Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Denne forskning arbeid mottatt økonomisk støtte fra nyskapende medisiner initiativ felles foretak gi avtalen no 115188, Universitetet i Helsinki Doctoral programmet i biomedisin stipend (A.S.N.) og Sigrid Juselius og Orion-Farmos stiftelser (E.W.V.). Vi oppriktig takke våre PREDECT vev slice plattform consortium medlemmer (Taija af Hällström og Siv Knaappila for støtte i å sette opp rotator systemet, og Riku Turkki for støtte med MATLAB analyse. Jouko Siro er takket for å fange figur 1 fotografiene. Vi takker FIMM WebMicroscope laget for skanning histologiske lysbilder, og laboratoriet dyr senter for dyrehold støtte.

Alle mus eksperimenter beskrevet i denne undersøkelsen ble utført ved å følge retningslinjene fra den finske nasjonale styret av dyr eksperimentering og ble godkjent av eksperimentelle dyr Helsingfors universitet og staten provinsielle Kontoret til Sør-Finland (lisens nummer ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. forberedelser før kutting
<ol><li>Holde følgende materialer klar: vibratome prøveholdere, vibratome buffer brett, 10 cm kultur plate, 24-vel plate, 10 mL pipette, pipette gutt, avfall bag, 70% EtOH i en 50 mL tube å desinfisere instrumentene, og vev limet.</li>
	<li>Forberede vibratome: tørke bladholderen med 70% EtOH, fest et nytt blad, og utføre en vibrocheck i henhold til instruksjonene i håndboken (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf). Merk: Det er viktig å utføre vibrocheck-trinnet som minimerer loddrett nedbøyning av bladet og sikrer god kvalitet skiver.</li>
	<li>Fyll hver godt av 24-vel plate med 1 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS) med 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin (HBSS + P/S); holde platen på is.</li>
	<li>Forberede F12 kultur medium med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamax, 22 mM glukose og 10% fosterets bovin serum (FBS). Merk: Svulst skive kultur medium og vekstfaktor kosttilskudd kan variere avhengig av tumor vev25.</li>
	<li>Forbered nødvendig mengde av F12 medium for behandling, bruker samme sammensetning som beskrevet i trinn 1.4, men utelater FBS. Merk: Siden vekstfaktorer i serum kan påvirke kreftfremkallende signalering i kulturperler skiver, serum-free medium anbefales for kortsiktige narkotika forstyrrelsene studier på svulst skiver. Hvis langsiktige skive kulturer er analysert, er det viktig å først vurdere effekten av serum-free medium på vev levedyktighet og svulst-spesifikk markør uttrykk i ubehandlet skive kulturer.</li>
</ol>2. samling av svulst rentebærende lungene
<ol><li>Euthanize en svulst rentebærende mus av cervical forvridning når den viser symptomer på arbeidet puste og tap av kroppsvekt. Merk: CO2-mediert euthanasia er kjent å indusere hypoxic forhold i lungene, som kan ha en effekt på skive levedyktighet eller kreftfremkallende aktiviteter via fremlokkende hypoxic svar.</li>
	<li>Strekke euthanized musen på Styrofoam lokk ved å sette 30 G nåler i alle fire paws, slik at brystet blir utsatt.</li>
	<li>Klipp opp huden fra magen mot brystet, og til nakken regionen. Klipp opp ribbe buret, og deretter membran å avsløre lungene og hjertet. Hold saksen i en vinklet posisjon for å unngå skade på vev.</li>
	<li>Dissekere svulst rentebærende lungene sammen med hjertet og plassere dem i en 50 mL tube inneholder 30 mL av iskalde HBSS + P/S; holde røret iskald og gå videre til neste trinn så raskt som mulig. Merk: Forsinkelser i behandling av lunge svulst kan endre kreftfremkallende funksjoner, for eksempel signalering veien aktiviteter.</li>
</ol>3. generasjon presisjonsstyrte kutte lunge svulst skiver
<ol><li>Overføre svulst rentebærende lungene HBSS + P/S til en 10 cm vev kultur plate holdt inne laminær hette. Skille lunge lobes sterilt saks og tang, og velg lobes med svulster på overflaten til kutting. Merk: Svulster > 3 mm størrelse er egnet for kutting. Siden vanlig lungevev rundt de store svulst kompromissene kutting skyldes forskjeller i vev stivhet, bør tumor vev gjennomgår kutting skilles fra den normale vev, slik at en ryddet svulst region ansikter vibratome bladet.</li>
	<li>Generere en flat vev stykke overflate ved å kutte en del av normal lungevev som omgir svulst med sterilt skalpell og dyppe flat lysbildet i en dråpe cyanoakrylatlim. Montere denne siden på vibratome's prøveholder slik at svulsten ansikter bladet i oppreist stilling. La limet tørt for 2-3 minutter. Merk: Normalt lungevev limt til prøveholderen forstyrrer ikke tumor vev kutting og slicing stoppes før den normalt vev er nådd. Tumor vev bøyer noen ganger på grunn av svampete teksturen av normal lungevev limt til prøveholderen, akkord dens stående. Hvis dette skjer, fest et stykke mer vanlig støtte lungevev ved pre-montert normal lungevev å beholde svulst i oppreist stilling (figur 1A iii).</li>
	<li>Plasser prøveholderen i metall bufferbrettet og fyll den med kaldt HBSS + P/S til vev er nedsenket i bufferen. Plasser metall bufferbrettet på hvit isbadet og legge is for å kjøle vevet mens kutting.</li>
