonsistenten dicke Scheiben zu generieren oder die Scheiben aufgrund von Unterschieden in Struktur und Steifigkeit zwischen normalen und Tumor-Gewebe beschädigen. Es ist daher wichtig, die umliegenden normalen Lungengewebe vor Tumor schneiden zu entfernen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist das slicing Dicke, die sorgfältig für jeden Gewebetyp optimiert werden soll. Darüber hinaus einmal in Scheiben geschnitten, ist es wichtig, dass die Scheibe etwa in der Mitte das Raster, also genau darauf intermittierende eintauchen in Kulturmedium und Sauerstoff Exposition platziert wird. Schließlich ist es wichtig, die Position eines Segments während der Rotationszeit, zu folgen, wie eine Scheibe auf das Medium im Dropdown kann; in diesem Fall können weitere Maßnahmen ergriffen werden, wie in Schritt 3.6 des Protokolls erklärt.
Neben Gewebe Handhabung um die Integrität zu gewährleisten gibt es auch wichtige Schritte in der IHC-Analyse zu interpretieren, wie die Scheibe der nativen Gewebe ähnelt. Unsere früheren Studie zeigte, dass murine NSCLC-Tumoren ausgeprägte Intra-Tumor räumliche Heterogenität in onkogenen Signalisierung Aktivitäten26aufweisen. Dies bedeutet, dass die Verwendung von räumlich unterschiedliche Gewebe für Steuerelemente Scheiben oder Medikament behandelten Proben zuverlässige experimentelle Dateninterpretation beeinflussen können und daher dicht benachbarte Scheiben als Kontrollen und Proben verwendet werden sollte. Wir weiter gezeigt, dass bei der Vermehrung oder onkogenen Phosphoprotein Ausdruck im frisch geschnittenen unkultiviert 0 h Scheiben waren ähnlich wie in Situ Tumoren, kultivierte Scheiben zeigte veränderte Onkogene Phosphoprotein Ausdruck, speziell veränderten p4EBP1 und pSRC sowie veränderte Verbreitung von Ki67 IHC analysiert. Veränderte p4EBP1 Ausdruck wurde ebenso in 24 h entdeckt menschliche NSCLC und Prostatakrebs schneiden Kulturen (Narhi Et Al., ergänzende Abbildung S3B-S3C, S5 und S7)26. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Vergleich der kultivierten Scheiben mit ihren nächstgelegenen 0 h unkultiviert Slice entscheidend ist für die Erhaltung der in Situ Tumor Funktionen in kultivierten Scheiben zu beurteilen.
Trotz der Verbesserung der Rentabilität des organotypischen Scheiben25, gibt es Einschränkungen mit dem Rotator System in Bezug auf die technischen Details. Die Gewebe-Scheiben auf Titan-Gitter ist schwieriger im Vergleich um zu filtern, Einsätze und eine Inkubation Dreheinheit möglicherweise nicht verfügbar. Als Alternative stagnierende Filter unterstützt können verwendet werden, aber in diesem Fall nur die Luft-exponierten Seite der Scheiben sollte analysiert werden, da Luftfilter-Gradienten in Lebensfähigkeit und Hypoxie gemessen HIF1α Ausdruck schnell im Filter unterstützt Scheibe gebildet werden Kulturen (Davies Et Al., Abbildung 5 und Abbildung 7A-7 b)25. Wir haben ferner gezeigt, dass Tumor Slice Kulturen veränderte Verbreitung und onkogenen Signalisierung Aktivitäten im Vergleich zu ihrer Muttersprache Tumoren26, möglicherweise wegen der Wundheilung Antworten oder metabolische Anpassung der Scheiben zu ex Vivo aufweisen kann Kultur32. Obwohl grob morphologischen Merkmale der murinen NSCLC-Tumoren während 72 h Anbau beibehalten wurden, können Kultur-induzierten proliferative Veränderungen beeinflussen genaue Einstufung der kultivierten Scheiben. Daher sollten Gewebe Scheiben nur für kurzfristige funktionelle Studien genutzt werden.
