Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

מחקר זה עבודה קיבל תמיכה כספית של תרופות חדשניות יוזמה Joint Undertaking להעניק הסכם no 115188 את תוכנית דוקטורט אוניברסיטת הלסינקי וההתערבות מלגות (A.S.N.), את Juselius סיגריד, יסודות אוריון-Farmos (E.W.V.). אנו מודים פלטפורמה פרוסה חברי האיחוד שלנו PREDECT רקמות (Taija af Hällström סיב Knaappila על תמיכה בהגדרת המערכת מסובב, ואת Riku Turkki לתמיכה בניתוח MATLAB. Jouko סירו הוא הודה על לכידת התמונות איור 1. אנו מודים לצוות FIMM WebMicroscope עבור סריקת שקופיות היסטולוגית, ותמיכה המרכז חיות מעבדה גידול.

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

מתחם במבחנה הגידול מודלים שונים, כולל תרבויות 3D ו- organoids, פותחו כדי לסכם את אדריכלות והפונקציות oncogenic ויוו 29,רקמת הגידול30. עם זאת, הקמת תרבויות תלת-ממד או organoids כרוך דיסוציאציה רקמת גידול סלקטיבי של סוג תא בודד או תרבות משותפת של בחירת סוגי תאים אחדים סביבה מלאכותית. כתוצאה מכך, מודל שכזה שהיישום ללכוד המורכבות של אינטראקציות הטרוגניות, הגידול-משתית הגידול. Organotypic הגידול פרוסות, מצד שני, לשמור על רקמה ביולוגית ואדריכלות המורכבות של הגידול ב באתרו , ללא מניפולציה נרחב. יכולת זו של הרקמה פרוסות לתאים סרטניים דגם microenvironment מקורי שלהם מעבד אותם אטרקטיביים במיוחד ללימודי פרה. בעבר דיווחנו זרימת עבודה ממוטב עבור הקמת ניתוח של הגידול דיוק-לחתוך פרוסות, וכן הראה כי, לעומת לסנן תומך, ביחידה אינקובציה מסתובב לשפר את הכדאיות של לטווח קצר מאתר NSCLC פרוסה תרבויות25 , 31. עם זאת, טיפוח בסבב יחידות הוא מאתגר מבחינה טכנית, דורש ניטור מתמיד. אנו מציגים כאן פרוטוקול גידול רקמות פרוסה ושימוש מעשי סיבוב ליחידה הדגירה תרבות אותם, כמו גם ליווי שיטות כדי לנטר את היכולת של פרוסות ללכוד בחיי עיר הגידול ביולוגיה, תנאי הכרחי לפני הסמים תגובת בדיקה.
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול להבטיח תקינות רקמת ואת הכדאיות של הפרוסות הגידול. אם רקמת הריאה נורמלי מקיף את הגידול, vibratome יכול ליצור פרוסות בעובי לא עקבי או נזק הפרוסות, בשל ההבדלים מרקם וקשיחות בין רקמות רגיל, הגידול. לכן חשוב להסיר את רקמת הריאה נורמלי שמסביב לפני הגידול חותך. עוד צעד קריטי הוא עובי חיתוך, אשר צריך להיות ממוטבים בקפידה עבור כל סוג הרקמה. יתר על כן, ברגע חתוכים, זה קריטי כי הפרוסה ממוקמת בערך באמצע הרשת, אז כדי להבטיח מדויק לסירוגין טובלים בתוך תרבות בינוני וחשיפה חמצן. לבסוף, חשוב לעקוב אחר המיקום של פרוסה במהלך תקופת הסיבוב שלו, כפי פרוסה יכול ליפול המדיום; במקרה כזה, עוד פעולות ניתן לקחת כמוסבר בשלב 3.6 של הפרוטוקול.
בנוסף רקמות טיפול כדי להבטיח תקינות, יש גם שלבים קריטיים בניתוח IHC לפרש איך הפרוסה דומה הרקמה הטבעית. המחקר הקודם שלנו הראה כי גידולים NSCLC מאתר התערוכה בולטת אינטרה-גידול הטרוגניות המרחבי oncogenic פעילויות איתות26. משמעות הדבר היא כי השימוש של רקמות שונות במרחב פרוסות עבור פקדים או דגימות שטופלו בסמים יכול להשפיע על פרשנות הנתונים ניסיוני אמין, ומכאן מקרוב סמוך פרוסות שאמור לשמש פקדים, הבדיקה דוגמאות. אנחנו עוד יותר הראה כי בעת התפשטות או ביטוי oncogenic phosphoprotein h 0 מחציתה טרי חתוך פרוסות היו דומה בחיי עיר גידולים, פרוסות תרבותי הראה phosphoprotein oncogenic שינו הביטוי, במיוחד שינו p4EBP1 pSRC, וכן התפשטות שינו נותחו על ידי Ki67 IHC. הביטוי p4EBP1 שינו זוהה באופן דומה 24 שעות האדם NSCLC וסרטן הערמונית לחתוך תרבויות (Narhi ואח., איור משלים S3B-S3C, S5, S7)26. ממצאים אלה מאשרת כי השוואה של פרוסות תרבותי עם פרוסה מחציתה הו הקרובה שלהם הוא קריטי כדי להעריך את שימור בחיי עיר פונקציות גידול בתרבית פרוסות.
