Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
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Questo ricerca di lavoro ricevuto sostegno finanziario da Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking concedere accordo no 115188, il programma di Dottorato Università di Helsinki in borse di studio di biomedicina (a.s.n.) e la Sigrid Juselius e Orion-Farmos fondazioni (E.W.V.). Ringraziamo i nostri membri del Consorzio PREDECT piattaforma fetta del tessuto (Taija af Hällström e Siv Knaappila per il supporto nell'impostazione del sistema di rotatore e Riku Turkki per il supporto con l'analisi MATLAB. Jouko Siro è ringraziato per catturare le fotografie di figura 1. Ringraziamo il team di FIMM WebMicroscope per la scansione di vetrini istologici, e sostenere il centro di animali di laboratorio per allevamento.

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Sono stati sviluppati vari complessi in vitro modelli del tumore, tra cui 3D culture e organoids, ricapitolando l'architettura e le funzioni oncogeniche di in vivo del tumore del tessuto29,30. Tuttavia, la creazione del 3D culture o organoids implica la dissociazione dei tessuti e la crescita selettiva di un tipo di cella singola o co-coltura di un selezionare alcuni tipi di cellule in un ambiente artificiale. Di conseguenza, tali modelli catturano in modo incompleto la complessità delle interazioni tumore-stroma ed eterogeneità del tumore. Fette di tumore organotipiche, d'altra parte, mantengono le complessità di architettura e biologico del tessuto del tumore in situ , senza manipolazione estesa. Questa capacità di fettine di tessuto alle cellule del tumore di modello nel loro microambiente nativo li rende particolarmente attraenti per gli studi preclinici. Precedentemente abbiamo segnalato un flusso di lavoro ottimizzato per la creazione e l'analisi delle fette di taglio di precisione del tumore, e ha dimostrato che, rispetto al filtro supporta, un'unità di incubazione rotante migliorare la redditività a breve termine murino NSCLC fetta culture25 , 31. Tuttavia, la coltivazione su unità rotanti è tecnicamente impegnativo e richiede un monitoraggio costante. Qui presentiamo un protocollo per tumore del tessuto fetta generazione e utilizzo pratico di una rotazione unità di incubazione per la loro cultura, nonché metodi per monitorare la capacità delle fette di catturare in situ biologia del tumore, un prerequisito prima droga di accompagnamento test di risposta.
Diversi passaggi critici nel protocollo di garantiscono l'integrità del tessuto e l'attuabilità delle fette del tumore. Se il tessuto polmonare normale circonda il tumore, del vibratome può generare fette con spessore incoerente o danneggiare le fette, a causa delle differenze nella struttura e rigidezza tra tessuti normali e tumorali. Così è importante rimuovere il tessuto polmonare normale circostante prima del tumore affettare. Un altro punto critico è lo spessore per affettare, che dovrebbe essere attentamente ottimizzato per ogni tipo di tessuto. Inoltre, una volta affettato, è fondamentale che la fetta si trova circa al centro della griglia, così per assicurare precisi intermittente immergendo nel terreno di coltura e di esposizione all'ossigeno. Infine, è importante seguire la posizione di una fetta durante il suo periodo di rotazione, come una fetta può cadere in al supporto; Se questo accade, ulteriori azioni possono essere assunto come spiegato al punto 3.6 del protocollo.
Oltre che il tessuto movimentazione per garantire l'integrità, ci sono anche passaggi critici nell'analisi IHC per interpretare come la fetta è simile al tessuto nativo. Il nostro studio precedente ha mostrato che i tumori murini NSCLC esibiscono eterogeneità spaziale pronunciate intra-tumorale in oncogeno segnalazione attività26. Ciò significa che l'uso di tessuto spazialmente distinti fette per i controlli o campioni di droga trattato possono influenzare l'interpretazione dei dati sperimentali affidabili, e pertanto è opportuno utilizzare fette strettamente adiacenti come controlli e campioni di prova. Abbiamo ulteriormente indicato che mentre proliferazione o espressione di oncogeni fosfoproteina in fette appena tagliata incolto h 0 erano simili ai tumori in situ , fette coltivate ha mostrato l'espressione alterata della fosfoproteina oncogeno, specificatamente alterata p4EBP1 e pSRC, come pure alterata proliferazione analizzati da Ki67 IHC. P4EBP1 alterata espressione allo stesso modo è stata rilevata in 24h NSCLC umano e del carcinoma della prostata fetta culture (Narhi et al., complementare figura S3B-S3C, S5 e S7)26. Questi risultati approvare che il confronto delle fette coltivate con la loro fetta di incolto 0 h più vicina è fondamentale per valutare la conservazione delle funzioni di tumore in situ a fette coltivate.