Verwendung einer rotierenden Inkubation Einheit rettet zumindest teilweise Intra-Slice Lebensfähigkeit oder Biomarker Ausdruck Steigungen, besonders während der ersten 24 Std. Kultur. Sobald auf Integrität und Funktion geprüft, bietet das Gewebematerial für funktionelle Studien, wie z. B. Behandlung Medikamentenstudien. Neben Medikament Antwort Profilierung profitieren veränderte Zielausdruck folgt medikamentöse Behandlung auch Antikörper-Validierung. Dies gilt insbesondere für den Nachweis von murinen Epitope mit Maus monoklonalen Antikörpern, da diese tendenziell hohen Färbung Hintergrund geben. Darüber hinaus sind gut validierte Antikörper erforderlich, um zuverlässige und reproduzierbare Daten in diagnostischen und klinischen Einstellungen zu erreichen. So bietet Modulation der Fülle oder Phosphorylierung des relevanten Epitope nach medikamentöse Behandlung in Geweben Scheiben eine handliche praktische Anwendung in Antikörper-Validierung. Ein großer Vorteil der Tumor Slice Kulturen ist die Fähigkeit, räumlich verteilt Modellfunktionen, einschließlich onkogenen Signalisierung Aktivitäten oder Medikamente im Tumor oder Stromazellen Zellen, wodurch sie eine attraktives ex Vivo Modell. Jedoch Scheiben drehen während des Anbaus und der Prozess der Anbau kann weitere Schäden des Gewebes besonders an den Rändern. Es ist daher genau Overlay die Biomarker-gefärbten IHC Bilder von 0 h-Scheiben mit den nekrotischen Regionen erkannt in kultivierten Scheiben schwierig die beeinträchtigt die Fähigkeit, präzise räumliche Biomarker Aktivitäten verknüpfen, Medikamente. Darüber hinaus sind Tumor-intrinsische, Kultur-induzierte und Medikamenten-induzierten nekrotische Reaktionen zumindest in murinen NSCLC Gewebe Scheiben, Kompromisse bei der genaue Quantifizierung der räumlichen Medikament Antworten zu unterscheiden. Schließlich erlaubt die Verwendung von Tumor Slice Kulturen ein Forscher auf dem Prüfstand mehrere Verbindungen auf den gleichen Tumor ohne eine Notwendigkeit zur Behandlung von Tieren, so zu verfeinern, zu reduzieren und Labor Tierversuche zu ersetzen.
Als zukünftige Anwendung kann das beschriebene Protokoll klinischen solide Tumorproben angenommen werden. Gewebe-Typ-abhängige Änderungen oder Optimierungen sind weitere wahrscheinlich erforderlich, beginnend mit Anpassungen an die Vibratome Einstellungen einschließlich Slice Dicke und Vibration Geschwindigkeit um diesen Tumor Textur oder Steifigkeit zu optimieren. Darüber hinaus variieren die Nährstoff- und Wachstumsfaktor Anforderung für verschiedene Tumorgewebe. Als Beispiel haben Brust Krebs Scheiben mit Insulin in die mittlere13,18ergänzt kultiviert worden. Angesichts der Tatsache, dass begrenzte Gewebematerial während der Operation oder Biopsie vorliegt, kann Optimierung des Patienten abgeleitet Tumor Slice Kulturen schwierig sein, aufgrund von Schwierigkeiten bei der Beschaffung von replizieren Proben in ausreichender Zahl. Reproduzierbarkeit der Daten wird darüber hinaus auch durch herausgefordert ausgesprochen von Patient zu Patient Probe Heterogenität, insbesondere der Anteil der Tumorzellen gegen fibrotische Regionen oder Stromazellen Infiltrate sowie nekrotische Gewebeanteile. Schließlich müsste Anwendung der Tumor Scheiben in Diagnoseeinstellungen Untersuchung über das Ausmaß, welches Medikament Antworten in Scheibe Explantaten der Vorbehandlung Biopsien zur Nachbehandlung in Vivo Antworten entspricht.

Solide Tumorgewebe, einschließlich Lungenkrebs, genetische und phänotypische Heterogenität aufweisen und beherbergen komplexe Mikroumgebungen1,2. Das Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und deren umliegenden Mikroumgebung Einfluss auf Droge Sensibilität und Widerstand Mechanismen3. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der präklinischen Modellen, die biologischen Komplexität und Funktionen in native Tumoren handeln genau modelliert werden können. Präzise geschliffenen Scheiben sofort frische Tumoren abgeleitet bieten eine einzigartige Ressource, da sie eine wesentliche Fähigkeit, in Vivo Biologie, zumindest für ein kurzes Zeitfenster, einschließlich Phänotypen räumlich verteilt in einem einzelnen Tumor dar haben. Resezierten klinische Tumoren sind eines der wenigen personalisierte Exemplare, die aus einem Krebspatienten erzielt werden kann, und ihre diagnostische Anwendung verdient Aufmerksamkeit.
Die Geschichte des organotypischen Kulturen stammt aus demfrühen 19. Jahrhundert, als menschliche intrakranielle Tumoren handgeschliffene in Gewebe Stücke und kultivierten mit der so genannten waren hängen Drop-Methode. Gewebefragmente waren mit einem Deckgläschen verbunden und erlaubt in heparinisierten Humanplasma, Tauchen, nach dem die Deckgläsern invertiert, versiegelt und für mehrere Wochen4kultiviert wurden. Tumor Stücke sind seit kultiviert mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie z. B. auf Plasma Klumpen5in flüssigen Medien6, oder auf 0,45 µm Porengröße Größe Filter6manuell zu schneiden. Der Begriff "organotypischen" wurde erstmals im Jahr 1954, in einer Studie von retinalen Differenzierung der Küken Embryos Auge7verwendet. Es folgten Studien, die Lunge und Herz Gewebe Explantaten abgeleitet von Küken Embryonen8und Gehirn Explantaten von erwachsenen Ratten9verwendet.