למרות שיפור הכדאיות של פרוסות organotypic25, קיימות מגבלות עם מערכת מסובב במונחים של כל הפרטים הטכניים. הצבת את הפרוסות רקמות על גבי רשתות טיטניום היא מאתגרת יותר בהשוואה לסנן מוסיף, ביחידה אינקובציה מסתובבת לא יהיו זמינים. כחלופה, תומך מסנן קיפאון יכול לשמש, אבל במקרה הזה רק חשוף אוויר בצד של הפרוסות צריך להיות מנותח, כמו מסנן אוויר מעברי צבע הכדאיות, היפוקסיה נמדדת HIF1α ביטוי נוצרות במהירות בפרוסה הנתמכות על-ידי המסנן תרבויות (דייויס et al., איור 5, איור 7 א-7B)25. אנחנו עוד יותר הראו כי הגידול פרוסה תרבויות בנוסח התפשטות שינו ופעילויות איתות oncogenic לעומת גידולים מקורי שלהם26, ואולי בגלל תגובות ריפוי פצע או הסתגלות מטבולית הפרוסות כדי ex-vivo תרבות32. למרות ברוטו תכוניות מורפולוגיות של גידולים NSCLC מאתר היו מתוחזקים במהלך הטיפוח-תרגול 72 h, תרבות-induced שינויים proliferative עשוי להשפיע על ציון מדויק של הפרוסות מעובדים. לפיכך, רקמות פרוסות צריך רק להיות מנוצל ללימודי תפקודית לטווח קצר.
השימוש ביחידה אינקובציה מסתובב מציל לפחות חלקית אינטרה-פרוסה הכדאיות או סמן ביטוי מעברי צבע, במיוחד במהלך 24 השעות הראשונות של תרבות. לאחר האימות עבור תקינות ותפקוד, זה מספק חומר רקמות ללימודים פונקציונלי, כגון לימודי טיפול סמים. בנוסף התרופה התגובה פרופיל, ביטוי יעד שונה בעקבות הטיפול בתרופה יכולים גם ליהנות נוגדן אימות. זה רלוונטי במיוחד זיהוי מאתר epitopes עם העכבר נוגדנים חד-שבטיים, כמו אלה נוטים לתת רקע מוכתמים. בנוסף, נוגדנים היטב המאומת נדרשים להשיג נתונים אמין לשחזור הגדרות אבחון וקלינית. לפיכך, אפנון של שפע או זירחון של epitopes רלוונטי בעקבות הטיפול בתרופה בפרוסות רקמות מספקת יישום מעשי שימושי באימות נוגדן. היתרון העיקרי של תרבויות פרוסה הגידול הוא היכולת מודל במרחב-מבוזרות פונקציות, כולל פעילויות איתות oncogenic או סמים תגובת הגידול או תאי סטרומה, מה שהופך אותם מודל אטרקטיבי ex-vivo . עם זאת, פרוסות לסובב במהלך הטיפוח-תרגול, תהליך הטיפוח יכול נזק נוסף לרקמת במיוחד בקצוות. זה ולכן מאתגר בדיוק בשכבת-העל של הדימויים IHC שהוכתמו סמן הפרוסות 0 h עם אזורי נמק זוהה פרוסות בתרבית, אשר פוגעת ביכולת לקשר בדיוק המרחבי סמן פעילויות סמים לתגובה. בנוסף, גידול מהותי, בהשפעת תרבות, שיכרון תגובות נמק הם נבדלים לפחות מאתר פרוסות רקמות NSCLC, להתפשר על כימות מדויק של תגובות סמים מרחבית. לבסוף, השימוש של הגידול פרוסה תרבויות היתרי חוקר כדי לבדוק את מספר תרכובות את הגידול זהה, כך שאין צורך לטפל בבעלי חיים, ובכך זיקוק, הפחתת והחלפה של ניסויים בבעלי חיים.
כיישום בעתיד, הפרוטוקול המתואר ניתן לאמץ דגימות קליניות גידולים מוצקים. עוד שינויים תלויי-סוג הרקמה או אופטימיזציות נדרשים סביר, החל מהתאמות בהגדרות vibratome כולל עובי הפרוסה מהירות רטט כדי למטב את אלה הגידול מרקם או נוקשות. בנוסף, הדרישה התזונתי של גורם גדילה עשויים להשתנות בשביל לרקמות גידול שונים. לדוגמה, פרוסות סרטן השד תרבותי עם אינסולין בתוספת של בינוני13,18. בהתחשב בכך רקמות מוגבל חומר מתקבל במהלך הניתוח או ביופסיה, אופטימיזציה של החולה, נגזר הגידול פרוסה תרבויות עשויה להיות מאתגרת עקב קשיים בהשגת מספר מספיק של דגימות שכפל. יתר על כן, הנתונים הפארמצבטית הוא גם תיגר מבטאים את החולה-מטופל מדגם הטרוגניות, במיוחד באחוזים של תאים סרטניים לעומת אזורים שהותירה או תסנין סטרומה, כמו גם רכיבים רקמת נמק. לבסוף, יישום של הגידול פרוסות בהגדרות אבחון ידרוש חקירת היקף כדי איזו תרופה תגובות ב explants פרוסה של ביופסיות טרום טיפול מתאים שלאחר הטיפול אין ויוו תגובות.