	<li>Fest hvit isbadet til vibratome. Velg egnet utstyr innstillinger: amplituden varierer mellom 2,5-2.8, kutting hastighet mellom 0.10-0.14 ms og kutte tykkelse varierer mellom 160 – 250 µm. Merk: Kutting innstillinger må justeres i henhold til hardheten av vev. Hard vev er lettere å bit enn mykere vev og mykere vev krever kutting med lavere hastighet (0,1-0,12 ms) og høyere amplitude (2.6-2.8). En 4-5 mm store svulst gir vanligvis 15-20 stykker av 200 µM tykkelse. Dyrking av kortsiktige kan murine svulster være skiver under semi sterile forhold utenfor laminær panseret. Men bør klinisk svulster alltid være skiver i en klasse II biosafety laminær hette å unngå eksponering for mulig smittestoffer i menneskelig vev.</li>
	<li>Bruker sterilt tang, samle skiver i 1 mL av HBSS i separate brønner av en 24-vel plate på isen, tett å holde oversikt over bestillingen som skiver er snittet. Merk hver godt av 24-vel plate i henhold til eksperimentelle planen. For eksempel stoffet merke sekvensiell brønner av en 24-vel plate som kultur tidspunkt eller 0 h, kjøretøy kontroll (C), behandlet (T) (figur 1B ii). Merk: Ikke forstyrre eller trekke tumor vev mens samle en skive, som dette vil endre stoffet retningen forhold til vinkelen på bladet, fører til uoverensstemmelser i tykkelser på etterfølgende skiver.</li>
	<li>Når alle sektorer er samlet inn, kan du overføre dem på Titan rutenett (2-3 skiver per rutenett) i en 6-vel plate inneholder 2,5 mL av kultur medium per brønn. Kontroller at ingen luftbobler er dannet mellom Titan rutenettet og medium.<ol>
<li>Å laste en skive til rutenettet, holder 6-vel platen i en vinklet slik at en del av mediet dekker rutenettet og plassere sektoren i medium på nettet; Bruk tang til å spre stykket hvis det krøller. Laste inn 6-vel platene på roterende inkubasjon enheten plassert inne i en fuktet inkubator opprettholdt på 37 ° C med 95% luft og 5% CO2, og start rotasjon syklusen (figur 1 c i-ii). Merk: Metallic rutenett og 6-vel platene må være nøyaktig vekt balanserte før du slår på roterende enheten. Det er viktig å plassere skiver i rutenettet slik at de fullt vekselvis luft og væske faser under rotasjon sykluser. Skiver som plasseres for lav eller høy vises ikke riktig oksygen eller næringsstoffer (figur 1 c jeg), som kan skade vev levedyktighet. Det er viktig å følge plasseringen av sektoren på risten under dyrking som sektoren kan noen ganger skyve ned. Hvis dette skjer innen 1-2 h kultur utbruddet, korrigere sin posisjon og notere at denne prøven kan være skadet. Skiver som er plassert feil i lengre tid skal kasseres, som vev levedyktighet er betydelig påvirket av uriktig oksygenering og næringsstoffer levering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Samle en vev slice tilstøtende i kulturperler sektorene som en 0 h, uncultured, referanse. Samle minst tre referanse skiver representerer toppen, midten og sentrum av vev blir skiver. Fastsette 0t skiver umiddelbart og prosess som beskrevet i 5.1. Merk: Hvis antall sektorer er begrenset, f.ekshvis flere sammensatte behandlinger eller teknisk gjentak er gjort, sammenligninger av hver behandlet prøve med den nærliggende 0t prøven kan være vanskelig. I slike tilfeller bruker du nærmeste 0t sektoren (minst 400-600 µm fra hverandre) å vurdere relativ vev levedyktighet eller uttrykk for relevante indikatorer ved kultur utbruddet.</li>
	<li>Dyrking av langsiktig fylle kultur medium hver dag. Løft rutenettet som inneholder vev skiver med sterilt tang, og plasserer den i en tom godt av 6-vel plate; erstatte 70% av mediet med fersk kultur medium, og plasser rutenettet i mediet. Fortsette rotasjon syklusen som forklart i trinn 3.6.</li>
</ol>4. behandling av svulst skiver med lite molekyl Inhibitors
<ol><li>Forbered nødvendig konsentrasjonen av forbindelser i behandling medium. Vanligvis er en 10 ganger høyere narkotika konsentrasjon i forhold til IC50s målt i cellekulturer nødvendig for å oppnå målet hemming i vev skiver. For å unngå uspesifikke cytotoksisitet, kan du teste et område for å få minimalt effektiv konsentrasjon for hver sammensatte. Her vi testet 0,1 til 1 µM PI3K/mTOR hemmer dactolisib og 0,05-0,5 µM av MEK hemmer selumetinib på murine NSCLC skiver.</li>
	<li>Legge til 2,5 mL av media med fortynnet stoffet eller DMSO eller andre kjøretøy kontroll inn i 6-vel plate. Plass Titan rutenettene i brønnene.</li>
	<li>Plass vev skiver på rutenettet som beskrevet i trinn 3.6.</li>
	<li>Utføre kjøretøy eller narkotika behandlinger for 24 h. Fortsett med vev fiksering og behandling sektorene i parafin blokker som beskrevet i seksjon 5. Merk: Varigheten av behandlingsapparatet kan optimaliseres avhengig av målet med forsøket, hensyntatt vev skiver evnen til å beholde i situ vev funksjoner analysert i kultur perioden.</li>
</ol>5. fiksering og behandling av vev skiver
<ol><li>Nøye løft uncultured 0t referanse eller kulturperler stykke på et filter papir dynket i PBS.<ol>
