Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
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혁신적인 의약품 사업 공동 사업에서이 연구 작업 받은 재정 지원 부여 계약 no 115188, 의학 장학금 (A.S.N.), 헬싱키의 대학 박사 프로그램 그리고 Sigrid Juselius 및 오리온 Farmos 기초 (E.W.V.) 우리가 진심으 우리의 PREDECT 조직 조각 플랫폼 컨소시엄 회원 감사 (Taija af Hällström와 Siv Knaappila 회전자 시스템 설정에서 지원에 대 한 MATLAB 분석 지원 위한 리 쿠 Turkki. Jouko 시로 그림 1 사진 캡처에 대 한 감사입니다. 우리 조직학 슬라이드, 스캔 FIMM WebMicroscope 팀을 감사 하 고 농업에 대 한 실험실 동물 센터 지원.

이 연구에서 설명 하는 모든 마우스 실험에서 핀란드 국가 위원회의 동물 실험, 지침에 따라 수행 했다 그리고 헬싱키의 대학, 국가 지방의 실험 동물 위원회에 의해 승인 되었다 남쪽 핀란드 (면허 번호 ESAVI/9752/04.10.07/2015)의 사무실.
1입니다. 슬라이스 이전 준비
<ol><li>다음과 같은 자료를 준비 유지: vibratome 견본 홀더, vibratome 버퍼 트레이, 10 cm 배양 접시, 24-잘 접시, 10 mL 피 펫, 피 펫 보가, 쓰레기 봉투, 70% EtOH 50 mL 튜브에 악기, 그리고 조직 접착제를 소독.</li>
	<li>준비는 vibratome: 70% 블레이드 홀더를 닦아 EtOH, 새로운 잎을 연결 하 고 vibrocheck (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) 설명서에 제공 된 지침에 따라 수행. 참고: 그것은 칼 날의 수직 편향도 최소화 하 고 보장 좋은 품질 조각 vibrocheck 단계를 수행 하는 것이 중요.</li>
	<li>각 채우기 1 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 (HBSS + P/S); 보충으로 24-잘 접시의 잘 얼음에 플레이트를 유지.</li>
	<li>F12 문화 매체와 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2 m m glutamax, 22 mM 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 보충을 준비 합니다. 참고: 종양 조각 문화 매체와 성장 인자 보충 종양 조직25에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>약물 치료, 1.4, 단계에서 설명한 대로 동일한 구성을 사용 하 여 하지만 생략 하는 FBS F12 매체의 필요한 금액을 준비 합니다. 참고: 성장 인자는 혈 청에서 종양 신호 교양된 조각에 영향을 미칠 수, 혈 청 자유로운 매체 것이 좋습니다 종양 조각에 단기 약 섭 동 연구. 장기적인 조각 문화를 분석 하는 경우 그것은 먼저 조직의 생존 및 치료 슬라이스 문화에 특정 종양 마커 식 혈 청 자유로운 매체의 효과 평가 하는 것이 중요.</li>
</ol>2입니다. 폐 종양-베어링의 수집
<ol><li>보람된 호흡의 증상 및 체중의 손실을 보여줄 때 자 궁 경부 전위에 의해 종양 베어링 마우스를 안락사. 참고: 공동2-중재 안락사 유도 슬라이스 생존 또는 hypoxic 응답 도출을 통해 종양 활동에 영향을 미칠 수 있습니다 폐에 hypoxic 조건으로 알려져 있다.</li>
	<li>가슴 노출 되는 모든 4 개의 발에 30 G 바늘을 삽입 하 여 스티로폼 뚜껑에 안락사 마우스를 스트레칭.</li>
	<li>피부를 잘라 오픈는 복 부에서 가슴 그리고 목 영역. 흉 곽 그리고 폐와 심장에 막 오픈 컷. 조직 손상을 방지 하기 위해 각된 위치에는 위를 유지.</li>
	<li>마음 함께 종양 베어링 폐 해 부와 포함 하는 얼음 처럼 차가운 HBSS + P/S 30 mL 50 mL 튜브에 넣어 튜브를 차가운 유지 하 고 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행 하십시오. 참고: 폐 종양의 처리에 있는 지연을 변경할 수 있습니다 종양 기능, 예를 들면 신호 통로 활동.</li>
</ol>3. 정밀 컷 폐 종양 조각 생성
<ol><li>층 류 후드 내부 보관 10cm 조직 문화 접시에 종양 베어링 폐 HBSS + P/S를 전송 합니다. 살 균가 위, 집게를 사용 하 여 폐 엽 고 종양 부 러 뜨 리 표면에 돌출부를 선택 합니다. 참고: 종양 > 3 m m 크기에 부 러 뜨 리는. 삭제 된 종양 지역 얼굴 vibratome 블레이드는 정상 폐 조직을 둘러싼 큰 종양 타협 조직 경직 차이로 인해 슬라이스, 이후 종양 조직은 자르는 겪고 정상 조직에서 분리 한다.</li>
	<li>플랫 조직 조각 표면 살 균 메스와 멀리 종양 주변 정상 폐 조직의 절단 부분에 의해 생성 하 고 cyanoacrylate 접착제의 방울에서 플랫 슬라이드를 찍어. 종양 얼굴 수직 위치에 블레이드를 vibratome의 견본 홀더에이 쪽을 탑재 합니다. 하자 2-3 분 동안 건조 접착제. 참고: 견본 홀더에 붙어 정상적인 폐 조직 방해 하지 않는 종양 조직 슬라이스, 그리고 정상적인 조직에 도달 하기 전에 중지 슬라이스. 때로는 종양 조직 견본 홀더, 타협의 직 립 위치에 붙어 정상 폐 조직의 해 면 질감으로 인해 굴절. 이 경우, 추가 정상적인 폐 지원 조직 유지 수직 위치 (그림 1A iii)에 종양을 미리 탑재 된 정상 폐 조직 옆의 조각을 접착제.</li>
	<li>금속 버퍼 쟁반으로 견본 홀더를 배치 하 고 버퍼에 조직 몰입은 때까지 차가운 HBSS + P/S 함께 그것을 채우십시오. 하얀 얼음 목욕에 금속 버퍼 트레이 놓고 얼음 그래서를 유지 하는 조직 멋진 슬라이스를 추가 합니다.</li>
	<li>흰색 얼음 목욕은 vibratome에 연결 합니다. 적합 한 조각화 설정을 선택: 2.5-2.8, 0.10 0.14 사이 속도 자르는 사이 이르기까지 진폭 ms, 그리고 160-250 µ m 사이 배열 하는 절단 두께. 참고: 조각화 설정을 조직의 경도 따라 조정 될 필요가 있다. 하드 티슈는 부드러운 조직 보다 슬라이스를 쉽게 하며 부드러운 조직 낮은 속도로 슬라이스 (0.1-0.12 ms) 및 더 높은 진폭 (2.6-2.8). 4-5 m m 큰 종양은 일반적으로 200 µ M 두께의 15-20 분할 영역을 제공합니다. 단기 재배 murine 종양 박판 모양 후드 밖에 서 반 무 균 조건 하에서 슬라이스 수 있다. 그러나, 임상 종양 항상 클래스 II biosafety 박판 모양 후드 인간의 조직에 가능한 전염 성 대리인에 노출을 피하기 위해 내부 슬라이스 한다.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여, HBSS, 얼음에 24-잘 접시의 별도 우물에 밀접 하 게 조각 슬라이스는 순서에의 추적 유지의 1 mL에 조각을 수집 합니다. 각을 표시 하는 것은 실험 계획에 따라 24-잘 접시의 잘. 예를 들어 마크 순차 웰 스 24-잘 접시의 문화 시간 포인트 또는 0 h, 차량 제어 (C), 마약 치료 (T) (그림 1B ii). 참고: 하거나 방해 마십시오이 후속 조각의 두께에 불일치를 선도 하는 칼 날의 각도 대해 종양의 방향을 바꿀 것으로 한 조각을 수집 하는 동안 종양 조직을 당겨.</li>