רקמות גידולים מוצקים, כולל סרטן ריאות, התערוכה הטרוגניות גנטית ו פנוטיפי, הנמל מורכבים microenvironments1,2. יחסי הגומלין בין תאים סרטניים והשפעתם microenvironment שמסביב על סמים רגישות והתנגדות מנגנונים3. זה מדגיש את הצורך במודלים פרה זה יכול באופן מדויק המורכבות הביולוגית ופונקציות מתנהג גידולים מקומיים. דיוק-לחתוך פרוסות מיד נגזר גידולים טריים לספק משאב ייחודי, כפי שיש להם קיבולת העיקרי כדי לייצג ויוו ביולוגיה, לפחות עבור חלון קצרה של זמן, כולל פנוטיפים במרחב מופץ בגידול בודדים. גידולים קלינית resected הן אחת מהדוגמאות אישית כמה זה ניתן להשיג חולת סרטן, שימושם אבחון ראוי לביקורת.
ההיסטוריה של organotypic תרבויות שתחילתה במאהה 19 מוקדם, כאשר גידולים תוך-גולגולתי האנושי היו יד-לחתוך לחתיכות רקמות, בתרבית באמצעות מה שמכונה תלוי בשיטה טיפה. שברי רקמת המצורפת coverslip, מותר לטבול לתוך heparinized לפלסמה אנושית, לאחר מכן coverslips היו הפוכים, אטום ותרבותית במשך שבועות מספר4. חותכים ידנית גידול חלקים מאז היו בתרבית תוך שימוש במגוון שיטות אחרות, כגון פלזמה קרישי5, נוזל מדיית6, או ב- 0.45 מיקרומטר הנקבוביות מסננים גודל6. המונח "organotypic" שימש לראשונה בשנת 1954, במסגרת מחקר על בידול ברשתית של העין העובר7צ'יק. זאת בעקבות מחקרים שהשתמשו explants רקמת הריאה והלב נגזר צ'יק עוברי8ו explants במוח חולדות למבוגרים9.
שיטות שונות עם פרוסות היו מסוקי המתואר, כלומר ידני10,11,12,מבצעה רקמת Krumdieck13ו14,11,vibratomes15, 16. בפורס רקמת Krumdieck מייצר גלילי רקמה ליבות, אשר הם מכן חתוכים לפרוסות רקמות מעגלית באמצעות מיקרוטום. Vibratome, מצד שני, משתמשת מיקרוטום רוטטת של להב. במחקר על פרוסות כבד, זה הוצג vibratome לייקה מפיקה פרוסות לשחזור ועקבית יותר לעומת ה מבצעה Krumdieck15. עוביים פרוסה ועד 250 מיקרומטר 500 שימשו ולאחר מחקרים דווח תחזוקה של הכדאיות ותכונות מורפולוגיות אפילו עד 16 ימים14,10,17,18. עם זאת, גידולים יש פרופילים מטבולית משתנים אשר יכולים להשפיע על דרישות מזין, פרמטרים כגון רקמות קשיחות ומטריקס הרכב יכול להשפיע על לערבב ואת זרימת החומרים המזינים. לכן סביר כי כל סוג הרקמה דורש אופטימיזציה של תנאים ולגזירה של תרבות.
הטיפוח-תרגול שיטות השתמשו כדי לתמוך פרוסה תרבויות: אני) תרבות לאטמוספרה נייח, הנקרא גם תרבות תמיכה קיפאון, שבו מונחים פרוסות הוספה למחצה נקבובי ממברנה שקוע בתוך המדיום תרבות. בחודש זה, העליון של הפרוסות חשוף לאוויר, בעוד החלק התחתון הוא בתוספת עם חומרים מזינים באמצעות14,הוספה נקבובי19; ii. שיטת) כפות סיידים, שפותחה במקור איברים כל תרבות או פרוסות מתחלקים. בחודש זה, פרוסות ממוקמים על גבי סדין כותנה או מסנן נתמך על ידי רשת מתכת, המסנן טבולים המדיום תרבות. כדי לשמור על הרקמות לח, שכבה דקה של מדיום נוסף על גבי פרוסות20,21,22. אלה שני הראשונים נקראים כך אוויר נוזלי לאטמוספרה תרבויות; iii) רולר צינור תרבויות, בו פרוסות ממוקמים בתוך הצד השטוח של צינור פלסטיק המכיל בינוני, וכל סיבוב איטי צינור מבטיחה כי הרקמה הוא מכוסה בינוני במהלך החלק הראשון של מחזור, או מוגזים במהלך השנייה23; iv) סיבוב יחידות דגירה, שבו פרוסות נחשפים לסירוגין בינוני עם חומרים מזינים, לערבב. שונה צינורות רולר, בשיטה זו פרוסות מונחים רשתות טיטניום נקבובי ממוקמת ב 6-ובכן צלחות עם תרבות בינוני24.