<li>Vil legge til 2-3 mL PBS i en 10 cm plate, la skive flyter i PBS og "fisk" det ved å løfte sektoren på filter papir med en tang.</li>
		<li>Overføre filter papir til en histocassette, og legge en dråpe fortynnet hematoxylin (1:1 i deionisert vann) på vev slice synlig merke plasseringen av skive under påfølgende behandlingstrinnene (figur 1 d).</li>
		<li>Lukk kassetten og overføre den til 4% nøytral bufrede formalin løsning. Fastsette vev over natten på 4 ° C. Merk: Mens plassere stykket over filter papir, kontroller at den øverste delen av stykket er vendt oppover; Dette er nødvendig å følge toppen, midten og nederst på en skive under snitting og analyse som beskrevet i trinn 6.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neste dag, overføre kassettene til 70% EtOH, og gå rett til parafin-innebygging vev behandling trinn.</li>
	<li>Før vev behandling, vask histocasettes 100% EtOH 2 x i 10 min. I dette tilfellet bruk en mikrobølgeovn stasjon i vev behandling. Velg programmet brukte for 1 mm vev tykkelse og følg instruksjonene i håndboken (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf). Merk: Når du bruker andre vev behandling maskiner, bruk programmet egnet for tynne vevsprøver.</li>
	<li>For innebygging av parafin, åpne en histocassette og bruke en skalpell for å løfte forsiktig stykket fra filter papir. Forkaste filter papir, og Overfør sektoren i mold som inneholder flytende parafin.<ol>
<li>Trykk vevet mot bunnen av innebygging mold, med en flat vekt, å sikre selv snitting. Plasser nederst på histocasette på toppen av mold, la mold avkjøles på en kald hode i 30 min, og skille mold fra parafin blokken. Merk: Som et alternativ til vannrett innebygging, er det mulig å bygge inn svulst skive vertikalt ved å plassere sektoren i oppreist stilling. Loddrette områder tillater lett analyse av graderinger i levedyktighet eller funksjonelle markør uttrykk på en enkelt avsnitt 25. Gradient analyse med vannrett-embedded skiver krever parafin snitting som beskrevet i trinn 6.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. behandling og analyse av Formalin-fast og parafin-embedded (FFPE) vev
<ol><li>Forberede 4 µm tynne snitt av FFPE vev slice blokker bruker en mikrotom. Ved snitting, justere vinkelen på blokken slik at overflaten av blokk orienteres vannrett med hensyn til bladet; Dette er nødvendig for å oppnå selv kapitler i vevet.</li>
	<li>For å aktivere opptak av potensielle kultur-indusert levedyktighet gradering, celle migrasjon over skiver, eller graderinger i biomarkør uttrykk over kulturperler skiver, samle deler fra toppen, midten og bunnen lag av vev slice på objektet lysbilder som beskrevet nedenfor.</li>
	<li>Samle sekvensiell vev deler av parafin-embedded vev slice først på den øvre delen av glass lysbilder. Fortsett å samle delene av de dypere vev lag til midten etterfulgt av nederst på glass lysbilder (figur 1E). Merk: For å imøtekomme tre deler på et glass lysbilde, klippe bort overflødig av parafin rundt innebygde vev slice.</li>
	<li>Tillate delene til tørr overnatting på 37 ° C, og fortsette med H & E flekker eller immunohistochemistry som beskrevet nedenfor. Merk: Tap av antigenicity kan oppstå når FFPE seksjonene lagres ved høye temperaturer eller for lengre perioder. Parafinsnitt anbefales å bli lagret ved 4 ° C, og IHC analyser skal utføres innen 6 måneder etter snitting.<ol>
<li>H & E flekker, deparaffinize og rehydrate parafinsnitt som følger: xylen 3 x for 5 min., 100% EtOH 3 x for 1 min, 96% EtOH 2 x for 1 min, 70% EtOH 1 x 1min, og deionisert vann 2 x for 1 min.</li>
		<li>Inkuber delene i fersk filtrerte hematoxylin løsning for 10 min og vaskes under rennende vann fra springen i 5 min. dukkert delene i syre alkohol (1% HCl i 70% EtOH) for 2 ganger og vask under rennende vann fra springen i 5 min etterfulgt av inkubasjon med 0,5% eosin for 2 m i.</li>
		<li>Etter eosin trinn, mister delene fordyper lysbildene i alkohol og xylen løsninger, som følger: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x for 30 s, xylen 3 x for 1 min. Endelig bygge delene i en xylen-baserte montering medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analyse av vev levedyktighet og biomarkør uttrykk
<ol><li>Få høy resolution profilen ved å generere hele lysbildet skanninger av H & E-farget lysbilder ved hjelp av en skanner. For å vurdere vev levedyktighet, ta bilde fra vev skanner representerer delene øverst, midten og nederst på sektorene.<ol>
<li>Bruker Foto manipulator programvare, manuelt trekke masker på nekrotisk områder av vev, etterfulgt av kvantifisering av nekrotisk regioner med MATLAB.</li>