Verschiedenen Slice Methoden wurden beschrieben, nämlich manuelle Chopper10,11, Krumdieck Gewebe Hobel12,13und Vibratomes11,14,15, 16. Das Krumdieck Gewebe Hobel erzeugt zylindrische Gewebe Kerne, die dann in kreisförmigen Gewebe Scheiben mit einem Mikrotom geschnitten sind. Ein Vibratome nutzt auf der anderen Seite eine vibrierende Klinge Mikrotom. In einer Studie über Leber Scheiben zeigte sich, dass die Leica Vibratome mehr reproduzierbaren und konsequente Scheiben im Vergleich mit dem Krumdieck Slicer15erzeugt. Slice-dicken von 250 bis 500 µm verwendet wurden, und Studien berichten Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und morphologische Merkmale sogar bis zu 16 Tage14,10,17,18. Allerdings Tumoren haben Variable Stoffwechselprofile, die Nährstoffansprüche beeinflussen können, und Parameter wie Gewebe Steifigkeit und Matrix-Zusammensetzung können Einfluss auf Belüftung und Nährstoffe fließen. Es ist daher wahrscheinlich, dass jeder Gewebetyp Optimierung der schneiden und Kultur erfordert.
Verschiedenen Anbaumethoden wurden verwendet, um die Scheibe Kulturen unterstützen: ich) stationäre Interphase Kultur, auch genannt stagnierenden Unterstützung Kultur, in denen Scheiben sich am Anfang einer halbdurchlässigen Membran einfügen in das Kulturmedium getaucht befinden. Dabei ist oben auf die Scheiben der Luft ausgesetzt, während der Boden mit Nährstoffen über die poröse Einlage14,19ergänzt wird; (II) die Kelle, ursprünglich entwickelte Methode Kultur ganze Organe oder embryonalem Gewebe Scheiben. In diesem Scheiben wurden auf einer Baumwolldecke oder eines Filters, unterstützt durch ein Metallgitter platziert, und der Filter wird in das Kulturmedium getränkt. Um das Gewebe feucht zu halten, wird eine dünne Schicht des Mediums auf die Scheiben20,21,22hinzugefügt. Diese ersten beiden sind sogenannte Luft-Flüssigkeit Interphase Kulturen; III) Walze Rohr Kulturen, in denen Scheiben befinden sich im Inneren der flachen Seite des ein Kunststoffrohr mit Medium und langsam Rohr Rotation sorgt dafür, dass das Gewebe ist mit Medium während des ersten Teils des Zyklus bedeckt oder während der zweiten23belüftet; (IV) rotierenden Inkubation Einheiten, in denen Scheiben zeitweise Medium mit Nährstoffen und Belüftung ausgesetzt sind. Anders als bei Roller Röhren, bei dieser Methode werden die Scheiben auf porösen Titan Abtropfgitter in 6-Well-Platten mit Kulturmedium24platziert sind.
Gewebe-Scheiben abgeleitet resezierten soliden Tumoren logischerweise vorhanden eine attraktives Ex Vivo Modell, testen Sie den Behandlungserfolg der Anti-Krebs-Wirkstoffe, wie sie die Bewertung der Tragfähigkeit ermöglichen, gezielte Weg Aktivität und molekularen Profile eines spezifischen Tumors im Beisein seiner nativen Tumor Mikroumgebung. Um festzustellen, ob die Droge Reaktionen gemessen in Tumor Scheiben prädiktiv für in Situ Antworten sind, ist es jedoch wichtig zu analysieren, in welchem Umfang Gewebe Scheiben tumorspezifischen biologische Funktionen wie Zellproliferation zu bewahren, Histopathologie-spezifische Zelldifferenzierung oder onkogenen Signalisierung Aktivitäten. Die Auswirkungen von mechanischen Stress löste bei Slice Vorbereitung, Slice Handhabung oder Kultur-induzierte Anpassungen auf die Qualität und die biologischen Funktionen des Gewebes Scheiben sind grundlegende Fragen, die eng miteinander verbunden, die Fähigkeit zur Umsetzung Tumor abgeleitet Scheiben für Funktionsdiagnostik.