רקמות פרוסות נגזר resected גידולים מוצקים לוגית נוכח מודל אטרקטיבי לשעבר vivo בו לבדוק את התגובה לטיפול של סוכנים אנטי סרטניים, כפי שהם מאפשרים הערכת הכדאיות, ממוקד מסלול פעילות ופרופילים מולקולרית של גידול ספציפי בנוכחות microenvironment הגידול הטבעית שלה. עם זאת, כדי להעריך אם יש לתגובות סמים נמדד פרוסות גידול חזוי של תגובות ב באתרו , חשוב להעריך לשמר פרוסות רקמות מה היקף הגידול הספציפי תפקודים ביולוגיים התפשטות תאים, התמיינות תאים ספציפיים histopathology או oncogenic פעילויות איתות. השפעת מכאניים elicited במהלך ההכנה פרוסה, טיפול פרוסה או תרבות-induced adaptions על איכות והן תפקודים ביולוגיים של רקמות פרוסות הן שאלות יסוד, קשורה באופן הדוק היכולת ליישם נגזר הגידול פרוסות עבור לאיבחון פונקציונלי.
הפרויקט שלנו במימון תעש קונסורציום PREDECT (http://www.predect.eu) יוצא לכתובת באופן שיטתי שאלות יסוד אלה, על ידי לימוד פרוסה explants ממגוון רחב של מקורות. שימוש בפרוסות נגזר מודלים סרטן השד, הערמונית, ריאות, במאמץ משותף זה מנוצל הקריאות איכותי וכן hematoxylin כמותית של eosin (H & E) - לפי המפרט להפגין דרישה עבור חמצן אטמוספרי ומסנן קפואה תומך כדי לקיים את הכדאיות של פרוסות בתרבית עד 72 h. יתר על כן, ניתוחים אימונוהיסטוכימיה (IHC) על פרוסות בתרבית חשף אינטרה-פרוסה הכדאיות מעברי צבע, עדות כמעברי נמק פרוסות הנגזר מאתר שאינם קטנים התא סרטן ריאות (NSCLC), קולטן אסטרוגן (ER), HIF1α, γH2AX מעברי צבע בפרוסות סרטן השד, או אנדרוגן קולטן (AR) ביטוי מעברי צבע סרטן הערמונית פרוסות25. מעניין, מעברי צבע הכדאיות אינטרה-פרוסה בתרבויות 24 שעות של NSCLC מאתר חולצו על ידי טיפוח ביחידה אינקובציה מסתובב, שלנו במחקר עדכני הראה כי הכדאיות הוארך עד 72 h26. במיוחד את הצד העליון נשאר המעשי ביותר26, המאשרת כי סמים ניתוחים בתגובה על פרוסות הטוב מתבצעות בצד הזה של הרקמה.
למרות נשארת השאלה כיצד רחוק רקמות פרוסות יכול לסכם בחיי עיר הגידול פונקציות, הם שימשו באופן נרחב כדי לבדוק את התגובות סוכנים אנטי סרטניים, לרבות תרופות יישוב, נוגדנים חד-שבטיים, כימותרפיה סוכני 10,11,13,14,18,27. לאחרונה הראינו כי מאתר NSCLC פרוסות הצג שינויים דינמיים בהתפשטות, פעילויות איתות oncogenic בעקבות טיפוח בהשוואה טרי חתוך או פרוסות26. אפשרות זו מציינת כי חשוב לחקור אם יישוב בחיי עיר תפקודים ביולוגיים נשמרים כראוי במהלך הטיפוח, לפני לימודי ההפרעות. למרות ממצאים אלה, הראנו פרוסות הגידול יכול מודל מרחבי בתגובה טיפולים ממוקדים, בעיצומו סמים נשארים טיפולים קצרים (24 שעות), מבוצעים מיד עם תחילת culturing26. הפרוטוקול הבא מתאר אימות חשוב בהיבטים הרלוונטיים הממסד וניתוח של תרבויות פרוסה הגידול, לפני היישום שלהם בבדיקת סמים תרופתי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic ראשי explant בתרביות, הכוללים דיוק-לחתוך פרוסות, מייצגים הארכיטקטורה רקמות תלת-ממדי (3-D), כמו גם את האינטראקציות multicellular של רקמה מקורית. פרוסות רקמות לחתוך מיד מ גידולים resected טרי לשמר היבטים מרחביים של הטרוגניות intratumor, ובכך הופך אותם שימושי המחליפים של הביולוגיה ויוו . זהירות אופטימיזציה של הכנה פרוסה רקמות ותנאי הטיפוח-תרגול הוא היסוד עבור אבחון הפוטנציאל חזוי של הגידול פרוסה explants. בהקשר זה, מודלים מאתר הם בעלי ערך, כמו אלה לספק זרם עקבי של הגידול חומר כדי לבצע שכפול וניסויים לשחזור. פרוטוקול זה מתאר את culturing הפרוסות נגזר הגידול רקמת הריאה מאתר באמצעות יחידת הדגירה מסתובב, מערכת המאפשרת חשיפה לסירוגין של רקמות חמצן וחומרים מזינים. העבודות הקודמות שלנו הראו כי השימוש של סיבוב הדגירה יחידות משפר את הכדאיות של רקמות לעומת שיטות אחרות תרבות, במיוחד צף פרוסות ותומך מסנן קיפאון. . הנה, אנחנו עוד יותר מראים עובי הפרוסה משפיע על הכדאיות של פרוסות בתרבית, רומז שאופטימיזציה של עובי הפרוסה צריך להיעשות עבור סוגי רקמות שונות. מבוטא ITH בפונקציות oncogenic הרלוונטיים, כגון איתות פעילויות, תאי סטרומה חדירה או ביטוי של בידול סמנים, מחייבת הערכה של רקמות סמוך פרוסות עבור הביטוי של סמני ששונו כתוצאה הטיפול בתרופה או טיפוח עצמה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הדור של הריאה מאתר הגידול פרוסות ותרבותם על יחידת הדגירה מסתובב ומדגים כמה פרוסות צריך להיות באופן שיטתי מנותח עבור הביטוי של סמנים רקמות הטרוגנית, כתנאי לפני הסמים התגובה מחקרים.