Nonostante migliorando la redditività di organotipiche fette25, ci sono limitazioni con il sistema di rotatore in termini di tecnicismi. Mettere le fette di tessuto su griglie di titanio è più impegnativo rispetto per filtrare inserti, e un'unità di incubazione rotante potrebbe non essere disponibile. In alternativa, supporta filtro stagnante può essere utilizzato, ma in tal caso solo il lato aria-esposti delle fette dovrebbe essere analizzato, come a-filtro dell'aria gradienti in vitalità e ipossia misurato dall'espressione HIF1α rapidamente sono formati in fetta filtro-supportato culture (Davies et al., figura 5 e figura 7A-7B)25. Inoltre abbiamo dimostrato che colture di fetta di tumore possono esibire alterata proliferazione e attività di segnalazione oncogenica rispetto a loro tumori nativo26, possibilmente a causa di risposte di cicatrizzazione o adattamento metabolico delle fette di ex vivo culture32. Anche se lorda caratteristiche morfologiche dei tumori murini NSCLC sono state mantenute durante la coltivazione di 72h, indotta da cultura proliferative modifiche possano influire sulla classificazione accurata delle fette coltivate. Così, fettine di tessuto dovrebbero essere utilizzati solo per studi funzionali a breve termine.
Uso di un'unità di incubazione rotante salva almeno parzialmente intra-fetta attuabilità o biomarcatore sfumature di espressione, specialmente durante le prime 24 ore di cultura. Una volta convalidato l'integrità e la funzione, questo fornisce materiale tissutale per studi funzionali, come ad esempio studi di trattamento della droga. Oltre droga risposta profilatura, espressione di destinazione alterata dopo trattamento farmacologico può beneficiare anche convalida dell'anticorpo. Ciò è particolarmente rilevante per la rilevazione degli epitopi murini con anticorpi monoclonali di topo, in quanto questi tendono a dare alta priorità bassa colorazione. Inoltre, ben convalidati gli anticorpi necessari per ottenere dati affidabili e riproducibili nelle impostazioni di diagnostiche e cliniche. Così, modulazione dell'abbondanza o fosforilazione degli epitopi rilevanti dopo trattamento farmacologico in fette di tessuti fornisce una comoda applicazione pratica nella convalida dell'anticorpo. Dei principali vantaggi di culture della fetta del tumore è la capacità di funzioni del modello spazialmente distribuiti, tra cui attività oncogena di segnalazione o risposta ai farmaci nel tumore o le cellule stromali, che li rende un modello attraente ex vivo . Tuttavia, fette ruotano durante la coltivazione, e il processo di coltivazione possa più ulteriormente danneggiare il tessuto particolarmente ai bordi. È pertanto difficile al proprio overlay le immagini IHC macchiato di biomarcatore di fette 0 h con le regioni necrotiche rilevate in fette coltivate, che compromette la capacità di collegare precisamente attività spaziali biomarcatore di risposta ai farmaci. Inoltre, le risposte necrotiche del tumore intrinseco, indotta da cultura e farmaco-indotta sono indistinguibili almeno in fettine di tessuto NSCLC murini, compromettere la quantificazione accurata delle risposte farmacologiche spaziale. Infine, l'uso di colture di fetta del tumore permette un ricercatore alla prova più composti sul tumore stesso, senza la necessità di trattare gli animali, così raffinazione, la riduzione e la sostituzione di esperimenti su animali da laboratorio.
Come una futura applicazione, il protocollo descritto può essere adottato per i campioni clinici tumore solido. Ulteriori modifiche a seconda del tipo di tessuto o ottimizzazioni sono probabilmente necessari, a partire con aggiustamenti per le impostazioni di vibratome tra cui velocità di vibrazione e spessore fetta per ottimizzare questi per tumore texture o rigidità. Inoltre, requisito di nutrienti e fattori di crescita può variare per i tessuti differenti del tumore. Ad esempio, fette di cancro al seno hanno stati coltivati con insulina completato nella media13,18. Dato che il materiale tissutale limitata ottenuta durante un intervento chirurgico o biopsia, ottimizzazione delle culture fetta paziente-derivato del tumore può essere difficile a causa della difficoltà nel reperire un numero sufficiente di campioni replicati. Inoltre, riproducibilità dei dati anche è sfidato da pronunciata eterogeneità di campione del paziente--paziente, particolarmente nella percentuale delle cellule del tumore contro regioni fibrotiche o stromal si infiltra in, nonché componenti del tessuto necrotico. Infine, applicazione di fette di tumore in impostazioni di diagnostica richiederebbe indagine della misura alla quale farmaco responses in espianti di fetta di biopsie pre-trattamento corrisponde alle risposte di post-trattamento in vivo .