Unser Konsortium IMI-finanzierte Projekt PREDECT (http://www.predect.eu) legt systematisch an diese grundlegenden Fragen von Slice-Explantaten aus einer Vielzahl von Quellen zu studieren. Mit Scheiben von Brust-, Prostata- und Lungenkrebs Krebs-Modellen abgeleitet, diese gemeinsame Anstrengung genutzt, qualitative auslesen sowie quantitative Hämatoxylin und Eosin (H & E) - basierte anzeigen zu zeigen, eine Voraussetzung für Luftsauerstoff und stagnierenden filter unterstützt um die Lebensfähigkeit des kultivierten Scheiben bis zu 72 h aufrecht zu erhalten. Immunhistochemie (IHC) Analysen auf kultivierten Scheiben ergab darüber hinaus Intra-Slice Lebensfähigkeit Steigungen, belegt als Nekrose Gradienten in Scheiben von murinen nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Östrogen-Rezeptor (ER), HIF1α abgeleitet und γH2AX Gradienten in Brust-Krebs-Scheiben oder Androgen-Rezeptor (AR) Ausdruck Steigungen bei Prostatakrebs Scheiben25. Interessanterweise, Intra-Slice Lebensfähigkeit Gradienten im 24 h-Kulturen von murinen NSCLC wurden gerettet durch Anbau in einer Dreheinheit Inkubation, und unsere Studie zeigte, dass Tragfähigkeit bis 72 h26erweitert wurde. Besonders die Oberseite blieb praktikabelste26, befürwortet, dass Medikament Antwort Analysen auf Scheiben am besten auf dieser Seite des Gewebes durchgeführt werden.
Obwohl es bleibt eine Frage, wie viel Gewebe Scheiben können in Situ Tumor Funktionen zusammenfassen, sie wurden ausgiebig genutzt, um Antworten auf Anti-Krebs-Mittel, insbesondere zielgerichteten Medikamenten, monoklonale Antikörper und Chemotherapeutika testen 10,11,13,14,18,27. Wir zeigten kürzlich, dass murine NSCLC Scheiben dynamische Veränderungen in Verbreitung zeigen und Onkogene Signalisierung Aktivitäten nach Anbau im Vergleich zu 0 h frisch geschnittenen Scheiben26. Dies bedeutet, dass es wichtig ist zu untersuchen, ob die gezielte in Situ biologische Funktionen entsprechend während des Anbaus vor Störung Studium erhalten bleiben. Trotz dieser Erkenntnisse zeigten wir, dass Tumor Scheiben räumliche Reaktion auf gezielte Therapien, inmitten Medikament modellieren können Behandlungen bleiben kurz (24 h) und werden zu Beginn der Kultivierung26initiiert. Das folgende Protokoll beschreibt wichtige Bestätigung für die Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Kulturen, vor deren Anwendung in der pharmakologischen Drogentests relevanten Aspekte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypischen primäre Explant Gewebekulturen, die darunter präzise geschliffenen Scheiben, repräsentieren die dreidimensionale (3D) Gewebearchitektur sowie die vielzelligen Interaktionen von nativen Gewebe. Gewebe-Scheiben schneiden sofort frisch resezierten Tumoren erhalten räumliche Aspekte des Intratumor Heterogenität, wodurch sie nützliche Surrogate in Vivo Biologie. Sorgfältige, Optimierung der Scheibe Vorbereitung und Anbau Gewebeverhältnisse ist wesentlich für die prädiktive Diagnostik Potential der Tumor explants Slice. In diesem Zusammenhang sind murine Modellen wertvoll, wie diese bieten einen konstanten Durchfluss von Tumormaterial zu replizieren und reproduzierbare Experimente durchführen. Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung der murine Lung Tumor gewonnenem Gewebe Scheiben mit einer rotierenden Inkubation-Einheit, ein System, das ermöglicht die intermittierende gegenüber der Gewebe mit Sauerstoff und Nährstoffen. Unsere bisherige Arbeit zeigte, dass die Verwendung von rotierenden Inkubation Einheiten die Lebensfähigkeit des Gewebes im Vergleich zu anderen Kultur verbessert, vor allem schwimmende Scheiben und stagnierenden Filter unterstützt. Hier zeigen wir weiter, dass Scheibendicke die Lebensfähigkeit beeinflusst des kultivierten Scheiben, was darauf hindeutet, dass Optimierung der Scheibendicke getan werden für verschiedenen Gewebetypen. Ausgesprochen ITH in relevanten onkogenen Funktionen wie Signalisierung Aktivitäten, stromale Zelle eindringen oder Ausdruck der Differenzierung Marker, erfordert Auswertung der angrenzenden Gewebe Scheiben für die Expression von Markern, die durch medikamentöse Behandlung verändert oder Anbau, selbst. Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die Generation der murine Lung Tumor Scheiben und ihre Kultur auf eine Dreheinheit Inkubation und zeigt, wie Scheiben für den Ausdruck der heterogenen Gewebe Marker als Voraussetzung systematisch analysiert werden sollte vor der Antwort Medikamentenstudien.