איור 1 מייצג את זרימת העבודה עבור הדור, טיפוח ניתוח של רקמות דיוק-לחתוך פרוסות הנגזר מאתר גידולים NSCLC. לצורך ההדגמה, אנחנו מנוצל גידולים ממודל העכבר מהונדסים גנטית (GEMM) מחסה מותנה הפעלה של קראסG12D יחד עם האובדן של Lkb1 (הידוע גם בשם תראונין/סרין קינאז 11), להלן בשם KL. העכבר רבייה ובריאות הגידול חניכה בוצע כמתואר26,28. איור 2A מדגים את ההשפעה של רקמות עובי הפרוסה על הכדאיות של פרוסות בתרבית במשך 24 שעות ביממה באמצעות ביחידה אינקובציה מסתובב. התוצאות מציגות כי 160 מיקרומטר פרוסות דקיקות מכילים אזורים עם נמק גדולים על פני הפרוסה. בנוסף, פרוסות דקיקות של 250 מיקרומטר מציגים נמק של מעבר צבע לאורך הפרוסה לעומת 200 מיקרומטר פרוסות דקיקות. סביר כי הכדאיות הכוללת המסכן של מיקרומטר 160 הדק נגרמת על ידי טיפול טכני במהלך מיצוב הפרוסות על גבי הרשתות, אלה הם שבירים, נוטים להתכרבל. מצד שני, כאשר פרוסות עבה מדי, שהם יכולים להפוך נוטה ליקויים חמצן או דיפוזיה מזין הפרוסות, אשר ב NSCLC מאתר explants היא עדות כמו נמק מוות הדרגתיות25. עם זאת, יצוין כי ניתן להפיק פרוסות עם עוביים משתנים של גידול אחד, למרות השימוש בהגדרות vibratome זהים. לכן מומלץ לנתח משכפל מרובים מדגימות גידול שונים. חשוב, כל סוג הרקמה דורש אופטימיזציה עובי הפרוסה על מנת להשיג מקסימום הכדאיות, כמו מרקם רקמות או קשיות ולהשפיע על חמצון ואת זרימת החומרים המזינים. איור 2B -2C מדגים ניתוחים כמותיים IHC של הביטוי NKX2-1, סמן של היטב הבדיל ריאות אדנוקרצינומה (AC) בדגימות מעובדות עד 72 שעות ותואמים את 0 h פרוסות. התוצאות מראות כי הביטוי NKX2-1 הוא לא שינו באופן משמעותי בפרוסות בתרבית לעומת 0 פרוסות מחציתה h, רומז כי תהליך הטיפוח בגלוי משפיעה על המצב בידול של רקמת הגידול AC. איור דו-ממדי מדגים את התועלת של פרוסות רקמת הגידול להערכת היעילות של תרופות יישוב. לאחרונה הראינו קראס מוטציה מאתר ACs בנספח גבוהה את הביטוי הזה של phosphorylated ERK1/2 (סימון פעילות מוגברת של מסלול MAPK) בהשוואה adenosquamous (ASC) גידולים, תוך ביטוי של phosphorylated 4EBP1 (סימון פעילות mTOR ) באופן דומה מתבטא בגידולים AC וגם ASC. כדי לבדוק אם המסלולים הללו ניתן לפלח ביעילות על רקמות פרוסות, פרוסות רקמות KL AC שטופלו דימתיל סולפוקסיד או טיטרציה כמויות של תרכובות, כלומר 0.1 – 1 מיקרומטר dactolisib למקד את המעבר mTOR או 0.05-0.5 מיקרומטר selumetinib למקד את המעבר MAPK. התוצאות מראות כי 1 מיקרומטר dactolisib או 0.5 מיקרומטר של selumetinib יעילים בעיכוב זירחון של 4EBP1 או ERK1/2, בהתאמה. יתר על כן, עיכוב למינון של יישוב phosphoproteins מציין כי רקמת פרוסות גם יכול להיות מנוצל כדי לאמת נוגדנים ספציפיים זירחון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה עבור הקמת וניתוח של מאתר NSCLC פרוסה נגזר הגידול explants. (א) מפרטים טכניים המתארים את איסוף והכנה של הריאות נושאות שמגיע. אונות הריאה נקצרים מן עכבר, רקמת הגידול הוא גזור מן הרקמות. ראש חץ שחור של כוכבית מצביעים על 4 מ מ 1 