	<li>모든 조각을 수집 하는 때 잘 당 문화 매체의 2.5 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트에 티타늄 격자 (그리드 당 2-3 조각)에 그들을 전송. 티타늄 격자와 매체 사이 아무 공기 방울 형성 되 다는 것을 확인 하십시오.<ol>
<li>그리드 위에 슬라이스를 로드 하려면 매체의 부분 커버 눈금, 각도 위치에 6 잘 플레이트를 유지 하 고 그리드;에 매체에는 슬라이스를 배치 집게를 사용 하 여 그것 곱슬 경우 슬라이스를 확산. 95% 공기와 5% CO2, 37 ° C에서 유지 하는 습도 인큐베이터 안에 회전 외피 단위에 6 잘 플레이트를 로드 하 고 회전 주기 (그림 1C i-ii)를 시작 합니다. 참고: 금속 격자와 6 잘 플레이트 무게 회전 장치를 켜기 전에 균형을 정확 하 게 되도록 해야 합니다. 격자의 한가운데에 분할 영역을 배치 하는 것이 중요 하다 그래서 그들은 완전히 공기 및 회전 주기 동안 액체 단계 사이의 대체. 너무 낮거나 높은 배치는 조각 산소 또는 양분 (그림 1C 나), 조직의 생존을 손상 시킬 수 있는 적절 하 게 노출 되지 않습니다. 그것은 조각을 아래로 슬라이드 때때로 수로 재배, 동안에 조각의 위치를 따르는 것이 중요입니다. 이 문화 발병 1-2 시간 내 경우, 그것의 위치를 수정 하 고이 샘플을 손상 될 수 있습니다 메모. 시간의 연장된 기간에 대 한 mispositioned는 분할 영역 조직 생존 능력은 크게 부적당 한 산소와 영양 공급에 의해 영향을 폐기 해야한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 0-h, 뱀과, 참조 교양된 분할 영역에 인접 한 조직 조각을 수집 합니다. 위쪽, 중간 및 슬라이스 되는 직물의 센터를 3 개 이상 참조 조각 수집 합니다. 5.1에 설명 된 대로 즉시 0 h 슬라이스 및 프로세스를 수정. 참고: 조각 수가 제한 된 경우, 예를 들어, 여러 복합 치료 또는 기술 복제를 할 수 있습니다, 만약 그것의 이웃 0 h 샘플 각 치료 샘플의 비교 어려울 수 있습니다. 이러한 경우에 문화 발병에 관련 마커의 식이나 상대 조직 생존 능력을 평가 하기 위해 가장 가까운 0 h 슬라이스 (적어도 400-600 µ m 간격)를 사용 합니다.</li>
	<li>장기 재배에 대 한 문화 매체를 매일 보충. 격자 살 균 집게를 사용 하 여 조직 조각을 포함 하 고 6 잘 플레이트;의 빈 우물에 신선한 문화 매체와 매체의 70%를 교체 하 고 매체에서 다시 그리드를 배치. 3.6 단계에 설명 된 대로 회전 주기를 계속 합니다.</li>
</ol>4. 치료 종양의 작은 분자 억제제와 조각
<ol><li>치료 중간에 화합물의 필요한 농도 준비 합니다. 일반적으로, 셀 문화에서 측정 하는 IC50s에 비해 10 높은 약물 농도 조직 조각에서 대상 억제를 달성 하기 위해 필요 합니다. 불특정 세포 독성을 방지 하려면 각 화합물에 대 한 최소 유효 농도를 농도의 범위를 테스트 합니다. 여기, 우리는 0.1-1 테스트 PI3K/mTOR 억제제 dactolisib 및 0.05-0.5 µ M의 murine NSCLC 슬라이스에 MEK 억제제 selumetinib µ M.</li>
	<li>6 잘 플레이트에 희석된 약물 또는 DMSO 또는 다른 차량 제어와 미디어의 2.5 mL를 추가 합니다. 우물에 티타늄 격자를 놓습니다.</li>
	<li>3.6 단계에서 설명한 대로 격자에 조직 조각을 놓습니다.</li>
	<li>조직 고정 및 파라핀 블록 섹션 5에에서 설명 된 대로 조각 처리 24 h. 진행 차량 또는 약물 치료를 수행 합니다. 참고: 약물 치료의 기간 최적화할 수 있습니다 실험의 목표에 따라 조직 기능 현장에 문화 기간 동안 분석 유지 조직 조각 수를 고려.</li>
</ol>5. 고정 및 조직 조각 처리
<ol><li>요 0 h 참조 또는 PBS에 배어 필터 종이에 교양된 슬라이스를 조심 스럽게 들어올립니다.<ol>
<li>이렇게 하려면 10 cm 접시에 PBS의 2-3 mL를 추가 하 고 PBS에 슬라이스 플 로트 보자 '생선' 그것 밖으로 집게의 쌍을 가진 필터 종이에 슬라이스를 올려서.</li>
		<li>필터 종이 histocassette로 전송 하 고 가시 후속 처리 단계 (그림 1D) 분할의 위치를 표시 하려면 조직 조각 위에 희석된 되며 (이온을 제거 된 물에 1:1)의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>카세트, 닫고 4% 중립 버퍼링된 말린 솔루션으로 그것을 전송 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 조직 수정 참고: 필터 종이 위에 슬라이스를 삽입 하는 동안에 분할의 맨 위 섹션 위쪽; 직면 있는지 확인 이 단면 및 분석 단계 6.3에에서 설명 된 대로 위쪽, 중간, 및 조각의 아랫부분을 따라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 70%에 카세트를 전송 EtOH, 즉시 파라핀 포함 조직 처리 단계를 계속 진행.</li>
	<li>조직 처리 전에 씻는 histocasettes 100% EtOH 2 각 10 분 x. 이 경우에, 전자 레인지의 역을 사용 하 여 조직 처리에 대 한. 1mm 조직 두께에 사용 되는 프로그램을 선택 하 고 설명서 (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf)에서 제공 하는 지침을 따릅니다. 참고: 다른 조직 가공 기계를 사용 하 여 때 얇은 조직 샘플에 대 한 적합 한 프로그램을 사용 합니다.</li>
	<li>파라핀 포함 한 histocassette 열고 메스를 사용 하 여 필터 종이에서 슬라이스를 조심 스럽게 들어올립니다. 필터 종이 삭제 하 고 액체 파라핀을 포함 하는 금형에는 슬라이스를 전송.<ol>
<li>예를 들면 무게로 평면, 단면도 되도록 포함 형의 하단에 대 한 조직을 누릅니다. 금형의 위에 histocasette의 하단 부분, 30 분, 차가운 머리에 몰드 식 놓고 파라핀 블록에서 금형을 분리 합니다. 참고: 수평 포함 하는 대신, 그것은 수직으로 직 립 위치에 조각을 배치 하 여 종양 슬라이스를 포함 수. 세로 섹션 쉽게 생존 또는 단일 섹션 25에 기능 마커 식에 기온 변화도의 분석을 허용합니다. 가로 포함 된 조각으로 그라데이션 분석 단계 6.2에서에서 설명한 단면 파라핀을 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 처리 및 분석의 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직