Abbildung 1 stellt den Workflow für die Generation, Anbau und Analyse von präzise geschliffenen Gewebe Scheiben aus murinen NSCLC-Tumoren abgeleitet. In dieser Demo verwendet wir Tumoren aus einer gentechnisch Mausmodell (GEMM) beherbergen bedingte Aktivierung des KrasG12D zusammen mit dem Verlust von Lkb1 (auch bekannt als Serin/Threonin-Kinase 11), nachstehend KL. Maus-Zucht und Lunge Tumorentstehung erfolgte wie in26,28beschrieben. Abbildung 2A zeigt die Wirkung der Scheibendicke Gewebe auf die Lebensfähigkeit des Scheiben-kultivierte für 24 h mit einer rotierenden Inkubation-Einheit. Die Ergebnisse zeigen, dass 160 µm dünne Scheiben nekrotische großflächig über die Scheibe enthalten. Darüber hinaus zeigen 250 µm dünne Scheiben eine Nekrose Farbverlauf über die Scheibe im Vergleich zu 200 µm dünne Scheiben schneiden. Es ist wahrscheinlich, dass die Armen Insgesamte Lebensfähigkeit der dünnste 160 µm, durch technische Abwicklung verursacht wird bei der Positionierung der Scheiben auf die Netze, wie diese sind empfindlich und neigen zu locken. Auf der anderen Seite, wenn Scheiben zu dick sind, sie anfällig für Mangel an Sauerstoff oder Nährstoffen Diffusion über die Scheiben werden können, wird die in murinen NSCLC explants als nekrotische Tod gradient25belegt. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass mit variabler dicke Scheiben von einem Tumor, trotz Verwendung von identischen Vibratome Einstellungen erzeugt werden können. Es empfiehlt sich daher, mehrere Wiederholungen aus verschiedenen Tumorproben zu analysieren. Wichtig ist, erfordert jeden Gewebetyp Slice Dicke Optimierung maximale Rentabilität zu erreichen, da Gewebe Textur und Härte Sauerstoffversorgung und Nährstoffe fließen beeinflussen können. Abbildung 2 b -2C veranschaulicht quantitative IHC Analysen der NKX2-1 Expression, eine Markierung von gut differenziertem Lunge Adenokarzinom (AC) in Proben kultiviert bis zu 72 h und 0 h Scheiben abgestimmt. Ergebnisse zeigen, dass NKX2-1 Expression nicht erheblich, in kultivierten Scheiben im Vergleich zu 0 h unkultiviert Scheiben geändert wird, was darauf hindeutet, dass der Prozess der Anbau nicht offen den Differenzierung Status des Tumorgewebes AC auswirkt. Abb. 2D zeigt das Dienstprogramm Tumor Gewebe Scheiben für die Bewertung der Wirksamkeit der zielgerichteten Medikamenten. Wir zeigte kürzlich, dass Kras mutierten murinen ACs Ausstellung hohe Expression von phosphorylierten ERK1/2 (Kennzeichnung MAPK Weg Überaktivität) im Vergleich zu adenosquamöse (ASC) Tumoren, beim Ausdruck der phosphorylierten 4EBP1 (Markierung mTOR-Aktivität ) in ähnlicher Weise äußert sich in AC und ASC Tumoren. Um zu testen, ob diese Bahnen auf Gewebe Scheiben zielgerichtet, KL AC Gewebe Scheiben mit DMSO behandelt wurden oder titriert Mengen Verbindungen, nämlich 0,1 – 1 µM Dactolisib, Ziel der mTOR-Signalweg oder 0,05 – 0,5 µM Selumetinib, MAPK Weg zu Zielen. Ergebnisse zeigen, dass 1 µM Dactolisib oder 0,5 µM Selumetinib sind wirksam bei der Hemmung der Phosphorylierung von 4EBP1 oder ERK1/2, beziehungsweise. Darüber hinaus deutet dosisabhängige Inhibition der gezielten Phosphoproteine Gewebe Scheiben auch ausgenutzt werden können, um Phosphorylierung-spezifische Antikörper zu überprüfen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows für Einrichtung und Analyse der murinen NSCLC Tumor abgeleitet Slice Explantaten. (A) Schema beschreibt die Sammlung und Aufbereitung von Tumor-tragenden Lungen zum Schneiden. Lungenlappen werden von einer Maus geerntet und Tumorgewebe wird vom normalen Gewebe durchschnitten. Die schwarze Pfeilspitze und Sternchen