מ"מ גידולים, בהתאמה. החץ הלבן מצביע על רקמת הריאה דבוק אל פני השטח של בעל הדגימה. הנקודות חץ אדום כלי נוסף של רקמת הריאות נורמלי תמיכה כדי לשמר את הגידול בתנוחה זקופה. Vibratome (B) אוסף של פרוסות רקמה וגזירה. חץ לבן מציין את הכיוון עם פרוסות. אוסף של פרוסות רציפים לתוך צלחת 24-ובכן המכיל קר HBSS + P/S. הפרוסות יכול להיות בתרבית נקודות זמן שונות (כאן, 24-72 h) כדי להעריך ביטוי סמן הגידול הספציפי בזמן התרגול (שורה עליונה), או יכול לשמש כדי לבצע טיפולים תרופות. C: בקרת הרכב, t: הטיפול בתרופה. (ג) הצבת הפרוסה רקמות לטיפוח באמצעות יחידות הדגירה מסתובב. להטות את הצלחת 6-ובכן כך מסוימים בינונית מכסה את החלק העליון של הרשת, מקום הפרוסה רקמות באמצע הרשת על גבי המדיום, להפיץ את הפרוסה באמצעות מלקחיים. להבטיח כי הלוחות 6-ובכן משקל מאוזנת עבור מחזור הסיבוב חלקה. X: ציון שגויה, ו- <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: מציין מיקום נכון של הפרוסה. (ד) תצלום של הרחוב FFPE על נתח הגידול. חץ שחור בנקודות פרוסה פרפין-מוטבע רקמה צבעונית עם hematoxylin. (E) שרטוט המציג את סדר אופטים הפרוסות בבלוקים FFPE; ניתן לעבד מקטעים אלה כדי להעריך את הכדאיות רקמות וביטוי סמן הגידול הספציפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> איור 2: הערכת הכדאיות והביטוי סמן histotype ספציפית ולאחר הטיפול ממוקד על פרוסות רקמות NSCLC. תמונות (A) נציג H & E AC NSCLC פרוסות עוביים המצוין תרבותי עבור פרוסות דקיקות של מיקרומטר 24 ה 200 לשמור על התפקוד טוב יותר לעומת 160 מיקרומטר או 250 מיקרומטר פרוסות דקיקות. כחול כהה מייצג H & E צבעונית רקמות קיימא, ומציין ורוד pseudocolored אזורי נמק. כחול בהיר מציין אזורים נכללו בניתוח, עקב איכות רקמת עניים או נוכחות של משתית סיבית או. T1 ו T2 מייצגים ביולוגי משכפל נגזר שני גידולים שונים. סרגל קנה מידה = 500 IHC נציג תמונות מיקרומטר. (B) של NKX2-1 ביטוי בפרוסות AC תרבותי על הנקודות הזמן שצוין. החץ מצביע על האזור שמוצג הגדלה גבוהה יותר. התוצאות מראות כי הביטוי NKX2-1 אינה משתנה את פרוסות בתרבית לעומת 0 h פרוסות. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 500 ו- 50 מיקרומטר עבור הגדלה נמוך וגבוה, בהתאמה. (ג) כימות הנתונים המוצגים ב (B). (ד) נציג IHC תמונות של phosphorylated 4EBP1 או pERK1/2 ביטוי או פרוסות, או פרוסות שטופלו דימתיל סולפוקסיד טיטרציה כמויות של dactolisib (נערכה, השורה העליונה) או phosphorylated pERK1/2 ביטוי הו פרוסה, או פרוסות שטופלו דימתיל סולפוקסיד או selumetinib (sel, שורה תחתונה). קופסאות ריבוע שחור מציינים אזורים באיור הגדלה גבוהה יותר. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ או 50 מיקרומטר עבור ההגדלה נמוך או גבוה, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

אנו מספקים שיטה הדור, ניתוח שיטתי של פרוסות organotypic נגזר גידולים ריאות מאתר וטיפוח. אנו מתארים גם מיטוב עבור עובי הפרוסה, וכיצד לבחור ריכוזי התרופה לטיפול הגידול פרוסות.