<ol><li>톰을 사용 하 여 FFPE 직물 조각 구획의 4 µ m 얇은 섹션을 준비 합니다. 단면 때 조정 블록의 각 블록의 표면이 블레이드; 기준 가로 방향 이것은 조직에 걸쳐도 섹션을 얻을 필요가 있다.</li>
	<li>교양된 분할 영역에 걸쳐 조각, 또는 바이오 마커 식에서 그라디언트 잠재적인 문화 유도 생존 그라데이션, 세포 이동의 캡처를 사용 하려면 섹션에서에서 수집 조직 조각의 각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 레이어 개체 슬라이드에 로 아래 설명 했다.</li>
	<li>유리 슬라이드의 상단 부분에 먼저 파라핀 끼워 넣어진 조직 조각의 순차 조직 단면도 수집 합니다. 계속 중간 유리 슬라이드 (그림 1E)의 하단 부분 뒤에 더 깊은 조직 층의 섹션을 수집 합니다. 참고: 3 개의 단면도 유리 슬라이드에 맞게 손질 멀리 임베디드 조직 조각을 둘러싼 파라핀의 초과.</li>
	<li>37 ° C에서 건조 하룻밤 섹션을 허용 하 고 아래 설명 된 대로 H & E 염색 또는 immunohistochemistry 진행. 참고: antigenicity의 손실 FFPE 섹션 시간의 연장된 기간에 대 한 높은 온도에서 저장 하는 경우 발생할 수 있습니다. 파라핀 섹션은 4 ° C에 저장 하는 것이 좋습니다 그리고 IHC 분석 단면 후 6 개월 이내에 실행 되어야 한다.<ol>
<li>H & E 염색, deparaffinize 및 파라핀 섹션을 다음과 같이 rehydrate: 크 실 렌 3 x 5 분, 100% EtOH 3 x 1 분, 96% EtOH 2 x 1 분, 70% EtOH 1 x 1 분, 그리고 이온된 수 2 1 분 x.</li>
		<li>10 분, 갓 필터링된 되며 솔루션에서 섹션을 품 어 및 산 성 알코올에 수돗물 5 분 딥에 대 한 섹션을 실행 하는 아래 세척 (1% HCl 70 %EtOH에서) 2 번, 그리고 5 분 뒤에 2 분에 대 한 0.5% 오신 가진 외피에 대 한 수돗물을 실행 하는 아래 세척에 대 한 .</li>
		<li>다음과 같이 알코올 및 자일 렌 솔루션에 슬라이드를 immersing 하 여 섹션을 탈수 오신 단계에 따라: 96% EtOH 2 x 15에 대 한 s, 100% EtOH 3 x 30에 대 한 s, 크 실 렌 3 x 1 분. 마지막으로, 크 실 렌 기반 설치 매체에 섹션을 포함 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 조직의 생존 및 Biomarker 식의 분석
<ol><li>H & E 스테인드 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 전체 슬라이드 검사를 생성 하 여 높은 해상도 이미지를 취득 합니다. 조직 생존 능력을 평가 하는 조각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 섹션을 나타내는 조직 검사에서 스냅샷 촬영.<ol>
<li>수동으로 사진 조작 소프트웨어를 사용 하 여 MATLAB를 사용 하 여 괴 사 성 영역의 정량화 다음 조직의 괴 사 성 영역에 마스크를 그립니다.</li>
		<li>우리의 이전 연구 (Närhi 그 외 여러분, 그림 S2B 와 C)26일 가까운 0 h 조각에 비해 다른 시간 포인트 재배 조각의 상대 생존 능력을 계산 합니다. 마찬가지로, 잠재적인 내부 슬라이스 생존 그라디언트 교양 조각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 섹션에서 생존 능력을 측정 하 여 평가 하 고 가장 가까운 0 h 슬라이스에 각 섹션의 상대 생존 능력 계산. 참고: 동안 murine NSCLC 조각의 단순한 재배 회 저 성 세포 죽음을 유도, 비보 전 문화 조건에 생물학 응답 종양 조직에 따라 다릅니다. 예를 들어 HIF1α, 응급실, 및 f 4/80에 의해 표시 하는 세포에서 그라디언트 유 방 암 모델25에서 파생 된 필터 지원 슬라이스 문화에서 발견 했다. 따라서, H & E-로 교양 조각의 IHC 기반 분석 각 조직의 유형에 대 한 고려 필요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IHC 파라핀 섹션에 수행 합니다. 다음 IHC 프로토콜 시작 지점 이며 다른 항 체에 대 한 최적화를 더 요구 한다. 짧게, deparaffinize 및 파라핀 섹션을 다음과 같이 rehydrate: 크 실 렌 3 x 5 분, 100% EtOH 3 x 1 분, 96% EtOH 2 1 분, 70% x EtoH 1 1 분 및 이온된 수 2 x x 1 분에 대 한.<ol>
<li>항 원 epitopes를 노출, 10 m m 구 연산 산 성 pH 6 PT 모듈에서에서 사용 하 여 열 중재 항 원 검색을 수행 하려면 뒤 정상 염소 혈 청 (NGS) 주위 온도 (21-23 ° C)에서 30 분 동안 1 x PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10% 차단.</li>
		<li>BSA는 1%와 5% 희석 1 차적인 항 체를 품 어 NGS 주위 온도에 1-2 h에 대 한 1 x PBS에. 30 분 뒤에 3, 3 '-Diaminobenzidine (한 덩어리)를 사용 하 여 탐지 하는 주위 온도에 대 한 안티 토끼 2 차 항 체로 품 어.</li>
		<li>섹션 30 s, 및 같이 알코올 및 자일 렌 솔루션에 슬라이드를 immersing 하 여 탈수 뒤 5 분 동안 수돗물에 세척 (이온을 제거 된 물에 1시 10분 희석) hematoxylin와 counterstained는: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, 크 실 렌 3 x ( 1 분 각 단계). 마지막으로, 크 실 렌 기반 설치 매체에 섹션을 포함 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IHC 스테인드 슬라이드의 전체 슬라이드 검사를 취득 하 고 확대 비율 1: 4를 사용 하는 이미지 뷰어를 사용 하 여 이미지를 TIFF로 ImageJ를 사용 하 여 quantifications를 수행 합니다. 참고:로 스캐너 대신, 20 X 40 X 확대에서 미세한 이미지 quantifications에 대 한 취득 될 수 있다. 이미지 확대; 측정할 수 표시에 따라 선택 될 수 있다 높은 확대 이미지는에 권장 핵 얼룩 세포질 또는 막 마커 20 X 이미지를 사용 하 여 양이 정해질 수 있다.<ol>
<li>핵 감 적의 정량화,이 경우 NKX2-1 식, 각 이미지 피지 ImageJ를 사용 하 여 16 비트 이미지를 변환 및 이미지 분석에 대 한 이미지를 업로드.</li>