zeigen ca. 4 mm und 1 mm Tumoren bzw.. Die weiße Pfeilspitze zeigt Lungengewebe geklebt, um die Oberfläche der Probenhalter. Der rote Pfeil zeigt auf ein zusätzliches Stück normale Lungengewebe Unterstützung, den Tumor in einer aufrechten Position zu behalten. (B) Vibratome schneiden und Sammlung von Gewebe-Scheiben. Weißer Pfeil zeigt die Slice Richtung. Sammlung von sequentiellen Scheiben in einer 24-Well-Platte mit kalten HBSS + P/S. Die Scheiben können entweder kultiviert zu verschiedenen Zeitpunkten (hier: 24-72 h) tumorspezifischen Marker Ausdruck während des Anbaus (obere Zeile) zu beurteilen, oder können zur medikamentösen Behandlungen durchführen. C: Fahrzeugkontrolle, T: medikamentöse Behandlung. (C) der Gewebe-Scheibe für den Anbau mit rotierenden Inkubation Einheiten platzieren. Kippen Sie 6-Well-Platte zu, so dass einige Medium den oberen Rand des Rasters bedeckt, legen Sie die Gewebe-Scheibe in der Mitte des Rasters auf dem Medium und verbreiten Sie das Slice mit Pinzette zu. Sicherstellen Sie, dass die 6-Well-Platten Gewicht für eine gleichmäßige Drehbewegung Zyklus ausgeglichen werden. X: zeigt falsche, und <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: zeigt die korrekte Positionierung des Segments. (D) Foto von der Proteinkinase-Block eines Tumor-Segments. Schwarzer Pfeil auf Paraffin-eingebetteten Gewebe Slice gefärbt mit Hämatoxylin. (E) Schaltpläne zeigen die Stationspunkte Reihenfolge der Scheiben in FFPE-Blöcken; Diese Abschnitte können verarbeitet werden, um Gewebe Lebensfähigkeit und Tumor-spezifische Biomarker Ausdruck zu bewerten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Abbildung 2: Beurteilung der Lebensfähigkeit und Histotype-spezifische Marker Ausdruck und gezielte medikamentöse Behandlung auf NSCLC Gewebe Scheiben. (A) Vertreter H & E Bilder von AC NSCLC Scheiben von der angegebenen dicken kultiviert für 24 Std. 200 µm dünne Scheiben halten bessere Rentabilität im Vergleich zu 160 µm und 250 µm dünne Scheiben schneiden. Dunkelblaues Blau steht für H & E gefärbt tragfähige Gewebe und Rosa zeigt pseudocolored nekrotische Regionen. Hellblau zeigt Regionen, die aus der Analyse, entweder durch schlechte Gewebe Qualität oder das Vorhandensein von fibrösen Stroma ausgeschlossen. T1 und T2 sind biologische Wiederholungen von zwei verschiedenen Tumoren abgeleitet. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) repräsentative IHC Bilder von NKX2-1 Expression in AC-Scheiben für den angegebenen Zeitpunkten kultiviert. Pfeil zeigt den Bereich, in stärkerer Vergrößerung dargestellt. Ergebnisse zeigen, dass NKX2-1 Expression in den kultivierten Scheiben im Vergleich zu 0 h Scheiben nicht verändert wird. Maßstabsleiste = 500 µm und 50 µm für niedrige und hohe Vergrößerungen, beziehungsweise. (C) Quantifizierung der in (B) dargestellten Daten. (D) Vertreter IHC Bilder von phosphorylierten 4EBP1 oder pERK1/2 Ausdruck in 0 h Scheiben oder Scheiben mit DMSO behandelt oder titriert Mengen an Dactolisib (Dact, oberste Zeile) oder phosphoryliert pERK1/2 Ausdruck 0 h Slice oder Scheiben mit DMSO behandelt oder Selumetinib (Sel, untere Reihe). Schwarze Kästchen zeigen Bereiche in stärkerer Vergrößerung dargestellt. Maßstabsleiste = 1 mm oder 50 µm für niedrige oder hohe Vergrößerung, beziehungsweise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Wir stellen eine Methode zur Energieerzeugung, Anbau und systematische Analyse der organotypischen Scheiben aus murinen Lungentumoren abgeleitet. Wir beschreiben auch für Scheibendicke optimieren und das Medikament Konzentrationen zur Behandlung von Tumor-Scheiben auswählen.

Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Explants als Voraussetzung für diagnostische Tests

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der präklinischen Forschung zu beantworten, wo Arzneimittelreaktionsstudien in Tumorscheibenexplanten diagnostischen Zwecken dienen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Slice-Explants für ein kurzes Zeitfenster die komplexe Biologie nativer Gewebe einschließlich räumlich verteilter Funktionen modellieren können. Obwohl diese Methode Einblick in die Verwendung von Scheiben aus murinen Lungentumoren bieten kann, Kann es auch auf andere Gewebetypen einschließlich menschlicher Gewebe angewendet werden.Bereiten Sie zunächst das Vibratome vor und führen Sie einen VibraCheck gemäß den Anweisungen im Handbuch durch. Dann füllen Sie jeden Brunnen der 24-Well-Platte mit einem Milliliter Hanks Balanced Salzlösung, ergänzt mit Penicillin und Streptomycin und halten Sie die Platte auf Eis. Legen Sie 25-Spur-Nadeln in alle vier Pfoten einer eingeschläferten Maus auf einen Styropordeckel, so dass die Brust ausgesetzt und das Tier gedehnt wird.Sprühen Sie 70% Alkohol auf die Oberfläche der exponierten Haut. Verwenden Sie eine Schere in einer abgewinkelten Position, um die Haut vom Bauch zur Brust und bis zum Halsbereich zu schneiden. Dehnen Sie die Haut auf beiden Seiten mit Zangen und setzen Sie 25-Spur-Nadeln ein.Den Bauchbereich aufschneiden. Dann den Rippenkäfig und das Zwerchfell aufschneiden, um Die Lunge und das Herz freizulegen. Setzen Sie die Luftröhre aus, indem Sie das umgebende Gewebe abschneiden.Sezieren Sie die Lunge zusammen mit dem Herzen. Legen Sie das Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre mit 30 Millilitereisis HBSS, ergänzt durch Pen-Strep auf Eis gelegt und gehen Sie so schnell wie möglich zum nächsten Schritt. Übertragen Sie nun die tumortragende Lunge in eine 10-Zentimeter-Gewebekulturplatte.Verwenden Sie sterile Schere und Zangen, um die Lungenlappen zu trennen und Lappen mit Tumoren an der Oberfläche zum Schneiden auszuwählen. Legen Sie einen Lungenlappen mit einem Tumorgewebe auf ein Stück Filterpapier, um ein Verrutschen zu vermeiden und einen Teil der normalen Lunge oder zusätzliches Tumorgewebe, das den Tumor umgibt, mit einem sterilen Skalpell auszuschneiden, um eine flache Gewebestückoberfläche zu erzeugen. Tauchen Sie die flache Seite in einen Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff und montieren Sie sie auf den Vibratom-Probenhalter, so dass der Tumor der Klinge in aufrechter Position gegenübersteht, und lassen Sie sie zwei bis drei Minuten trocknen.Legen Sie den Vibram-Probenhalter in die Metallpufferschale. Füllen Sie das Tablett mit kaltem HBSS, ergänzt durch Pen-Strep, bis das Gewebe in den Puffer eingetaucht ist. Bedecken Sie die Pufferschale mit dem Plexiglasdeckel, der mit dem Instrument geliefert wird, und legen Sie das Tablett in ein weißes Eisbad und fügen Sie Eis hinzu, um das Gewebe während des Schneidens kühl zu halten.Befestigen Sie das weiße Eisbad am Vibratome. Wählen Sie dann die passenden Schnitteinstellungen aus und beginnen Sie mit dem Schneiden. Bringen Sie die Vibratomklinge in die Schnittposition und stellen Sie das Schneidfenster ein.Verwenden Sie sterile Zangen, um die Scheiben in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter HBSS ergänzt mit Pen-Strep pro Brunnen gefüllt zu sammeln und auf Eis zu halten. Markieren Sie bei der Verfolgung der Schnittreihenfolge jeden Brunnen der 24-Well-Platte gemäß dem Versuchsplan. Sammeln Sie eine Gewebescheibe neben den kultivierten Slices als Null-Stunden- oder unkultivierte Referenz.Sammeln Sie mindestens drei Referenzscheiben, um die Ober-, Mittel- und Unterseite des Gewebes darzustellen. Und sobald das Schneiden abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Befestigung und Verarbeitung fort. Danach bereiten Sie eine Sechs-Brunnen-Platte mit 2,5 Milliliter Kulturmedium pro Brunnen vor, indem Sie Titangitter darin platzieren.Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem Titangitter und dem Medium gebildet werden. Um eine Scheibe auf das Gitter zu laden, halten Sie die Sechs-Well-Platte in einer abgewinkelten Position, so dass ein Teil des Mediums das Gitter bedeckt. Legen Sie dann die Scheibe im Medium auf das Gitter und verwenden Sie Zangen, um sie zu verbreiten.Nach dem Platzieren der Scheiben die Sechs-Brunnen-Platten auf die rotierende Inkubationseinheit laden, die in einem befeuchteten Inkubator platziert ist, der bei 37 Grad Celsius bei 95%02 und 5% CO2 gehalten wird. Starten Sie den Rotationszyklus. Für den langfristigen Anbau füllen Sie das Kulturmedium jeden Tag auf, indem Sie sterile Zangen verwenden, um das Gitter mit den Gewebescheiben zu heben und in einen leeren Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte zu legen.Ersetzen Sie 70 % des Mediums durch ein frisches Kulturmedium, und platzieren Sie das Raster wieder ein. Setzen Sie den Rotationszyklus wie zuvor fort. Zur medikamentösen Behandlung auf den Tumorscheiben fügen Sie 2,5 Milliliter Medien mit dem verdünnten Medikament oder Fahrzeugkontrolle in die Sechs-Brunnen-Platte.Legen Sie die Titangitter