		<li>Beregne relative levedyktigheten til skiver dyrkes for forskjellige tidspunkt i forhold til nærmeste 0t sektoren som gjort i våre tidligere studie (Närhi et al., Figur S2B og C)26. Tilsvarende vurdere potensielle intra-skive levedyktighet forløpninger ved å kvantifisere levedyktighet i delen øverst, midten og nederst i en kultivert skive, og beregne relative levedyktigheten til hver del til sin nærmeste 0t stykke. Merk: Mens bare dyrking av murine NSCLC skiver induserer nekrotisk celledød, biologiske Svar å ex vivo oppdrettsforholdene varierer avhengig av tumor vev. For eksempel ble graderinger i HIF1α, ER og makrofager preget av F4/80 oppdaget i filter-støttet stykke kulturer stammer fra en bryst kreft modell25. Derfor må H & E - samt IHC-baserte analyser av kultivert skiver vurderes for hver vev.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utfør IHC delene parafin. Følgende IHC protokollen er et utgangspunkt, og krever ytterligere optimalisering for andre antistoffer. Kort, deparaffinize og rehydrate parafinsnitt som følger: xylen 3 x for 5 min., 100% EtOH 3 x for 1 min, 96% EtOH 2 x for 1 min, 70% EtoH 1 x 1 min og deionisert vann 2 x for 1 min.<ol>
<li>Utsette antigenic epitopes, utføre varme-mediert antigen henting med 10 mM sitronsyre ved pH 6 i en PT modul, etterfulgt av blokkering med 1% Bovine Serum Albumin (BSA) og 10% Normal geit Serum (NGS) i 1 x PBS i 30 min ved omgivelsestemperatur (21-23 ° C).</li>
		<li>Inkuber primære antistoffer fortynnet i BSA på 1% og 5% NGS i 1 x PBS, enten for 1-2 h ved omgivelsestemperatur. Inkuber med anti-kanin sekundære antistoff, i 30 min ved omgivelsestemperatur, etterfulgt av oppdagelsen med 3, 3-Diaminobenzidine (DAB).</li>
		<li>Delene er counterstained med hematoxylin (utvannet til 1:10 i deionisert vann) for 30 s og vask under vann i 5 min, etterfulgt av dehydrering ved immersing lysbildene i alkohol og xylen løsninger, som følger: 70% EtOH 1 x 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xylen 3 x ( 1 min hvert trinn). Endelig bygge delene i en xylen-baserte montering medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Få hele lysbildet søk på IHC-farget lysbilder, eksportere dem som TIFF-bilder i forstørrelse forholdet 1:4 bruke Hjelp en bildeviser og utføre quantifications med ImageJ. Merk: som et alternativ til skanneren, mikroskopiske bilder med 20 X eller 40 X forstørrelse kan erverves for quantifications. Bildeforstørrelse kan velges avhengig av merket til kvantifiseres; forstørring bilder anbefales for kjernefysisk flekker, mens cytoplasmatiske eller membran markører kan kvantifiseres 20 X bilder.<ol>
<li>For kvantifisering av kjernefysiske markører, i dette tilfellet NKX2-1 uttrykk, konvertere hvert bilde til 16-biters bilder ved hjelp av Fiji-ImageJ, og laste opp bilder for bildeanalyser.</li>
		<li>Tilpasse bildet analyse rørledningen avhengig av analysen. I denne protokollen, bruker følgende rørledningen for kvantifisering av NKX2-1 positiv kjerner: identifisere primære objektene | Måle objektet intensitet | Filtrere objekter (minimal verdi = 0.0025) | Beregne Math. Resultatene vises som prosenter av DAB-farget kjerner i antall kjerner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Ulike komplekse i vitro svulst modeller, inkludert 3D kulturer og organoids, har blitt utviklet for å recapitulate arkitekturen og kreftfremkallende funksjoner i vivo tumor vev29,30. Etablering av 3D kulturer eller organoids innebærer imidlertid vev dissosiasjon og selektiv vekst av en enkelt celle type eller co kultur en velge få celletyper i et kunstig miljø. Som en konsekvens, fange slike modeller ufullstendig intricacies av svulst heterogenitet og svulst-stroma interaksjoner. Organotypic tumor skiver, derimot, opprettholder vev arkitektur og biologiske kompleksiteten i situ -svulsten uten omfattende manipulasjon. Denne evnen av vev skiver modell tumor celler i deres innfødt microenvironment gjengir dem spesielt attraktivt for prekliniske studier. Vi har tidligere rapportert en optimalisert arbeidsflyt for etablering og analyse av presisjonsstyrte kutte svulst skiver, og viste at, sammenlignet med filtrere støtter, en roterende inkubasjon enhet forbedre levedyktigheten til kortsiktige murine NSCLC skive kulturer25 , 31. men dyrking på roterende enheter er teknisk utfordrende og krever konstant overvåking. Her presenterer vi en protokoll for tumor vev slice generasjon og praktisk bruk av en roterende inkubasjon enhet for å kultur dem, samt medfølgende metoder for å overvåke evne til skiver for å fange i situ svulst biologi, en forutsetning før narkotika respons testing.
Flere kritiske trinn i protokollen sikre vev integritet og levedyktigheten til tumor skiver. Hvis normale lungevev omgir svulsten, kan vibratome generere skiver med inkonsekvente tykkelse eller skade sektorene, på grunn av forskjeller i tekstur og stivhet mellom normal og tumor vev. Det er derfor viktig å fjerne omkringliggende normal lungevev før svulsten kutting. Et annet viktig skritt er slicing tykkelsen, som skal være nøye optimalisert for hver vev. Videre, når skiver, er det kritisk at stykket er plassert ca midt i rutenettet for å sikre nøyaktig intermitterende dyppe i kultur medium og oksygen eksponering. Endelig er det viktig å følge plasseringen av et stykke i sin rotasjon perioden som en skive kan falle ned i til medium; Hvis dette skjer, kan ytterligere handlinger tas som forklart i trinn 3.6 i protokollen.