		<li>이미지 분석 파이프라인 분석에 따라 사용자 지정 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 다음 파이프라인 NKX2-1 긍정적인 핵의 정량화에 대 한: 식별 기본 개체 | 개체 강도 측정 | 개체를 필터링 (최소 값 = 0.0025) | Math. 계산 결과 DAB 스테인드 핵 핵의 총 수의 백분율로 표현 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

다양 한 복잡 한 생체 외에서 종양 모델, 3D 문화 등 organoids, 건축과 비보에 종양 조직29,30의 종양 기능 정리에 개발 되었습니다. 그러나, 조직 분리 및 단일 셀 형식의 선택적 성장 또는 공동 문화는 선택 몇 종류의 세포 인공 환경에서 3D 문화 또는 organoids의 설립 포함 한다. 결과적으로, 같은 모델은 종양이 종양 기질 상호 작용의 복잡 한을 불완전 하 게 캡처합니다. Organotypic 종양 조각, 다른 한편으로, 현장에서 종양의, 광범위 한 조작 없이 조직 아키텍처 및 생물 복잡성을 유지합니다. 그들의 네이티브 microenvironment에 모델 종양 세포 조직 조각의이 능력 특히 전 임상 연구에 대 한 매력적인 그들을 렌더링합니다. 우리는 이전 설립 및 정밀 컷 종양 조각의 분석에 대 한 최적화 된 워크플로 보고와 회전 외피 단위 향상 단기 murine NSCLC 슬라이스 문화25 의 생존 능력을, 지 원하는 필터에 비해, , 그러나 31., 회전 단위에 경작은 기술적으로 도전 하며 지속적인 모니터링. 우리 여기 종양 조직 조각 생성 및 실용화는 그들 문화 외피 단위 회전 뿐 아니라 동반 캡처 원래의 종양 생물학, 약 전에 필수 조각 수를 모니터링 하는 방법에 대 한 프로토콜을 제시 응답 테스트입니다.
프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 조직 무결성 및 종양 조각의 생존 능력을 확인합니다. 정상적인 폐 조직 종양 주변, 경우는 vibratome 일관성 없는 두께 슬라이스를 생성 하거나 조각 텍스처 및 강성 정상 및 종양 조직 간의 차이로 인해 손상 수 있습니다. 따라서 종양 부 러 뜨 리 하기 전에 주변의 정상 폐 조직을 제거 하는 것이 중요입니다. 또 다른 중요 한 단계는 신중 하 게 각 조직 유형에 최적화 해야 슬라이스 두께입니다. 또한, 슬라이스, 일단 그는 슬라이스는 약 중앙 배치 그리드, 정확한 보장 하기 위해 그래서 간헐적으로 문화 매체에 산소 노출을 찍기 긴요 하다. 마지막으로, 그것은 그것의 회전 기간 동안 한 조각의 위치를 따르는 것이 중요 한 조각 수 있습니다 드롭 다운 매체; 이 경우, 추가 작업 반입할 수 있습니다 프로토콜의 3.6 단계에 설명 된 대로.
무결성을 보장 하기 위해서 처리 하는 조직 뿐만 아니라 또한 있다 중요 한 단계 IHC 분석을 어떻게 조각 유사한 기본 조직 해석에서. 우리의 이전 연구 murine NSCLC 종양 종양 신호 활동26발음된 내부 종양 공간이 전시 보였다. 즉 공간 별개 조직의 사용 컨트롤에 대 한 조각 또는 약물 치료 샘플 신뢰할 수 있는 실험 데이터 해석에 영향을 미칠 수 및 따라서 밀접 하 게 인접 한 분할 영역 컨트롤 및 테스트 샘플으로 사용 해야 합니다. 우리 더 확산 하는 동안 보여주었다 또는 갓 잘라 요 0 h 조각에 종양 phosphoprotein 식 현장에서 종양, 유사 했다 교양된 조각 보여주는 변경 된 종양 phosphoprotein 식, 특히 변경 된 p4EBP1 그리고 pSRC, 뿐만 아니라 변경 된 확산 Ki67 IHC 분석. 변경 된 p4EBP1 식 24 h에 감지 마찬가지로 인간의 NSCLC 및 전립선 암 문화 슬라이스 (Narhi 외., 보충 그림 S3B S3C, S5, S7)26. 이러한 연구 결과 그들의 가장 가까운 0 h 미 슬라이스 교양 조각의 비교 교양된 조각에 종양 기능 제자리에 의 보전을 평가 하기 위해 매우 중요 하다 보증.
Organotypic 조각25의 가능성, 개선에 불구 하 고 교 칙에서 회전자 시스템 제한이 있습니다. 티타늄 격자에 조직 조각 배치 이며 삽입, 필터링에 비해 더 도전 회전 외피 단위를 사용할 수 없습니다. 대신, 정체 필터 지원 사용할 수 있습니다, 하지만 그 경우에 공기에 노출 된 조각 측면 분석 해야 합니다, 생존 능력 및 HIF1α 식으로 측정 하는 산소 공기 필터 그라디언트 필터 지원 조각에 빠르게 형성으로 문화 (데이비스 외 알., 그림 5와 그림 7A 7B)25. 우리는 더 변경 된 확산 및 상처 치유 응답 또는 비보 전 에 조각의 변화 적응 가능 하 게 그들의 네이티브 종양26에 비해 종양 신호 활동 종양 조각 문화 전시 수 있습니다 나타났습니다. 32문화. Murine NSCLC 종양의 심한 형태학 상 특징 재배 72 h 동안 유지 되었다, 비록 문화 유도 증식 변화 재배 조각의 정확한 등급 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 조직 조각 단기 기능 연구만 활용 되어야 합니다.
회전 외피 단위를 사용 하 여 적어도 부분적으로 문화의 첫 24 시간 동안 특히 내부 슬라이스 생존 또는 바이오 마커 식 일정을 구출. 무결성 및 기능에 대 한 유효성을 검사 하는 일단 약물 치료 연구 등 기능 연구에 대 한 조직 자료를 제공 합니다. 마약 프로 파일링을 응답, 뿐만 아니라 약물 치료 다음과 변경된 대상 식 또한 항 체 유효성 검사를 활용할 수 있습니다. 이것은 특히 관련 마우스 단일 클론 항 체와 murine epitopes의 검출에 대 한 이러한 높은 착 색 배경 제공 하는 경향이입니다. 또한, 잘 검증 된 항 체 진단 및 임상 설정에서 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 달성 해야 합니다. 따라서, 풍부의 변조 또는 조직 조각에 약물 치료에 따라 관련 epitopes의 인 산화 항 체 확인에 편리한 실용적인 응용 프로그램을 제공 합니다. 종양 조각 문화의 주요 이점은 그들에 게 매력적인 비보 전 모델을 시키는 종양 또는 stromal 세포 종양 신호 활동 또는 약물 응답을 포함 하 여 모델 공간 분산 기능을 기능입니다. 그러나, 재배, 동안 조각을 회전 하 고 경작 과정 더 가장자리에 특히 조직 손상 될 수 있습니다. 그것은 따라서 도전 층 정확 하 게 0 h 조각의 biomarker 스테인드 IHC 이미지 괴 영역 교양된 조각에서 발견는 정확 하 게 약물 응답 공간 biomarker 활동을 연결 하는 기능을 타협. 또한, 종양 내장, 문화 유도 및 약물 유발 괴 응답은 하지 구별할 수 적어도 공간 약물 응답의 정확한 정량 타협 murine NSCLC 조직 조각. 마지막으로, 종양 조각 문화를 사용 하 여 테스트 연구원 여러 화합물에 허용 치료 동물, 따라서 정제, 감소, 및 실험실 동물에 실험을 대체 하는 필요 없이 동일한 종양 합니다.