Tessuti del tumore solido, compreso il cancro polmonare, esibiscono eterogeneità fenotipica e genetica e porto complesso microambienti1,2. L'interazione tra le cellule del tumore e la loro influenza di microambiente circostante il farmaco sensibilità e resistenza meccanismi3. Ciò evidenzia la necessità di modelli preclinici che può modellano accuratamente la complessità biologica e funzioni agendo nei tumori nativi. Precisione di taglio fette immediatamente derivate da tumori freschi forniscono una risorsa unica, come hanno una capacità principale per rappresentare in vivo biologia, almeno per un breve lasso di tempo, tra cui fenotipi spazialmente distribuiti in un singolo tumore. I tumori resecati clinici sono uno dei pochi esemplari personalizzati che possono essere ottenuti da un paziente di cancro, e loro uso diagnostico merita un esame.
La storia di date culture organotipiche torna all'all'inizio 19° secolo, quando i tumori intracranici umani erano mano-ha tagliato in pezzi di tessuto e coltivate utilizzando il cosiddetto appeso metodo drop. Frammenti di tessuto sono stati associati un vetrino coprioggetto e immerga in plasma umano eparinizzato, dopo di che i coprioggetti erano invertiti, sigillati e coltivati per diverse settimane4al. Tagliare manualmente tumore pezzi sono state coltivate utilizzando una varietà di altri metodi, come ad esempio su coaguli plasma5, mezzi liquidi6, o il 0,45 µm poro dimensione filtri6. Il termine "organotipiche" è stato utilizzato nel 1954, in uno studio sulla differenziazione della retina del pulcino embrione occhio7. Ciò è stata seguita da studi che hanno utilizzato il polmone e cuore espianti di tessuto derivate da embrioni di pulcino8ed espianti cervello di ratti adulti9.
Vari metodi per affettare sono stati choppers descritto, vale a dire manuale10,11, Krumdieck tessuto affettatrice12,13e vibratomes11,14,15, 16. L'affettatrice di tessuto Krumdieck genera nuclei cilindrici del tessuto, che vengono tagliati in fettine di tessuto circolare utilizzando un microtomo. Un vibratomo, d'altra parte, utilizza un microtomo lama vibrante. In uno studio su fette del fegato, è stato dimostrato che la Leica vibratome genera più fette risultati riproducibili e coerenti rispetto affettatrice Krumdieck15. Sono stati utilizzati fetta spessori che variano da 250 a 500 µm, e studi riportano il mantenimento della vitalità e caratteristiche morfologiche anche fino a 16 giorni14,10,17,18. Tuttavia, i tumori hanno variabili profili metabolici che possono influire sulle esigenze nutrizionali e parametri quali la composizione del tessuto di rigidità e matrice possono influire sull'aerazione e flusso dei nutrienti. È quindi probabile che ogni tipo di tessuto richiede l'ottimizzazione delle condizioni di affettare e cultura.
Metodi di coltivazione differenti sono stati usati per sostenere le culture della fetta: io) cultura interfase stazionario, anche detta cultura supporto stagnante in cui fette sono collocati sulla sommità di un inserto di membrana semi-porosa immerso nel terreno di coltura. In questo, la parte superiore delle fette è esposto all'aria, mentre la parte inferiore è completata con nutrienti attraverso l'inserto poroso14,19; II) il metodo di cazzuola, originariamente sviluppato per organi interi cultura o fette di tessuto embrionale. In questo, fette sono collocati sopra un foglio di cotone o filtro supportato da una griglia metallica, e il filtro è imbevuto nel terreno di coltura. Per mantenere i tessuti umidi, un sottile strato di mezzo viene aggiunto in cima il fette20,21,22. Questi primi due sono i cosiddetti culture interfase del aria-liquido; III) rullo tubo culture, in cui fette sono posizionati all'interno la parte piatta di un tubo di plastica contenente mezzo, tubo lenta rotazione garantisce che il tessuto è coperto con il mezzo durante la prima parte di un ciclo, o aerato durante il secondo23; IV) unità di incubazione, in cui fette sono esposti in modo intermittente a mezzo con le sostanze nutrienti e aerazione rotanti. Diverso dal rullo di tubi, in questo metodo fette sono collocati in cima titanio poroso griglie posizionati in piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura24.