I tillegg til vev håndtering for å sikre integritet, er det også avgjørende skritt i IHC analyse å tolke hvordan stykket ligner den opprinnelige vev. Vår forrige studie viste at murine NSCLC svulster ha uttalt intra-svulst romlige heterogenitet i kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter26. Dette betyr at bruken av romlig forskjellige vev skiver for kontroller eller narkotika-behandlet prøver kan påvirke pålitelig prøvedata tolkning, og derfor tett tilstøtende stykker bør brukes som kontroller og test prøver. Vi ytterligere viste at mens spredning eller kreftfremkallende fosfoprotein som uttrykk i fersk kuttet uncultured 0t skiver var lik i situ svulster, kultivert skiver viste endret kreftfremkallende fosfoprotein som uttrykk, spesielt endret p4EBP1 og pSRC, samt endret spredning analysert av Ki67 IHC. Endret p4EBP1 uttrykk var tilsvarende funnet i 24 menneskelige NSCLC og prostatakreft skjær kulturer (Narhi et al., utfyllende figur S3B-S3C, S5 og S7)26. Disse funnene støtter at sammenligning av kultivert skiver med sine nærmeste 0t uncultured skive er kritisk å vurdere bevaring av i situ svulst funksjoner i kulturperler skiver.
Til tross for bedre levedyktigheten til organotypic skiver25, finnes det begrensninger med rotator systemet i form av formalitetene. Plassere vev skiver på Titan rutenett er mer utfordrende enn for å filtrere setter og en roterende inkubasjon enhet ikke er tilgjengelig. Stillestående filteret støtter kan brukes som et alternativ, men i så fall bare luft-utsatt siden av skiver bør bli analysert, som luft-til-filter graderinger i levedyktighet og hypoksi målt ved HIF1α uttrykk dannes raskt i filter-støttet stykke kulturer (Davies et al., figur 5 og finne 7A-7B)25. Vi har videre vist at svulsten skive kulturer kan ha endret spredning og kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter forhold til deres opprinnelige svulster26, muligens på grunn av sårhelende svar eller metabolske tilpasning sektorene å ex vivo kultur32. Selv om brutto morfologiske funksjoner i murine NSCLC svulstene ble opprettholdt i 72 h dyrking, kan kultur-indusert proliferativ endringer påvirke nøyaktig gradering dyrket sektorene. Dermed bør vev skiver bare brukes for kortsiktige funksjonelle studier.
Bruk av en roterende inkubasjon redder minst delvis intra-skive levedyktighet eller biomarkør uttrykk graderinger, spesielt i de første 24 timer av kultur. Når godkjent for integritet og funksjon, gir dette vev materiale for funksjonell studier, som narkotika behandlingsstudier. I tillegg til stoffet svar profilering, kan endret måluttrykk etter behandling også dra antistoff validering. Dette er spesielt relevant for påvisning av murine epitopes med musen monoklonale antistoffer, som dette pleier å gi høy flekker bakgrunn. I tillegg må godt validert antistoffer oppnå pålitelige og reproduserbar data i diagnostiske og klinisk. Dermed gir modulering av overflod eller fosforylering av relevante epitopes etter behandling i vev skiver en hendig praktisk anvendelse i antistoff validering. En stor fordel av svulst skive kulturer er evnen til modell romlig-distribuert funksjoner, inkludert kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter eller narkotika-respons i svulst eller stromal celler, som gjør dem en attraktiv ex vivo -modell. Imidlertid skiver rotere under dyrking, og prosessen med dyrking kan ytterligere skade vevet spesielt langs kantene. Det er derfor utfordrende nettopp overlappingen biomarkør-farget IHC bilder av 0t skiver med nekrotisk regionene i kulturperler skiver, som kompromitterer evnen til å nøyaktig link romlige biomarkør aktiviteter til narkotika-respons. I tillegg er svulst-innebygde, kultur-indusert og narkotikainduserte nekrotisk svar utvisket minst i murine NSCLC vev skiver, at nøyaktig kvantifisering av romlige narkotika svar. Til slutt, bruk av svulst skive kulturer tillater forsker på prøve flere forbindelser på samme svulst, uten å måtte behandle dyr, dermed raffinering, redusere og erstatte eksperimenter på forsøksdyr.
Som et fremtidig program, kan beskrevet protokollen vedtas klinisk solid tumor smakebiter. Videre er vev Typeavhengige endringer eller optimaliseringer trolig nødvendig, starter med justeringer vibratome innstillingene inkludert skive tykkelse og vibrasjon fart å optimalisere disse for svulst tekstur eller stivhet. I tillegg kan næringsstoffer og vekstfaktor krav variere for forskjellige tumor vev. Som et eksempel, har bryst kreft stykker vært kultivert med insulin supplert i middels13,18. Gitt at begrenset vev materiale er innhentet under operasjon eller biopsi, kan optimalisering av pasient-avledede svulst skive kulturer være utfordrende på grunn av problemer med å skaffe tilstrekkelig antall Repliker prøver. Videre er data reproduserbarhet også utfordret uttales pasient til pasient eksempel heterogenitet, spesielt i prosent for kreftceller versus fibrotiske regioner eller stromal infiltrerer, i tillegg til nekrotisk vev komponenter. Til slutt, anvendelse av svulst sektorer i diagnoseinnstillinger krever Gransking av omfanget hvilket svar i sektoren explants av forbehandling biopsier kamper etter behandling i vivo svar.