미래의 응용 프로그램으로 설명된 프로토콜 임상 고체 종양 샘플을 채택 될 수 있다. 또한 조직 유형-종속 수정 또는 최적화 가능성이 필요한 종양 텍스처 또는 강성에 대 한 이러한 최적화를 슬라이스 두께 및 진동 속도 포함 한 vibratome 설정을 조정 시작 있습니다. 또한, 영양소와 성장 인자 요구는 다른 종양 조직에 대 한 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 유 방 암 조각 인슐린 중간13,18에 보충으로 경작 되어 있다. 제한 된 조직 소재 수술 또는 생 검 동안 얻은 것입니다, 그 종양 환자에서 파생 된 조각 문화의 최적화 복제 샘플의 충분 한 숫자를 얻기에 있는 어려움 때문에 전하실 수 있습니다. 또한, 데이터 재현성 또한이 환자 환자 샘플이, 괴 사 성 조직 구성 요소 뿐만 아니라 거리 지역 또는 stromal 침투 대 종양 세포의 비율에서 특히 발음에 의해 도전입니다. 마지막으로, 종양 조각 진단 설정에서의 응용 범위는 마약을 전처리 biopsies의 슬라이스 explants 응답 post-treatment에 vivo에서 응답을 일치의 조사를 요구할 것입니다.

단단한 종양 조직, 폐암을 포함 한 유전 그리고 phenotypic이 전시 및 항구의 복잡 한 microenvironments1,2. 종양 세포와 약물 및 저항 메커니즘3에 그들의 주변 microenvironment 영향 사이 상호 작용. 이 전 임상 모델을 정확 하 게 모델 수 생물학적 복잡성 및 네이티브 종양에 행동 하는 기능에 대 한 필요성을 강조 한다. 정밀 컷 슬라이스 즉시 신선한 종양에서 파생 된 대표 비보 생물학, 적어도 시간, 공간적으로 개별 종양에서 배포 하는 고기를 포함 하 여의 짧은 창 주 능력가지고 고유 자원의 제공 한다. 절제 임상 종양 암 환자에 게 서 얻을 수 있는 몇 가지 개인된 표본 중 하나 이며 그들의 진단 사용 가치가 감시.
Organotypic 문화 거슬러초기 19 세기 때 인간 intracranial 종양 했다 손을-조직 조각으로 잘라내기와 소위를 사용 하 여 교양 의 역사 걸려 놓기 방법. 조직 파편은 coverslip에 연결 되었고 heparinized 인간의 플라즈마, 후는 coverslips 반전, 봉인 되었고 몇 주4에 대 한 교양에 수 있습니다. 수동으로 종양 조각부터 플라즈마 병5, 액체6와 같은 다양 한 다른 메서드를 사용 하 여 양식 또는 0.45 μ m에 기 공 크기 필터6컷. 기간 "organotypic" 병아리 태아 눈7의 망막 차별화에 관한 연구에서 1954 년에 처음 사용 되었다. 이것은 폐와 심장 조직 explants 병아리 태아8및9성인 쥐 뇌 explants에서 파생 된을 사용 하는 연구에 선행 되었다.
다양 한 조각화 방법 설명, 즉 수동 헬기10,11, Krumdieck 조직 절단기12,13및 vibratomes11,,1415, 되었습니다. 16. Krumdieck 조직 슬라이서는 톰을 사용 하 여 원형 휴지 조각으로 썬 다음 원통형 조직 코어를 생성 합니다. Vibratome, 다른 한편으로, 진동 블레이드 톰을 사용합니다. 간 분할 영역에 대 한 연구에서 그것은 Leica vibratome Krumdieck 슬라이서15에 비해 더 재현 하 고 일관 된 분할 영역 생성을 표시 했다. 슬라이스 두께 250에서 500 µ m에 이르기까지 사용 되었습니다, 그리고 연구는 16 일14,10,,1718까지 생존 기능과 형태학의 유지 보수를 보고. 그러나, 종양 변수 신진 대사 프로필 영양소 요구 사항에 영향을 미칠 수 있습니다. 있고 조직 강성 매트릭스 구성 등 폭 기 및 영양소의 흐름에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 각 조직 유형에 자국과 문화 조건의 최적화 해야 가능성이 높습니다.
다른 경작 방법 슬라이스 문화를 지원 하기 위해 사용 되었습니다: 나) 고정 interphase 문화, 라고도 정체 지원 문화, 조각 반 다공성 막 삽입 문화 매체에 위에 배치 됩니다. 이 조각의 상단은 공기에 노출 되는, 하단의 다공성 삽입14,19;를 통해 영양분을 보충 하는 동안 ii) 흙 메서드는 원래 문화 전체 기관 또는 배아 조직 조각을 개발. 이 조각 목화 시트 또는 금속 그리드에서 지 원하는 필터 위에 배치 하 고 필터 문화 매체에 배어. 조직 촉촉한 유지, 매체의 얇은 층은 조각20,,2122위에 추가 됩니다. 이러한 처음 두는 소위 공기 액체 interphase 문화; 3) 롤러 튜브 문화, 조각, 매체를 포함 하는 플라스틱 튜브의 편평한 측 내부 배치 및 느린 튜브 회전 하면 조직 한 사이클의 첫 번째 부분 중 중간 덮여 또는 두 번째23; 중 화난 4) 외피 단위, 어떤 슬라이스는 간헐적으로 노출 보통 영양분과 통 기 통풍으로 회전 합니다. 다른 롤러 튜브,이 방법 슬라이스 배양246 잘 플레이트에 배치 하는 다공성 티타늄 격자 위에 배치 됩니다.
조직 조각 논리적으로 현재 절제 단단한 종양에서 파생 된 항 암 제의 치료 응답을 테스트 하는 매력적인 ex vivo 모델 그들은 생존 능력의 평가 허용, 통로, 활동과 분자 프로 파일 대상 기본 종양 microenvironment의 특정 종양. 그러나, 여부를 평가 마약 종양 조각에서 측정은 제자리에 응답의 예언, 그것은 어떤 정도 조직 조각을 보존 등 세포 증식, 종양 관련 생물 학적 기능을 평가 하는 것이 중요 histopathology 특정 세포 분화 또는 종양 신호 활동. 조각 준비, 슬라이스 처리, 또는 문화 유도 adaptions 품질 및 조직 조각의 생물학 기능에 동안 elicited 기계적 스트레스의 영향은 근본적인 질문, 종양에서 파생 된 구현 하는 기능을 긴밀 하 게 연결 기능 진단에 대 한 조각입니다.