הקמת וניתוח של הגידול פרוסה Explants כתנאי בדיקות אבחון

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר פרה-קליני, שבו מחקרי תגובה לתרופות במפלי פרוסות גידול עשויים לשרת מטרות אבחון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי explants פרוסה יכול עבור חלון זמן קצר מודל הביולוגיה המורכבת של רקמות מקומיות כולל פונקציות מבוזרות מרחבית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על השימוש בפרוסות מגידולי ריאות מורין, זה יכול להיות מיושם גם על סוגי רקמות אחרים כולל רקמות אנושיות.כדי להתחיל, להכין את הרטט ולבצע VibraCheck על פי ההוראות המופיעות במדריך. ואז למלא כל באר של צלחת 24 גם עם מיליליטר אחד של תווי מלח מאוזנים של האנק בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין ולשמור את הצלחת על קרח. הכנס מחטים 25-מד בכל ארבע כפות של עכבר המתת דם הניח על מכסה קלקר, כך החזה חשוף החיה נמתחת.יש לרסס 70% אלכוהול על פני העור החשוף. השתמש מספריים להציב בתצב זוויתי לחתוך לפתוח את העור מהבטן לכיוון החזה עד לאזור הצוואר. למתוח את העור משני הצדדים באמצעות מדפים ולהכניס מחטים 25-מד.חותכים את אזור הבטן. ואז לחתוך לפתוח את כלוב הצלעות ואת הסרעפת כדי לחשוף את הריאה והלב. לחשוף את קנה הנשימה על ידי חיתוך הרקמה שמסביב.לנתח את הריאות, יחד עם הלב. מניחים את הרקמות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של קרח קר HBSS בתוספת עט סטרפטוקומפ להציב על קרח ולהמשיך לשלב הבא מהר ככל האפשר. עכשיו להעביר את הריאות נושאות הגידול לתוך צלחת תרבות רקמה 10 ס"מ.השתמש מספריים סטריליים מדפים להפריד את האונות הריאה ולבחור אונות עם גידולים על פני השטח עבור חיתוך. מניחים אונה ריאות עם רקמת גידול על פיסת נייר מסנן כדי למנוע החלקה וחיתוך חלק הריאה הרגילה או רקמת גידול נוספת המקיפה את הגידול באמצעות אזמל סטרילי כדי ליצור משטח חתיכת רקמה שטוחה. טובלים את הצד השטוח בירידה של דבק cyanoacrylate ולהרים אותו על מחזיק דגימת רטט, כך הגידול פונה הלהב במצב זקוף, ולתת לו להתייבש במשך שתיים עד שלוש דקות.מניחים את מחזיק דגימת הרטט במגש חיץ המתכת. מלאו את המגש ב-HBSS קר בתוספת Pen-Strep עד שהרקמות שקועות במאגר. מכסים את מגש החיץ עם מכסה פרספקס המסופק עם המכשיר ומ מניחים את המגש לתוך אמבט קרח לבן ומוסיפים קרח כדי לשמור על הרקמה קרירה במהלך חיתוך.חבר את אמבט הקרח הלבן לוויבריום. לאחר מכן בחר הגדרות חיתוך מתאימות והתחל ב חיתוך. הביאו את להב הרטט לתדר הסכין והגדירו את חלון הסכין.השתמש ממטרים סטריליים כדי לאסוף את הפרוסות בצלחת 24 באר מלא מיליליטר אחד של HBSS בתוספת עט סטרפטוקומפ לכל באר ולשמור על קרח. תוך כדי מעקב אחר סדר הניתוך, סמן כל באר של צלחת 24 הבאר על פי תוכנית הניסוי. אסוף פרוסת רקמה הסמוכה לפרוסות התרבותיות כאפס שעות או התייחסות לא תרבותית.לאסוף לפחות שלוש פרוסות התייחסות כדי לייצג את החלק העליון, המרכזי והתחתון של הרקמה. וברגע שההסתעפת תושלם, המשך בתיקון ועיבוד. לאחר מכן, להכין צלחת שש באר המכיל 2.5 מיליליטר של תרבות בינונית לגם על ידי הצבת רשתות טיטניום בו.ודאו שלא נוצרות בועות אוויר בין רשת הטיטניום למדיום. כדי לטעון פרוסה לרשת, שמרו על לוח שש בארות במיקום זוויתי כך שחלק מהמדיום יכסה את הרשת. לאחר מכן מניחים את הפרוסה במדיום על הרשת ולהשתמש במדפים כדי להפיץ אותו.לאחר הנחת הפרוסות, העמיסו את לוחות ששת בארות על יחידת הדגירה המסתובבת הממוקמת בתוך חממה לחה המתוחזקת ב-37 מעלות צלזיוס עם 95%02 ו-5%CO2. התחל את מחזור הסיבוב. לטיפוח ארוך טווח לחדש את מדיום התרבות כל יום באמצעות מדפים סטריליים כדי להרים את הרשת המכילה את פרוסות הרקמה ולמקם אותו באר ריקה של צלחת שש בארות.