Solid tumor vev, inkludert lungekreft, utstilling genetiske og fenotypiske heterogenitet, og havn komplekse microenvironments1,2. Samspillet mellom tumorceller og deres omliggende microenvironment innflytelse på narkotika følsomhet og motstand mekanismer3. Dette understreker behovet for prekliniske modeller som kan nøyaktig modell biologiske kompleksiteten og funksjoner i native svulster. Presisjonsstyrte kutte skiver umiddelbart avledet fra frisk svulster gir en unik ressurs, som de har en rektor representerer i vivo biologi, i det minste for en kort vindu av tid, inkludert fenotyper romlig distribuert i en individuell svulst. Kappet klinisk svulster er en av de få personlige prøvene som kan fås fra en kreftpasient, og deres diagnostisk bruk fortjener gransking.
Historien om organotypic kulturer dateres tilbake til det tidlig 19th århundret, da menneskelige intrakranielt svulster var hånd-kutt i vev biter og kultivert med den såkalte hengende slipp-metoden. Vev fragmenter ble knyttet til en dekkglassvæske og lov til å dyppe i heparinized humant plasma, hvoretter coverslips var invertert, forseglet og kultivert for flere uker4. Manuelt klippe svulst stykker har siden vært kulturperler bruker en rekke andre metoder, som på plasma clots5, i flytende media6, eller på 0,45 µm pore størrelse filtre6. Begrepet "organotypic" ble først brukt i 1954, i en studie på netthinnen differensiering av chick embryoet øye7. Dette ble etterfulgt av studier som brukes lunge og hjerte vev explants av kylling embryoer8og hjernen explants voksen rotter9.
Ulike metoder for kutting har vært beskrevet, nemlig manuell helikoptre10,11, Krumdieck vev slicer12,13og vibratomes11,14,15, 16. Krumdieck vev sliceren genererer sylindriske vev kjerner, som er så skiver i sirkulære vev skiver med en mikrotom. En vibratome, derimot, bruker en vibrerende blad mikrotomen. I en studie på leveren skiver, ble det vist at Leica vibratome genererer mer reproduserbare og konsekvent skiver sammenlignet med Krumdieck slicer15. Skive tykkelser alt 250 til 500 µm har blitt brukt, og studier rapporterer vedlikehold av levedyktighet og morfologiske funksjoner til 16 dager14,10,17,18. Imidlertid tumorer har variabel metabolske profiler som kan påvirke næringsinnhold krav og parametere som vev stivhet og matrix komposisjon kan påvirke på lufting og næringsstoffer flyt. Det er derfor sannsynlig at hver vev type krever optimalisering av kutting og kultur.
Forskjellige dyrkingsmetoder brukes til å støtte skive kulturer: jeg) stasjonære interphase kultur, også kalt stillestående støtte kultur, som er skiver plassert på en semi porøs membran setter nedsenket i kultur medium. I dette utsatt toppen av skiver for luften, mens bunnen er supplert med næringsstoffer via porøse sett inn14,19; II) murskje metoden opprinnelig utviklet kultur hele organer eller embryonale vev skiver. I dette, skiver er plassert på en bomull ark eller filter støttes av en og filteret er dynket i kultur medium. For å holde vev fuktig, legges et tynt lag med middels på skiver20,21,22. De to første er såkalte luft-flytende interphase kulturer; III) valse røret kulturer, der stykker plasseres innenfor den flate siden av et plastrør som inneholder mediet, og langsom tube rotasjon sikrer at vevet er dekket med medium i første del av en syklus, eller karbonisert under andre23; IV) roterende inkubasjon enheter, der skiver er midlertidig utsatt for medium med næringsstoffer og lufting. Forskjellig fra Berg rør, i denne metoden skiver er plassert på porøse Titan rutenett i 6-vel plater med kultur medium24.
Vev skiver avledet fra resected solide svulster Commit en attraktiv ex vivo modell å teste behandlingsrespons anti-kreft agenter, som de tillater evaluering av levedyktighet, målrettet veien aktivitet og molekylære profiler en bestemt svulst i nærvær av sine opprinnelige svulsten microenvironment. Men for å vurdere om narkotika svarene målt i svulst skiver er prediktive for i situ svar, er det viktig å vurdere hvilken grad vev skiver beholde svulst-spesifikke biologiske funksjoner som celle spredning, histopatologi-spesifikk celledifferensiering eller kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter. Virkningen av mekanisk stress elicited under skive forberedelse, slice håndtering eller kultur-indusert tilpasninger på både kvalitet og biologiske funksjoner av vev skiver er grunnleggende spørsmål, tett knyttet til evnen til å implementere svulst-avledet skiver for funksjonell diagnostikk.
Våre IMI-finansierte consortium prosjektet PREDECT (http://www.predect.eu) setter ut til systematisk adresse disse grunnleggende spørsmålene, ved å studere slice explants fra en rekke kilder. Bruker skiver avledet fra lunge, bryst og prostata kreft modeller, utnyttet denne felles innsats kvalitative read-outs samt kvantitative hematoxylin og eosin (H & E) - basert readouts å demonstrere en forutsetning for atmosfærisk oksygen og stillestående filter hjelper å opprettholde levedyktigheten til kulturperler skiver til 72 h. Videre immunohistochemistry (IHC) analyser på kulturperler skiver avslørt intra-skive levedyktighet graderinger, dokumentert som nekrose graderinger i skiver avledet fra murine ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), østrogenreseptor (ER), HIF1α og γH2AX graderinger i bryst kreft skiver eller androgen reseptoren (AR) uttrykk graderinger i prostatakreft skiver25. Interessant, intra-skive levedyktighet graderinger i 24 h kulturer av murine NSCLC ble reddet av dyrking i en roterende inkubasjon enhet, og vår siste studie viste at levedyktighet ble utvidet til 72 h26. Spesielt oversiden forble mest levedyktige26, godkjenne narkotika svar analyser på skiver utføres best på denne siden av vev.