Fettine di tessuto derivato da tumori solidi resecati logicamente presenti un modello attraente ex vivo in cui verificare la risposta al trattamento di agenti anti-cancro, perché permettono la valutazione della vitalità, mirate attività di via e profili molecolari di un tumore specifico in presenza di suo microambiente tumorale nativo. Tuttavia, per valutare se le risposte di droga misurate in fette di tumore sono predittive di risposte in situ , è importante valutare in quale misura tessuto fette preservare tumore-specifiche funzioni biologiche quali la proliferazione cellulare, differenziazione delle cellule di istopatologia specifici o attività oncogena di segnalazione. L'impatto dello stress meccanico ha suscitato durante la preparazione di fetta, fetta imballaggio o adattamenti indotti da cultura sulla qualità e funzioni biologiche delle fette del tessuto sono domande fondamentali, strettamente legate alla capacità di implementare tumore-derivato fette per la diagnostica funzionale.
Il nostro progetto di consorzio finanziato dall'IMI PREDECT (http://www.predect.eu) propone di sistematicamente indirizzo queste domande fondamentali, attraverso lo studio di espianti di fetta da una varietà di fonti. Usando le fette derivate da modelli di cancro al seno, della prostata e del polmone, questo sforzo congiunto utilizzato qualitative letture così come ematossilina quantitativa e letture di eosina (H & E) - basata per dimostrare al fabbisogno di ossigeno atmosferico e stagnante filtro supporti per sostenere la vitalità delle fette coltivate fino a 72 h. Inoltre, analisi immunohistochemistry (IHC) su fette coltivate ha rivelato le sfumature di attuabilità intra-fetta, dimostrate come le sfumature di necrosi in fette derivate da cancro del polmone murino non a piccole cellule (NSCLC), ricevitore dell'estrogeno (ER), HIF1α e γH2AX sfumature in fette di cancro al seno, o sfumature di espressione del recettore (AR) dell'androgeno nel carcinoma della prostata sezioni25. È interessante notare che, intra-fetta gradienti di attuabilità nelle colture di 24 h di NSCLC murino furono salvati da coltivazione in un'unità di incubazione rotante, e il nostro studio recente ha mostrato che la redditività è stata estesa a 72 h26. In particolare il lato superiore è rimasto più praticabile26, sostenendo che le analisi di risposta di droga su fette migliori siano effettuate su questo lato del tessuto.
Anche se rimane una questione di come lontano fettine di tessuto possono riepilogare funzioni di tumore in situ , sono stati ampiamente utilizzati per testare le risposte agli agenti anti-cancro, tra cui farmaci mirati, anticorpi monoclonali e gli agenti di chemioterapia 10,11,13,14,18,27. Recentemente abbiamo mostrato che murini fette NSCLC mostrano cambiamenti dinamici nella proliferazione e oncogeno segnalazione attività seguendo coltivazione rispetto a 0 h tagliato di fresco fette26. Questo indica che è importante indagare se le funzioni biologiche mirati in situ sono conservate in modo appropriato durante la coltivazione, prima gli studi di perturbazione. Nonostante questi risultati, abbiamo mostrato che fette di tumore possono modello spaziale risposta a terapie mirate, mezzo droga rimangono trattamenti brevi (24 h) e vengono avviati all'inizio della coltura26. Il seguente protocollo descrive importante convalida aspetti rilevanti per l'istituzione e l'analisi delle culture di fetta di tumore, prima della loro applicazione in farmacologica della droga.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Colture organotipiche primario del tessuto espianto, che includono fette di taglio di precisione, rappresentano l'architettura tridimensionale (3D) del tessuto come pure le interazioni multicellulari di tessuto nativo. Fettine di tessuto tagliati immediatamente da appena resecati tumori conservano aspetti spaziali di intratumor eterogeneità, rendendoli così utili surrogati di biologia in vivo . Un'attenta ottimizzazione delle condizioni di coltivazione e preparazione fetta dei tessuti è fondamentale per il potenziale diagnostico predittivo di tumore fetta espianti. A questo proposito, modelli murini sono preziosi, come questi forniscono un flusso costante di materiale del tumore per eseguire esperimenti riproducibili e replicare. Questo protocollo descrive la coltura delle fettine di tessuto tumore-derivato di polmone murino utilizzando un'unità rotante di incubazione, un sistema che permette l'esposizione intermittente dei tessuti di ossigeno e sostanze nutritive. Il nostro lavoro precedente ha mostrato che l'uso di incubazione unità rotanti migliora la vitalità del tessuto rispetto ad altri metodi di coltura, particolarmente galleggiante fette e stagnante filtro supporta. Qui, più ulteriormente indichiamo che spessore fetta influenza la vitalità delle fette coltivate, suggerendo che l'ottimizzazione dello spessore fetta dovrebbe essere fatto per diversi tipi di tessuto. Pronunciata ITH in rilevanti funzioni oncogeniche, come segnalazione di attività, l'infiltrazione delle cellule stromal o espressione di marcatori di differenziazione, rende necessaria la valutazione delle fette del tessuto adiacente per l'espressione di marcatori alterata dal trattamento farmacologico o coltivazione di sé. In sintesi, questo protocollo descrive la generazione di fette di tumore del polmone murino e la loro cultura su un'unità di incubazione rotante e viene illustrato come fette dovrebbero essere sistematicamente analizzate per l'espressione di marcatori tessuto eterogeneo, come prerequisito prima gli studi di reazione di droga.