우리의 IMI 투자 컨소시엄 프로젝트 PREDECT (http://www.predect.eu) 설정 합니다 체계적으로 주소를 근본적인 질문, 다양 한 소스에서에서 슬라이스 explants 공부 하 여. 유 방, 전립선, 폐 암 모델에서 파생 된 분할 영역을 사용 하 여,이 공동 노력 활용 양적 되며 오신 (H & E)-기반 정보 대기 산소와 정체 필터에 대 한 요구 사항을 설명 하 고 질적 지요 72 h까지 교양된 조각의 생존 능력을 유지 하기 위해 지원 합니다. 또한, 교양 슬라이스에 immunohistochemistry (IHC) 분석 밝혀 내-슬라이스 생존 그라디언트, 괴 그라디언트 murine 비 작은 세포 폐암 (NSCLC), 에스트로겐 수용 체 (ER), HIF1α에서에서 파생 된 조각에서으로 입증 및 γH2AX 유 방 암 조각, 그라디언트 또는 안 드로 겐 수용 체 (아칸소 주) 식 그라디언트 전립선 암 조각25에. 흥미롭게도, murine NSCLC의 24 시간 문화에 내부 슬라이스 생존 그라디언트 회전 외피 단위에 경작에 의해 구출 되었다 그리고 우리의 최근 학문 보여주었다 생존 72 h26에 확장 되었다. 특히 위쪽 남아 가장 가능한26, 지지 하는 조각에 약 응답 분석 조직의이 측면에 밖으로 잘 수행 됩니다.
어떻게 질문까지 남아 비록 조직 조각 종양 기능 제자리에 정리 수 있습니다, 그리고 그들은 광범위 하 게 항 암 에이전트, 단일 클론 항 체 타겟 약과 화학요법 대리인 를 포함 하 여 응답을 테스트 하는 데 사용 되었습니다. 10,11,,1314,,1827. 우리는 최근에 murine NSCLC 슬라이스 확산에 동적인 변화 표시 및 종양 신호 활동 재배 갓 0 h 절단에 비해 다음 조각26을 보여주었다. 이 타겟 위치에 생물 학적 기능 이전에 섭 동 연구 재배 중 적절 하 게 보존 여부를 조사 하는 것이 중요 하는 것을 나타냅니다. 이러한 결과도 불구 하 고 우리는 종양 조각 표적으로 한 치료, 약물 치료 유지 속에 공간 응답을 모델링할 수 있습니다 보였다 (24 시간) 브리핑 및26경작의 발병에서 시작 됩니다. 다음 프로토콜 설립 및 약리 마약 검사에서 그들의 응용 전에 종양 조각 문화의 분석에 관련 된 중요 한 유효성 검사 측면을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic 기본 조직 explant 문화, 정밀 컷 슬라이스를 포함 하는 기본 조직의 다세포 상호 작용 뿐만 아니라 3 차원 (3 차원) 조직 아키텍처를 나타냅니다. 바로 갓 절제 종양에서 잘라 조직 조각 intratumor이, 그들에 게 비보에 생물학의 유용한 대리 모 알선 함으로써의 공간 측면 유지 합니다. 주의 조직 슬라이스 준비와 재배 조건 최적화는 기본 종양의 진단 예측 가능성에 대 한 슬라이스 explants. 이와 관련, murine 모델은 복제와 재현 실험을 수행 하기 위해 종양 자료의 일관 된 흐름을 제공 하는 이러한 가치. 이 프로토콜 murine 폐 종양 파생 조직 조각 회전 외피 단위, 산소와 영양분을 조직의 간헐적인 노출 수 있도록 시스템을 사용 하 여 경작을 설명 합니다. 우리의 이전 작품 외피 단위 회전의 사용 특히 조각 떠 다른 문화 방법에 비해 조직의 생존 능력 향상과 정체 필터 지원 보여주었다. 자, 우리 더 슬라이스 두께 영향 가능성 보여 교양 조각, 슬라이스 두께의 그 최적화를 제안 할 수 다른 조직 종류에 대 한. ITH 관련 종양 기능 활동, stromal 세포 침투 식이나 분화 마커의 신호에 인접 한 조직 조각 마커 약물 치료에 의해 변경의 표현에 대 한 평가 필요로 발음 또는 자체 재배입니다. 요약 하자면,이 프로토콜 회전 외피 단위에 murine 폐 종양 조각 생성 및 그들의 문화를 설명 하 고 어떻게 조각 해야 체계적으로 분석 전제 조건으로 다른 유형의 조직 마커, 표현에 대 한 설명 이전에 약물 반응 연구.

그림 1 세대, 재배 및 정밀 컷 조직 조각 murine NSCLC 종양에서 파생 된의 분석에 대 한 워크플로 나타냅니다. 이 데모에 대 한 활용 하는 조건부의 활성화 KraG12D Lkb1 (라고 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 11)의 손실 함께 라는 은닉 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM)에서 종양 KL 기. 마우스 사육 및 폐 종양 개시26,28에 설명 된 대로 수행 되었다. 그림 2A 조각 회전 외피 단위를 사용 하 여 24 시간에 대 한 교양된의 생존 능력에 조직 슬라이스 두께의 효과 보여 줍니다. 결과 160 µ m 얇게는 조각에 걸쳐 큰 괴 사 성 영역을 포함 하는 보여준다. 또한, 250 µ m 얇게 표시는 괴 그라데이션 200 µ m 얇은 조각에 비해 조각에서. 그것은 얇은 160 µ m의 불 쌍 한 전반적인 생존 능력이 취약 하 고 곱슬 곱슬 하는 경향이, 격자 위에 조각의 위치 하는 동안 기술적인 처리에 의해 발생. 다른 한편으로, 조각이 너무 두께, 그들은 조각에 걸쳐 산소 또는 영양 보급에 부족 하는 경향이 될 수 있습니다 때는 murine NSCLC explants 회 저 성 죽음 그라데이션25로 입증 됩니다. 그러나, 슬라이스 두께와 동일한 vibratome 설정의 사용에도 불구 하 고 한 종양에서 생성 될 수 있습니다 주목 해야한다. 그것은 따라서 다른 종양 샘플에서 여러 복제를 분석 하는 것이 좋습니다. 중요 한 것은, 조직 유형별 조직 질감과 경도 수에 영향을 미칠 산소와 영양소 흐름 슬라이스 두께 최적화를, 최대 생존 능력을 달성 하기 위해 필요 합니다. 