in die Brunnen und legen Sie die Scheiben dann wie zuvor auf die Gitter. Nach der Durchführung der Behandlungen für 24 Stunden, fahren Sie mit der Fixierung und Verarbeitung fort. Um die gewünschte Scheibe sorgfältig zu fixieren, übertragen Sie sie vorsichtig mit Zangen in eine 10-Zentimeter-Platte mit einem eingeweichten Filterpapier, das mit zwei bis drei Millilitern PBS gefüllt ist, und lassen Sie es schweben.Heben Sie dann das Filterpapier mit einer Zange heraus und legen Sie es in eine Histo-Kassette. Übertragen Sie das Filterpapier in eine Histokassette. Fügen Sie einen Tropfen verdünntes Hämatoxylin auf die Gewebescheibe, um die Position der Scheibe für die nachfolgenden Schritte zu markieren.Schließen Sie die Kassette, und übertragen Sie sie in 4%neutral gepufferte Formalin-Lösung und lassen Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen und Verarbeiten der Kassette, wie im Protokoll beschrieben, öffnen Sie die Histo-Kassette und verwenden Sie ein Skalpell, um die feste Scheibe vorsichtig aus dem Filterpapier zu heben. Entsorgen Sie das Filterpapier und übertragen Sie die Scheibe in eine Form, die flüssiges Paraffin enthält.Verwenden Sie ein flaches Gewicht, um das Gewebe gegen den Boden der Einbettform zu drücken, um eine gleichmäßige Schnittbildung zu gewährleisten. Legen Sie den unteren Teil der Histo-Kassette auf die Form. Fügen Sie flüssiges Paraffin darauf.Und lassen Sie die Form auf einer kalten Platte für 30 Minuten abkühlen. Danach trennen Sie die gekühlte Form vom Paraffinblock. Verwenden Sie ein Mikrotome, um vier Mikrometer dünne Abschnitte der FFPE-Gewebescheibenblöcke vorzubereiten.Schneiden Sie den Überschuss an Paraffin, der das Gewebe umgibt, weg. Um gleichmäßige Abschnitte im gesamten Gewebe zu erhalten, passen Sie den Winkel des Blocks so an, dass die Oberfläche des Blocks horizontal in Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist. Mit einer dünnen Bürste sammeln sequentielle Gewebeabschnitte der Paraffin-eingebetteten Gewebescheibe beginnend am oberen Teil der Glasgleitet.Sammeln Sie die Abschnitte der tieferen Gewebeschichten in der Mitte weiter, gefolgt vom unteren Teil der Glasgweise. Die Sammlung von Abschnitten aus verschiedenen Schichten jedes Gewebesegments zu den Objektfolien wird durchgeführt, um die Erfassung potenzieller kulturinduzierter Gradienten in Lebensfähigkeit, Zellmigration oder Biomarker-Expression zu ermöglichen. Nach dem Sammeln der Abschnitte wird mit der Verarbeitung und weiteren Analyse, wie im Protokoll beschrieben, fortgesetzt.Die Dicke der Gewebescheiben kann die Lebensfähigkeit kultivierter Scheiben beeinflussen. In diesem Fall weisen 250 Mikrometer dicke Scheiben erhöhte Nekrosegradienten auf, verglichen mit 200 Mikrometer dicken Scheiben, da dickere Scheiben anfällig für Sauerstoff- oder Nährstoffdiffusionsstörungen in den Scheiben werden. Jedoch, 160-Mikrometer dünne Scheiben enthalten große nekrotische Bereiche wahrscheinlich durch technische Handhabung während der Positionierung der Scheiben verursacht, da diese zerbrechlich sind und neigen dazu, zu krümmen.Die Analyse von NKX2-1, einem Marker für gut differenziertes Lungenadenokarzinom, zeigt, dass seine Expression in kultivierten Scheiben im Vergleich zu nullstündigen unkultivierten Scheiben nicht signifikant verändert wird. Die quantitative Analyse des NKX2-1-Expressions bestätigte ferner, dass der Ausdruck in kultivierten und unkultivierten Scheiben nicht signifikant verändert wurde, was darauf hindeutet, dass der Kultivierungsprozess den Differenzierungsstatus des Adenokarzinomgewebes nicht sichtbar beeinflusst. Um zu testen, ob Tumorgewebescheiben verwendet werden können, um die Wirksamkeit von gezielten Medikamenten zu bewerten, wurden sie mit DMSO oder titrierten Mengen von Verbindungen behandelt.Bei Behandlung mit einem Mikromolaren Dactolisib, das auf den mTOR-Signalweg abzielt, wurde die Phosphorylierung von 4EBP1 gehemmt. 0,5 mikromolare selumetinib, die auf den MAP-Kinase-Signalweg abzielt, war wirksam bei der Hemmung der Phosphorylierung von ERK1/2. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Schnitten arbeiten und kritisch analysieren, die frisch aus wertvollem Tumorgewebe geschnitten wurden.Unsere ehemalige Postdoc,Katja Narhi, hat maßgeblich zur Etablierung dieser Methode in Zusammenarbeit mit Kollegen der IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform beigetragen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

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Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

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Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

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A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

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Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

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Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

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High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

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