Figura 1 rappresenta il flusso di lavoro per la generazione, la coltivazione e l'analisi precisione di taglio delle fette del tessuto derivate da tumori murini di NSCLC. Per questa dimostrazione, abbiamo utilizzato i tumori da un modello di topo geneticamente (GEMM) che harboring attivazione condizionale di KrasG12D insieme con la perdita di Lkb1 (noto anche come serina/treonina chinasi 11), in prosieguo denominato KL. L'inizio del tumore del polmone e allevamento mouse è stata eseguita come descritto nel26,di28. Figura 2A viene illustrato l'effetto di spessore fetta del tessuto sull'attuabilità delle fette coltivate per 24 h utilizzando un'unità di incubazione rotante. I risultati mostrano che 160 µm fette sottili contengono ampie aree necrotiche in tutta la fetta. Inoltre, 250 µm fette sottili mostrano una necrosi gradienti in tutta la sezione rispetto alla 200 µm fette sottili. È probabile che la scarsa vitalità generale del più sottile 160 µm è causata dalla gestione tecnica durante il posizionamento delle fette in cima le griglie, in quanto questi sono fragili e tendono ad arricciarsi. D'altra parte, quando le sezioni sono troppo spesse, che possono diventare soggetti a carenze di ossigeno o diffusione dei nutrienti attraverso le fette, che nel NSCLC murino espianti è evidenziato come morte necrotica gradiente25. Tuttavia, dovrebbe essere notato che le fette con spessore variabile possono essere generati da un tumore, malgrado uso del vibratome identiche impostazioni. Si raccomanda pertanto di analizzare più replicati da campioni differenti del tumore. Cosa importante, ogni tipo di tessuto richiede l'ottimizzazione di spessore di fetta per ottenere la massima redditività, come la struttura del tessuto e la durezza può influenzare l'ossigenazione e il flusso dei nutrienti. Figura 2B -2C illustra analisi quantitative di IHC di espressione NKX2-1, un marcatore dell'adenocarcinoma bene-differenziato del polmone (AC) in campioni coltivati fino a 72 h e abbinati fette 0 h. I risultati mostrano che espressione NKX2-1 non è significativamente alterata in fette coltivate rispetto a 0 ore fette incolte, suggerendo che il processo di coltivazione non pregiudica apertamente lo stato di differenziazione del tessuto del tumore AC. Figura 2D dimostra l'utilità delle fette del tessuto del tumore per valutare l'efficacia di farmaci mirati. Recentemente abbiamo mostrato quel Kras mutante murino ACs esibire un'alta espressione di fosforilata ERK1/2 (marcatura aumentata attività di via MAPK) rispetto ai tumori adenosquamous (ASC), mentre l'espressione di 4EBP1 fosforilato (mTOR attività di marcatura ) allo stesso modo si esprime nei tumori sia AC e ASC. Per verificare se queste vie possono essere efficacemente mirate su fettine di tessuto, fettine di tessuto KL AC sono stati trattati con DMSO o titolato quantità di composti, cioè 0,1 – 1 µM dactolisib per indirizzare il mTOR o 0,05 – 0,5 µM selumetinib per indirizzare la via di MAPK. Risultati mostrano che dactolisib 1 µM o 0,5 µM di selumetinib sono efficaci nell'inibire la fosforilazione di ERK1/2, o di 4EBP1 rispettivamente. Inoltre, l'inibizione dose-dipendente delle fosfoproteine mirati indica che fettine di tessuto possono essere utilizzati anche per convalidare la fosforilazione di specifici anticorpi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro per creazione e analisi di murini espianti di tumore-derivato fetta NSCLC. (A) schema che descrive la raccolta e la preparazione dei polmoni del tumore-cuscinetto per affettare. I lobi del polmone sono raccolte da un mouse e tessuto del tumore è dissecato dal tessuto