그림 2B - 설명 NKX2-1 식의 양적 IHC 분석, 샘플에 잘 차별화 된 폐 선 암 (AC)의 표식 최대 72 h 재배와 일치 하는 0 h 조각. 결과는 NKX2-1 식 0 h 미 조각, 제안 하는 재배 과정 공공연히 미치지 않습니다 AC 종양 조직의 분화 상태에 비해 교양된 조각에서 크게 변경 되지는 표시 됩니다. 그림 2D 대상된 약물의 효과 평가 하기 위한 종양 조직 조각의 유틸리티를 보여 줍니다. 최근 살펴보았습니다 Kra 돌연변이 murine ACs 전시 높은 식 phosphorylated ERK1/2의 (MAPK 통로 활동 증가 표시) adenosquamous (ASC) 종양, (표시 mTOR 활동 phosphorylated 4EBP1의 식 동안에 비교 될 때 ) AC와 ASC 종양에 유사 하 게 표현 된다. 이 경로 조직 조각에 효과적으로 타겟팅 할 수 있습니다 하는 경우를 테스트 하려면 KL AC 조직 조각 DMSO로 치료 했다 또는 화합물, 즉 0.1-1의 금액을 적정 대상 mTOR 통로 또는 0.05-0.5 µ M dactolisib µ M selumetinib MAPK 통로 대상. 결과 표시 1 µ M dactolisib 또는 selumetinib의 0.5 µ M 각각 4EBP1 또는 ERK1/2의 인 산화를 억제에 효과적입니다. 또한, 대상된 phosphoproteins의 복용량 의존 저해 조직 조각 인 산화 특정 항 체를 확인 하기 위해 또한 이용 될 수 있다 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> 그림 1: 설립 및 분석 murine NSCLC 종양 파생 슬라이스 explants의 워크플로의 도식 대표. 수집 및 조각화에 대 한 종양 베어링 폐의 준비를 설명 하는 (A) 회로도 마우스에서 폐 엽 수확 하 고 종양 조직을 정상 조직에서 해 부. 블랙 헤드와 별표 나타냅니다 약 4 m m와 1 m m 종양, 각각. 흰색 화살표는 폐 조직을 표본 소유자의 표면에 붙어 나타냅니다. 정상적인 폐의 추가 부분에서 빨간 화살표 포인트 유지 직 립 위치에 종양 조직을 지원 합니다. (B) Vibratome 자국과 조직 조각의 컬렉션. 흰색 화살표는 조각화 방향을 나타냅니다. 차가운 HBSS + P/s.를 포함 하는 24-잘 접시에 순차 조각의 컬렉션 조각이 다른 시간 포인트 (여기, 24-72 h) 재배 (맨 윗줄) 동안 종양 관련 마커 식 평가 대 한 교양 수 또는 약물 치료를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. C: 차량 제어, t: 약물 치료입니다. (C) 회전 부 화 단위를 사용 하 여 재배에 대 한 조직 슬라이스를 배치. 일부 매체는 격자의 상단 커버를 6 잘 플레이트를 기울기, 매체, 위에 그리드 중간 조직 조각 놓고 집게를 사용 하 여 슬라이스를 확산 합니다. 6 잘 플레이트 부드러운 회전 사이클에 대 한 균형 무게 인지 확인 합니다. X: 나타냅니다 잘못 된, 그리고 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: 분할의 정확한 위치를 나타냅니다. (D) 종양 조각의 FFPE 블록의 사진. 파라핀 끼워 넣어진 조직 조각 되며 물에서 화살표 포인트 블랙. (E) 회로도 FFPE 블록; 조각의 단면 순서를 보여주는 이 섹션은 조직 생존 능력 및 종양 관련 바이오 마커 식 평가를 처리할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> 그림 2: 생존 능력 및 histotype 전용 마커 식, 그리고 NSCLC 조직 조각에 대상된 약물 치료의 평가. 24 h. 200 µ m 얇은 조각에 대 한 양식 표시 두께의 AC NSCLC 조각의 이미지 (A) 대표 H & E 160 µ m 또는 250 µ m 얇은 조각에 비해 더 나은 생존을 유지. 진한 파란색 H & E 가능한 조직, 스테인드 나타내고 핑크 pseudocolored 괴 영역을 나타냅니다. 하늘색 가난한 조직 품질 또는 섬유질 stroma의 존재 중 하나는 분석에서 제외 하는 영역을 나타냅니다. T1 및 T2 두 개의 다른 종양에서 파생 된 생물 복제를 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 µ m. (B) 대표 IHC 이미지 표시 시간 포인트에 대 한 교양 AC 조각에 NKX2-1 식의. 화살표는 더 높은 확대에 표시 된 영역을 나타냅니다. 결과 0 h 조각에 비해 교양 조각에서 NKX2-1 식은 수정 되지 않습니다 보여 줍니다. 눈금 막대 = 500 µ m, 50 µ m 낮은 배율에 대 한 각각. (C) (B)에 표시 된 데이터의 정량화. (D) 대표 IHC 이미지 phosphorylated 4EBP1 또는 pERK1/2 식을 0 h에서의 조각, 또는 조각 DMSO로 치료 적정 양의 dactolisib (dact, 맨 위 행) 또는 pERK1/2 식을 0 h 슬라이스나 슬라이스 DMSO로 치료에 phosphorylated 또는 selumetinib (sel, 맨 아래 행)입니다. 검은 사각형 상자 높은 확대에 표시 하는 영역을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m m 또는 낮은 또는 높은 확대에 대 한 50 µ m 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

우리는 생성, 재배 및 organotypic 조각 murine 폐 종양에서 파생 된의 체계적인 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다. 우리는 또한 슬라이스 두께 대 한 최적화 하는 방법과 종양 조각 치료 약물 농도 선택 하는 방법을 설명 합니다.