החלף 70% מהמדיום בגודל בינוני של תרבות רעננה והחזר את הרשת פנימה. המשך במחזור הסיבוב כבעבר. לטיפול תרופתי על פרוסות הגידול להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיה עם התרופה מדולל או בקרת רכב לתוך צלחת שש באר.מניחים את רשתות טיטניום לתוך בארות ולאחר מכן מניחים את הפרוסות על הרשתות כפי שנעשה בעבר. לאחר ביצוע הטיפולים במשך 24 שעות, להמשיך עם תיקון ועיבוד. כדי להתחיל לתקן את הפרוסה הרצויה בזהירות להעביר אותו באמצעות מדפים לתוך צלחת 10 ס"מ המכיל נייר מסנן ספוג מלא שניים עד שלושה מיליליטר PBS ולתת לו לצוף.לאחר מכן הרם את נייר הסינון עם זוג מדפים והצב אותו בקלטת היסטו. העבר את נייר הסינון לקלטת היסטו. הוסף טיפה של hematoxylin מדולל על גבי פרוסת הרקמה כדי לסמן את המיקום של הפרוסה עבור השלבים הבאים.סגרו את הקלטת, והעבירו אותה לתתסרון פורמלין במאגר ניטרלי של 4% ותעזבו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר כביסה ועיבוד של הקלטת כמתואר בפרוטוקול, לפתוח את קלטת היסטו ולהשתמש אזמל כדי להרים בזהירות את הפרוסה הקבועה מנייר המסנן. משליכים את נייר הסינון ומעבירים את הפרוסה לתבנית המכילה פרפין נוזלי.השתמש במשקל שטוח כדי ללחוץ על הרקמה נגד החלק התחתון של התבנית הטבעה כדי להבטיח אפילו חתך. מניחים את החלק התחתון של קלטת היסטו על גבי התבנית. מוסיפים עליו פרפין נוזלי.ולתת לתבנית להתקרר על צלחת קרה במשך 30 דקות. לאחר מכן להפריד את התבנית מקורר מבלוק פרפין. השתמש במיקרוטום כדי להכין חלקים דקים של ארבעה מיקרומטר של בלוקי פרוסת רקמת FFPE.לקצץ את עודף הפרפין המקיף את הרקמה. כדי להשיג אפילו חלקים לאורך הרקמה להתאים את הזווית של הבלוק, כך פני השטח של הבלוק הוא אופקית מכוונת ביחס ללהב. בעזרת מברשת דקה אוספים מקטעי רקמה רציפים של פרוסת הרקמה המוטבעת בפרפין החל מהחלק העליון של מגלשות הזכוכית.המשך לאסוף את החלקים של שכבות הרקמה העמוקות יותר לאמצע, ואחריו החלק התחתון של שקופיות הזכוכית. אוסף החלקים משכבות שונות של כל פרוסת רקמה לשקופיות האובייקט נעשה כדי לאפשר לכידה של מעברי צבע פוטנציאליים הנגרמים על ידי תרבות בכדאיות, הגירת תאים או ביטוי סמן ביולוגי. לאחר איסוף הסעיפים ממשיכים בעיבודם וניתוח נוסף כמתואר בפרוטוקול.עובי פרוסת רקמות יכול להשפיע על הכדאיות של פרוסות מתורבתות. במקרה זה, פרוסות בעובי 250 מיקרומטר מראות שיפוע נמק מוגבר בהשוואה לפרוסות בעובי 200 מיקרומטר עקב פרוסות עבות יותר הנוטה לחוסרים בחמצן או בדיפוזיה תזונתית על פני הפרוסות. עם זאת, פרוסות דקות 160 מיקרומטר מכילות אזורים נמקיים גדולים ככל הנראה נגרמת על ידי טיפול טכני במהלך מיקום הפרוסות כמו אלה הם שבירים נוטים להתכרבל.ניתוח של NKX2-1, סמן של אדנוקרצינומה ריאות מובחנת היטב, מראה כי הביטוי שלה אינו משתנה באופן משמעותי פרוסות מתורבתות לעומת פרוסות אפס שעה לא תרבותית. ניתוח כמותי של ביטוי NKX2-1 אישר עוד כי הביטוי לא השתנה באופן משמעותי בפרוסות מתורבתות לעומת לא תרבותיות, דבר המצביע על כך שתהליך הטיפוח אינו משפיע באופן ברור על מצב ההידול של רקמת אדנוקרצינומה. כדי לבדוק אם פרוסות רקמת הגידול ניתן להשתמש כדי להעריך את היעילות של תרופות ממוקדות, הם טופלו עם DMSO או כמויות titrated של תרכובות.כאשר מטופלים עם dactolisib מיקרומולרי אחד אשר מטרות זרחון מסלול mTOR של 4EBP1 היה מעוכב. 0.5 selumetinib מיקרומולרי אשר מטרות מסלול קינאז MAP היה יעיל בעיכוב זרחון של ERK1/2. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך לעבוד עם ולנתח באופן ביקורתי פרוסות טרי לחתוך מרקמות גידול יקר.הפוסט-דוק לשעבר שלנו, קטיה נרהי, תרם באופן משמעותי להקמת שיטה זו בשיתוף עם עמיתיו של פלטפורמת פרוסת הרקמה של קונסורציום Predect של IMI.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...