normale. La punta di freccia nera e asterisco indicano circa 4 mm e 1 mm tumori, rispettivamente. La punta della freccia bianca indica il tessuto polmonare incollato sulla superficie del portapreparato. La freccia rossa punta a un ulteriore pezzo di tessuto di sostegno del polmone normale per mantenere il tumore in posizione verticale. (B) Vibratome affettamento e raccolta delle fette del tessuto. Freccia bianca indica la direzione per affettare. Raccolta di fette sequenziale in una piastra a 24 pozzetti contenenti freddo HBSS + P/S. Le fette possono essere coltivate per intervalli di tempo differenti (qui, 24 – 72 ore) per valutare l'espressione di marcatori tumore-specifici durante la coltivazione (riga superiore), o possono essere utilizzate per eseguire trattamenti farmacologici. C: controllo del veicolo, t: trattamento farmacologico. (C) mettere la fetta di tessuto per coltivazione utilizzando gruppi rotanti di incubazione. Inclinare la piastra a 6 pozzetti in modo che qualche mezzo copre la parte superiore della griglia, mettete la fetta di tessuto al centro della griglia in cima il mezzo e diffondere la fetta usando il forcipe. Assicurarsi che la piastre da 6 pozzetti sono peso bilanciato per un ciclo di rotazione liscio. X: indica errato, e <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: indica il corretto posizionamento della fetta. (D) fotografia del blocco FFPE di una fetta del tumore. Punti di freccia nera alla fetta di tessuto paraffina-incastonato colorate con ematossilina. (E) schemi mostrando l'ordine taglio delle fette in blocchi FFPE; Queste sezioni possono essere elaborate per valutare la vitalità del tessuto e l'espressione di biomarcatore del tumore-specifici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figura 2: valutazione di attuabilità e istotipo specifico dell'espressione dei marker e trattamento farmacologico mirato su fettine di tessuto NSCLC. (A) rappresentante H & E immagini di fette di NSCLC AC degli spessori indicati coltivati per fette sottili di 24 h. 200 µm mantengono vitalità migliore rispetto a 160 µm o 250 µm fette sottili. Blu scuro rappresenta H & E macchiato il tessuto vitale, e rosa indica pseudocolored regioni necrotiche. Luce blu indica le regioni escluse dall'analisi, sia per la qualità scadente del tessuto o la presenza di stroma fibroso. T1 e T2 rappresentano replicati biologici derivati da due tumori diversi. Barra della scala = 500 µm. (B) IHC rappresentante immagini di espressione NKX2-1 in AC fette coltivate per i punti di tempo indicato. Freccia indica l'area mostrata a maggiore ingrandimento. Risultati mostrano che l'espressione NKX2-1 non è alterata nelle fette coltivate rispetto alle fette 0 h. Barra della scala = 500 µm e 50 µm per ingrandimenti di bassi e alti, rispettivamente. (C) la quantificazione dei dati illustrati in (B). (D) rappresentante IHC immagini di 4EBP1 fosforilati o espressione pERK1/2 in 0 h fette, o fette trattati con DMSO o titolato quantità di dactolisib (dact, riga superiore) o fosforilato espressione pERK1/2 in 0 h fetta, o fette trattati con DMSO o selumetinib (sel, riga inferiore). Scatole quadrate nere indicano nelle aree indicate nel più alto ingrandimento. Barra della scala = 1 mm o 50 µm per ingrandimento basso o alto, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Forniamo un metodo per la generazione, la coltivazione e l'analisi sistematica delle fette organotipiche derivate da tumori del polmone murino. Inoltre descriviamo come ottimizzare per spessore della fetta e come selezionare le concentrazioni di farmaco per il trattamento di fette di tumore.