설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

이 방법은 종양 슬라이스 각질에 있는 약 반응 연구 결과가 진단 목적을 봉사할 수 있는 전임상 연구에서 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 슬라이스 이출이 공간적으로 분산된 기능을 포함하여 네이티브 조직의 복잡한 생물학을 짧은 시간 동안 모델링할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 뮤린 폐 종양에서 슬라이스의 사용에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 인간의 조직을 포함한 다른 조직 유형에 적용 될 수있다.시작하려면 진동을 준비하고 설명서에 제공된 지침에 따라 VibraCheck를 수행합니다. 그런 다음 페니실린과 연쇄상 구균으로 보충한 행크의 균형 잡힌 소금 용액 1밀리리터로 24웰 플레이트의 각 우물을 채우고 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 가슴이 노출되고 동물이 뻗어 있도록 스티로폼 뚜껑에 놓인 안락사 마우스의 네 발에 25 게이지 바늘을 삽입합니다.노출된 피부 표면에 70%의 알코올을 분사합니다. 각진 자세에 놓인 가위를 사용하여 복부에서 가슴과 목 부위까지 피부를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 양쪽에 피부를 스트레칭하고 25 게이지 바늘을 삽입합니다.복부 영역을 열어 잘라. 그런 다음 갈비뼈와 다이어프램을 열어 폐와 심장을 노출시합니다. 주변 조직을 절단하여 기관체를 노출합니다.폐를 심장과 함께 해부합니다. 페틀-스트렙이 얼음 위에 올려놓은 얼음 차가운 HBSS 30밀리리터를 함유한 50밀리리터 튜브에 티슈를 넣고 가능한 한 빨리 다음 단계로 진행합니다. 이제 종양 베어링 폐를 10센티미터 조직 배양 판으로 옮기.멸균 가위와 집게를 사용하여 폐 로브를 분리하고 슬라이스를 위해 표면에 종양이 있는 로브를 선택합니다. 종양 조직을 필터 용지에 놓고 정상적인 폐 또는 멸균 메스를 사용하여 종양을 둘러싸는 추가 종양 조직의 일부를 잘라 내어 평평한 조직 조각 표면을 생성합니다. 평평한 면을 청착색으로 찍어 진동시 표본 홀더에 장착하여 종양이 블레이드를 똑바로 세울 수 있도록 2~3분 동안 건조시키십시오.진동 용 표본 홀더를 금속 버퍼 트레이에 넣습니다. 조직이 완충제에 침지될 때까지 펜 스트렙으로 보충된 차가운 HBSS로 트레이를 채웁니다. 완충 트레이에 악기가 제공된 플렉시글라스 뚜껑을 덮고 트레이를 하얀 얼음 욕조에 넣고 얼음을 추가하여 슬라이스 하는 동안 조직을 시원하게 유지합니다.진동기에 하얀 얼음 목욕을 부착합니다. 그런 다음 적절한 슬라이싱 설정을 선택하고 슬라이스를 시작합니다. 진동 블레이드를 슬라이스 위치에 가져와 슬라이스 창을 설정합니다.멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트에 펜 스트렙으로 보충된 HBSS 1밀리리터로 채워진 슬라이스를 수집하고 얼음을 유지합니다. 슬라이스 순서를 추적하는 동안, 실험 계획에 따라 24 웰 플레이트의 각 우물을 표시합니다. 배양된 슬라이스에 인접한 조직 조각을 0시간 또는 배양되지 않은 참조로 수집합니다.조직의 상단, 중앙 및 바닥을 나타내기 위해 적어도 세 개의 참조 조각을 수집합니다. 그리고 슬라이스가 완료되면 고정 및 처리를 계속하십시오. 그 후 티타늄 그리드를 배치하여 양배 배지 2.5 밀리리터를 포함하는 6웰 플레이트를 잘 준비합니다.티타늄 그리드와 매체 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인합니다. 그리드에 슬라이스를 로드하려면 6웰 플레이트를 각진 위치에 유지하여 매체의 일부가 그리드를 덮습니다. 그런 다음 그리드의 매체에 슬라이스를 놓고 집게를 사용하여 확산합니다.슬라이스를 놓은 후 6웰 플레이트를 가습된 인큐베이터 내부에 배치하여 95%02 및 5%CO2로 섭씨 37도유지에 배치된 회전 인큐베이션 장치에 적재합니다. 회전 주기를 시작합니다. 장기 재배를 위해 멸균 집게를 사용하여 조직 조각을 포함하는 그리드를 들어 올리고 6웰 플레이트의 빈 우물에 배치하여 매일 배양 배지를 보충한다.매체의 70%를 신선한 배양 매체로 교체하고 그리드를 다시 배치합니다. 이전과 같이 회전 주기를 계속합니다. 종양 슬라이스에 약물 치료를 위해 6웰 플레이트에 희석 약물 또는 차량 제어와 미디어의 2.5 밀리리터를 추가합니다.티타늄 그리드를 우물에 넣은 다음 조각조각을 이전과 마찬가지로 그리드에 놓습니다. 24 시간 동안 치료를 수행 한 후, 고정 및 처리를 계속합니다. 원하는 슬라이스를 조심스럽게 10센티미터 플레이트에 넣고 2~3밀리리터 PBS로 채워진 적폐종이를 담고 있어 부동하게 한다.그런 다음 필터 용지를 한 쌍의 집게로 들어 올려 히스토 카세트에 놓습니다. 필터 용지를 히스토 카세트로 옮킨다. 후속 단계에 대한 슬라이스의 위치를 표시하기 위해 티슈 슬라이스 위에 희석 된 헤마톡린 한 방울을 추가합니다.카세트를 닫고 4% 중립 버퍼링 된 포르말린 솔루션으로 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤을 둡니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 카세트의 세척 및 처리 후 히스토 카세트를 열고 메스를 사용하여 필터 용지에서 고정 된 조각을 조심스럽게 들어 올립니다. 필터 용지를 버리고 슬라이스를 액체 파라핀이 들어 있는 몰드로 옮겨 넣습니다.평평한 무게를 사용하여 포함 금형의 바닥에 대해 조직을 눌러 균일한 단면도 보장합니다. 히스토 카세트의 하단 부분을 금형 위에 놓습니다. 그 위에 액체 파라핀을 넣습니다.그리고 30 분 동안 차가운 접시에 금형을 식히게하십시오. 그 후 파라핀 블록에서 냉각 된 금형을 분리합니다. 마이크로토메를 사용하여 FFPE 조직 슬라이스 블록의 4마이크로미터 얇은 섹션을 준비합니다.조직을 둘러싼 파라핀의 과잉을 잘라냅니다. 조직 전체에 걸쳐 균일 한 섹션을 얻기 위해 블록의 표면이 블레이드에 대하여 수평 으로 지향되도록 블록의 각도를 조정합니다. 얇은 브러시를 사용하여 유리 슬라이드의 상부에서 시작하여 파라핀 임베디드 조직 슬라이스의 순차적 조직 섹션을 수집합니다.유리 슬라이드의 하단 부분이 그 뒤를 잇고, 중간에 더 깊은 조직 층의 섹션을 계속 수집합니다. 각 조직 슬라이스의 상이한 층에서 물체 슬라이드에 이르는 섹션의 컬렉션은 생존가능성, 세포 이동 또는 바이오마커 발현에서 배양 유도그라데이션의 캡처를 가능하게 한다. 섹션을 수집한 후 프로토콜에 설명된 대로 처리 및 추가 분석을 계속합니다.조직 슬라이스 두께는 배양 된 조각의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 250마이크로미터 두께의 슬라이스는 슬라이스 전반에 걸쳐 산소 나 영양 확산의 결핍이 발생하기 쉽기 때문에 두꺼운 슬라이스로 인해 200 마이크로 미터 두께의 슬라이스에 비해 괴사 그라데이션이 증가합니다. 그러나, 160 마이크로미터 얇은 조각은 아마 이들이 깨지기 쉽고 곱슬 하는 경향이 슬라이스의 위치 지정 하는 동안 기술적 처리에 의해 발생 하는 큰 괴사 영역을 포함.잘 분화된 폐 아데노암종의 마커인 NKX2-1의 분석은 배양된 슬라이스에서 0시간 비배양식 슬라이스에 비해 발현이 크게 변하지 않는다는 것을 보여준다. NKX2-1 발현의 정량적 분석은 발현이 배양된 슬라이스대 배양에서 현저히 변화되지 않았다는 것을 확인했으며, 이는 재배 과정이 아데노암 조직의 분화 상태에 눈에 띄게 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 종양 조직 슬라이스가 표적 약물의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 DMSO 또는 적정량의 화합물로 치료하였다.4EBP1의 mTOR 통로 인산화를 표적으로 하는 1개의 마이크로몰러 dactolisib로 취급될 때 억제되었다. 0.5 마이크로몰라 셀루메티닙은 MAP 키나아제 경로를 표적으로 하는 ERK1/2의 인산화를 억제하는 데 효과적이었다. 이 비디오를 시청한 후에는 귀중한 종양 조직에서 갓 잘라낸 슬라이스를 사용하여 작업하고 비판적으로 분석하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.우리의 이전 postdoc, 카자 나히, 크게 IMI Predect 컨소시엄 조직 슬라이스 플랫폼의 동료와 공동으로이 방법의 설립에 기여.

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Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

18FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...