Selv om det fortsatt et spørsmål om hvordan langt vev skiver kan recapitulate i situ svulst funksjoner, de har blitt brukt til å teste Svar å anti-kreft agenter, inkludert målrettet narkotika, monoklonale antistoffer og kjemoterapi agenter 10,,11,,13,,14,,18,,27. Vi har nylig viste at murine NSCLC skiver vise dynamiske endringer i spredning og kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter etter dyrking sammenlignet med fersk kuttet 0t skiver26. Dette indikerer at det er viktig å undersøke om målrettet i situ biologiske funksjonene beholdes riktig under dyrking, før forstyrrelsene studier. Til tross for disse funnene, vi viste at svulsten skiver kan modellen romlige svar på målrettet terapi, midt narkotika behandlinger forblir kort (24 timer) og er iverksatt på utbruddet av dyrking26. Følgende protokollen beskriver viktig validering aspekter relevant for etablering og analyse av tumor skive kulturer, før deres anvendelse i farmakologiske narkotikatesting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic primære vev explant kulturer, som inkluderer presisjonsstyrte kutte skiver, representerer tredimensjonale (3D) vev arkitektur samt flercellet samspillet av innfødte vev. Vev skiver umiddelbart kuttet fra ferske resected svulster bevare romlige aspekter av intratumor heterogenitet, noe som gjør dem nyttige surrogater i vivo biologi. Forsiktig optimalisering av vev slice forberedelse og dyrking er grunnleggende for prediktiv diagnostiske potensialet i svulst stykke explants. I denne forbindelse er murine modeller verdifull, som disse gir en konsekvent flyt av svulst materiale å utføre replikere og reproduserbar eksperimenter. Denne protokollen beskriver dyrking av murine lunge svulst-avledet vev skiver med en roterende inkubasjon enhet, et system som lar intermitterende eksponering for vev oksygen og næringsstoffer. Tidligere arbeidet viste at bruk av roterende inkubasjon enheter forbedrer levedyktigheten til vev sammenlignet med andre kultur metoder, spesielt flytende skiver og stillestående filteret støtter. Her vi videre vise at skive tykkelse påvirker levedyktighet av kultivert skiver, antyder at optimalisering av skive tykkelse bør gjøres for ulike vev typer. Uttales ITH i relevante kreftfremkallende funksjoner, som signaliserer aktiviteter, stromal cell infiltrasjon eller uttrykk for differensiering markører, nødvendiggjør evaluering av tilstøtende vev skiver for uttrykket av markører endres av behandling eller dyrking selv. Oppsummert denne protokollen beskriver generering av murine lunge svulst skiver og deres kultur i en roterende inkubasjon enhet og demonstrerer hvordan skiver bør analyseres systematisk for uttrykket av heterogen vev markører, som en forutsetning før medikament svar studier.

Figur 1 representerer arbeidsflyten for generasjon, dyrking og analyse av presisjonsstyrte kutte vev skiver avledet fra murine NSCLC svulster. For denne demonstrasjonen benyttet vi svulster fra genmodifiserte musemodell (GEMM) skjuler betinget aktivering av KrasG12D sammen med tap av Lkb1 (også kjent som Serine/threonin Kinase 11), heretter kalt KL. Musen avl og lunge svulst innvielsen ble utført som beskrevet i26,28. Figur 2A demonstrerer effekten av vev slice tykkelse på levedyktigheten til skiver kultivert for 24 timer med en roterende inkubasjon enhet. Resultatene viser at 160 µm tynne skiver inneholder store nekrotisk områder over sektoren. I tillegg viser 250 µm tynne skiver en nekrose gradient over stykket sammenlignet med 200 µm tynne skiver. Det er sannsynlig at dårlig samlede levedyktigheten til den tynneste 160 µm skyldes teknisk behandling under plassering av skiver på nett, dette er skjøre og krølle. På den annen side, når stykker er for tykk, de kan bli utsatt for mangler oksygen eller næringsstoffer spredning over skiver, er som i murine NSCLC explants dokumentert som nekrotisk død gradient25. Det bør imidlertid bemerkes at skiver med variabel tykkelse kan genereres fra en svulst, til tross for bruk av samme vibratome innstillinger. Det anbefales derfor å analysere flere gjentak fra forskjellige svulst prøver. Viktigere, krever hver vev type skive tykkelse optimalisering å oppnå maksimal levedyktighet, som vev tekstur og hardhet kan påvirke oxygenation og næringsinnhold flyt. Figur 2B -2C illustrerer kvantitative IHC analyser av NKX2-1 uttrykk, en markør av Reproduksjonsvinduet lunge adenocarcinoma (AC) i prøver dyrket opptil 72 h og matchet 0t skiver. Resultatene viser at NKX2-1 uttrykk ikke er betydelig endret i kulturperler skiver i forhold til 0 h uncultured skiver, antyder at prosessen med dyrking ikke åpenlyst påvirker statusen differensiering av AC tumor vev. Figur 2D viser verktøyet av tumor vev skiver for å vurdere effektiviteten av målrettet narkotika. Vi nylig viste Kras mutant murine ACs utstillingen høy uttrykket fosforylert ERK1/2 (markering økt MAPK sti aktivitet) sammenlignet med adenosquamous (ASC) svulster, mens uttrykk for fosforylert 4EBP1 (merking mTOR aktivitet ) er tilsvarende uttrykt i både AC og ASC svulster. For å teste om disse veiene kan være effektivt målrettet på vev skiver, KL AC vev stykker ble behandlet med DMSO eller titreres mengder forbindelser, nemlig 0,1 til 1 µM dactolisib å