Valutazioni e analisi di tumore fetta espianti come prerequisito per la prova diagnostica

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca preclinica, in cui gli studi di risposta ai farmaci nelle espianto di fette tumorali possono servire a scopi diagnostici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le espianto a fette possono per una breve finestra di tempo modellare la biologia complessa dei tessuti nativi, comprese le funzioni distribuite spazialmente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'uso di fette di tumori polmonari murini, può anche essere applicato ad altri tipi di tessuti tra cui tessuti umani.Per iniziare, preparare il vibratomo ed eseguire un VibraCheck secondo le istruzioni fornite nel manuale. Quindi riempire ogni pozzo della piastra da 24 pozzetti con un millilitro della soluzione salina bilanciata di Hank integrata con penicillina e streptomicina e tenere la piastra sul ghiaccio. Inserire aghi calibro 25 in tutte e quattro le zampe di un topo eutanasiato posto su un coperchio di polistirolo in modo che il torace sia esposto e l'animale sia allungato.Spruzzare 70% di alcol sulla superficie della pelle esposta. Utilizzare le forbici poste in posizione angolata per aprire la pelle dall'addome verso il torace e fino alla regione del collo. Allungare la pelle su entrambi i lati utilizzando pini e inserire aghi calibro 25.Aprire la regione addominale. Quindi aprire la gabbia toracica e il diaframma per esporre il polmone e il cuore. Esporre la trachea tagliando via il tessuto circostante.Sezionare i polmoni, insieme al cuore. Posizionare i tessuti in un tubo da 50 millilitri contenente 30 millilitri di HBSS ghiacciato integrato con Pen-Strep posto sul ghiaccio e procedere al passo successivo il più rapidamente possibile. Ora trasferisci i polmoni portanti il tumore in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri.Utilizzare forbici sterili e forcep per separare i lobi polmonari e selezionare i lobi con tumori in superficie per l'affettamento. Posizionare un lobo polmonare con un tessuto tumorale su un pezzo di carta filtrante per evitare di scivolare e tagliare parte del normale polmone o tessuto tumorale aggiuntivo che circonda il tumore utilizzando un bisturi sterile per generare una superficie piana del pezzo di tessuto. Immergere il lato piatto in una goccia di adesivo cianoacrilato e montarlo sul supporto del campione del vibratomo in modo che il tumore affronti la lama in posizione verticale e lasciarla asciugare per due o tre minuti.Posizionare il supporto del campione del vibratomo nel vassoio tampone metallico. Riempire il vassoio con HBSS freddo integrato con Pen-Strep fino a quando il tessuto non è immerso nel tampone. Coprire il vassoio tampone con il coperchio in plexiglas fornito con lo strumento e posizionare il vassoio in un bagno di ghiaccio bianco e aggiungere ghiaccio per mantenere il tessuto fresco durante l'affettamento.Attaccare il bagno di ghiaccio bianco al vibratomo. Quindi selezionare le impostazioni di affezione adatte e iniziare a affeggiare. Portare la lama del vibratomo nella posizione di affettamento e impostare la finestra di affettamento.Utilizzare forcep sterili per raccogliere le fette in una piastra da 24 pozzetti riempita con un millilitro di HBSS integrato con Pen-Strep per pozzo e tenere sul ghiaccio. Pur tenendo traccia dell'ordine di affettamento, contrassegnare ogni pozzo della piastra da 24 porsi secondo il piano sperimentale. Raccogliere una fetta di tessuto adiacente alle fette coltivate come zero ore o riferimento non coltivato.Raccogliere almeno tre fette di riferimento per rappresentare la parte superiore, centrale e inferiore del tessuto. E una volta completato l'affezione, continuare con il fissaggio e l'elaborazione. Successivamente, preparare una piastra di sei porvili contenente 2,5 millilitri di terreno di coltura per pozzo posizionando vi griglie di titanio.Assicurarsi che non si formano bolle d'aria tra la griglia in titanio e il mezzo. Per caricare una fetta sulla griglia, mantenere la piastra a sei pozzi in posizione angolata in modo che una parte del mezzo copra la griglia. Quindi posizionare la fetta nel mezzo sulla griglia e utilizzare le forcep per diffonderla.Dopo aver posizionato le fette, caricare le piastre a sei porri sull'unità di incubazione rotante posizionata all'interno di un incubatore umidificato mantenuto a 37 gradi Celsius con 95%02 e 5%CO2. Avviare il ciclo di rotazione. Per la coltivazione a lungo termine ricostituire il mezzo di coltura ogni giorno utilizzando forcep sterili per sollevare la griglia contenente le fette di tessuto e posizionare in un pozzo vuoto del piatto a sei pozzi.Sostituire il 70% del mezzo con un mezzo di coltura fresco e riposizionare la griglia. Continuare il ciclo di rotazione come in precedenza. Per il trattamento farmacologico sulle fette tumorali aggiungere 2,5 millilitri di media con il farmaco diluito o il controllo del veicolo nella piastra a sei pozzi.Posizionare le griglie in titanio nei pozzi e quindi posizionare le fette sulle griglie come fatto in precedenza. Dopo aver eseguito i trattamenti per 24 ore, continuare con il fissaggio e la lavorazione. Per iniziare a fissare la fetta desiderata, trasferirla con cura utilizzando le forcep in una piastra di 10 centimetri contenente una carta filtrante imbevuta riempita con PBS da due a tre millilitri e lasciarla galleggiare.Quindi sollevare la carta da filtro con un paio di forcep e posizionarla in una cassetta histo. Trasferire la carta filtrante in una cassetta histo. Aggiungere una goccia di ematossilina diluita sopra la fetta di tessuto per contrassegnare la posizione della fetta per i passaggi successivi.Chiudere la cassetta e trasferirla in una soluzione di formalina tamponata neutra al 4% e lasciare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo il lavaggio e la lavorazione della cassetta come descritto nel protocollo, aprire la cassetta histo e utilizzare un bisturi per sollevare con cura la fetta fissa dalla carta filtrante. Scartare la carta da filtro e trasferire la fetta in uno stampo contenente paraffina liquida.Utilizzare un peso piatto per premere il tessuto contro il fondo dello stampo di incorporamento per garantire una sezione uniforme. Posizionare la parte inferiore della cassetta histo sopra lo stampo. Aggiungere paraffina liquida sopra di esso.E lasciare raffreddare lo stampo su una piastra fredda per 30 minuti. Successivamente separare lo stampo raffreddato dal blocco di paraffina. Utilizzare un microtomo per preparare sezioni sottili di quattro micrometri dei blocchi di fette di tessuto FFPE.Tagliare via l'eccesso di paraffina che circonda il tessuto. Per ottenere sezioni pari in tutto il tessuto regolare l'angolo del blocco in modo che la superficie del blocco sia orientata orizzontalmente rispetto alla lama. Utilizzando un pennello sottile raccogliere sezioni di tessuto sequenziale della fetta di tessuto incorporata nella paraffina a partire dalla parte superiore dei vetrini.Continuare a raccogliere le sezioni degli strati di tessuto più profondi al centro, seguite dalla parte inferiore delle diapositive di vetro. La raccolta di sezioni da diversi strati di ogni fetta di tessuto alle diapositive dell'oggetto viene eseguita per consentire l'acquisizione di potenziali gradienti indotti dalla coltura in vitalità, migrazione cellulare o espressione del biomarcatore. Dopo aver raccolto le sezioni continuano con la loro elaborazione e ulteriore analisi come descritto nel protocollo.Lo spessore delle fette di tessuto può influenzare la vitalità delle fette coltivate. In questo caso, le fette spesse 250 micrometri mostrano un aumento dei gradienti di necrosi rispetto alle fette spesse 200 micrometri a causa di fette più spesse che diventano soggette a carenze di ossigeno o diffusione dei nutrienti attraverso le fette. Tuttavia, le fette sottili da 160 micrometri contengono grandi aree necrotiche probabilmente causate dalla manipolazione tecnica durante il posizionamento delle fette in quanto queste sono fragili e tendono ad arricciarsi.L'analisi di NKX2-1, un marcatore di adenocarcinoma polmonare ben differenziato, mostra che la sua espressione non è significativamente alterata nelle fette coltivate rispetto alle fette non coltivate a zero ore. L'analisi quantitativa dell'espressione NKX2-1 ha inoltre confermato che l'espressione non è stata alterata in modo significativo nelle fette coltivate rispetto a quelle non coltivate, suggerendo che il processo di coltivazione non influisce visibilmente sullo stato di differenziazione del tessuto adenocarcinoma. Per verificare se le fette di tessuto tumorale possono essere utilizzate per valutare l'efficacia dei farmaci mirati, sono stati trattati con DMSO o quantità titole di composti.Quando viene trattato con un dactolisib micromolare che prende di mira la fosforilazione della via mTOR di 4EBP1 è stato inibito. 0,5 selumetinib micromolare che si rivolge alla via MAP chinasi è stato efficace nell'inibire la fosforilazione di ERK1/2. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come lavorare e analizzare criticamente le fette appena tagliate da preziosi tessuti tumorali.La nostra ex postdoc, Katja Narhi, ha contribuito in modo significativo alla creazione di questo metodo in collaborazione con i colleghi della piattaforma IMI Predect Consortium Tissue Slice.

Research

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