målrette mTOR veien eller 0,05-0,5 µM selumetinib mot MAPK veien. Resultatene viser at 1 µM dactolisib eller 0,5 µM av selumetinib er effektive i hemme fosforylering 4EBP1 eller ERK1/2, henholdsvis. Videre angir doseavhengig hemming av de målrettede fosfoproteiner at vev skiver kan også benyttes for å validere fosforylering-spesifikke antistoffer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for etablering og analyse av murine NSCLC svulst-avledet slice explants. (A) skjematisk beskriver innsamling og forberedelse av svulst rentebærende lungene til kutting. Lunge lobes høstet en mus og tumor vev er dissekert fra normalt vev. Svart pilspiss og stjerne indikere omtrent 4 og 1 mm svulster, henholdsvis. Hvit pilspissen angir lungevev festet til overflaten av prøveholderen. Røde pilen peker på et ekstra stykke normal lungevev støtte beholde svulst i oppreist stilling. (B) Vibratome slicing og samling av vev skiver. Hvite pil viser kutting retning. Samling av sekvensiell skiver i en 24-vel plate inneholder kald HBSS + P/S. Skiver kan enten være kultivert for forskjellige tidspunkt (her, 24-72 h) for å vurdere svulst-spesifikk markør uttrykk under dyrking (øverste rad), eller kan brukes til å utføre medikamentelle behandlinger. C: kjøretøy kontroll, T: behandling. (C) å plassere vev slice for dyrking med roterende inkubasjon enheter. Vipp 6-vel platen slik at noen medium dekker toppen av rutenettet, plassere vev slice i rutenettet på mediet og spre stykket ved hjelp av pinsett. Kontroller at 6-vel platene er vekt balanserte for en jevn rotasjon syklus. X: angir feil, og <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: angir riktig plassering av stykket. (D) fotografi av FFPE blokken med en svulst skive. Svarte pilen peker på parafin-embedded vev slice farget med hematoxylin. (E) skjema viser snitting rekkefølgen sektorene i FFPE blokker. disse delene kan behandles for å vurdere vev levedyktighet og svulst-spesifikke biomarkør uttrykk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figur 2: vurdering av levedyktighet og histotype-spesifikk markør uttrykket og målrettet behandling på NSCLC vev skiver. (A) representant H & E bilder av AC NSCLC skiver av angitte tykkelser kultivert for 24 h. 200 µm tynne skiver opprettholde bedre levedyktighet sammenlignet med 160 µm eller 250 µm tynne skiver. Mørk blå representerer H & E farget levedyktig vev, og rosa angir pseudocolored nekrose regioner. Lyseblått indikerer regioner ekskludert fra analysen, enten på grunn av dårlig vevet kvalitet eller tilstedeværelse av fibrøst stroma. T1 og T2 representerer biologiske replikater stammer fra to forskjellige svulster. Skala bar = 500 µm. (B) representant IHC bilder av NKX2-1 uttrykk i AC skiver kultivert for de angitte tidspunkt. Pilen viser området som vises i høyere forstørrelse. Resultatene viser at NKX2-1 uttrykket ikke endres i kulturperler skiver sammenlignet 0t skiver. Skala bar = 500 µm og 50 µm for lav og høy forstørrelse, henholdsvis. (C) kvantifisering av dataene (B). (D) representant IHC bilder fosforylert 4EBP1 eller pERK1/2 uttrykk i 0t stykker og skiver behandlet med DMSO titreres mengder dactolisib (dhandle, øverste rad) eller fosforylert pERK1/2 uttrykk i 0t sektoren eller sektorene behandlet med DMSO eller selumetinib (sel, nederste rad). Svarte, firkantede bokser angir områdene vist i høyere forstørrelse. Skala bar = 1 mm eller 50 µm for lav eller høy forstørrelse, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Vi tilbyr en metode for generasjon, dyrking og systematisk analyse av organotypic skiver avledet fra murine lunge svulst. Vi beskriver også hvordan å optimalisere for skive tykkelse, og velge narkotika konsentrasjoner å behandle svulst skiver.

Etablering og analyse av Tumor Slice Explants er en forutsetning for diagnostiske tester

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i preklinisk forskning, hvor legemiddelresponsstudier i tumorskjær explants kan tjene diagnostiske formål. Den største fordelen med denne teknikken er at skive explants kan for et kort tidsvindu modell den komplekse biologien til innfødte vev, inkludert romlig distribuerte funksjoner. Selv om denne metoden kan gi innsikt i bruk av skiver fra murine lungesvulster, det kan også brukes til andre vev typer inkludert menneskelige vev.For å begynne, klargjør vibratomen og utfør en VibraCheck i henhold til instruksjonene i håndboken. Fyll deretter hver brønn av 24-brønnsplaten med en milliliter Av Hanks balanserte saltløsning supplert med penicillin og streptomycin og hold platen på is. Sett inn 25-gauge nåler i alle fire poter av en euthanized mus plassert på en styrofoam lokk slik at brystet er utsatt og dyret er strukket.Spray 70% alkohol på overflaten av den eksponerte huden. Bruk saks plassert i en vinklet posisjon for å kutte åpne huden fra magen mot brystet og opp til nakkeområdet. Strekk huden på hver side ved hjelp av tang og sett inn 25-gauge nåler.Klipp opp bukregionen. Klipp deretter opp brystkassen og membranen for å eksponere lunge og hjerte. Utsett luftrøret ved å kutte bort det omkringliggende vevet.Disseker lungene, sammen med hjertet. Legg vevet i et 50-milliliter rør som inneholder 30 milliliter iskald HBSS supplert med Pen-Strep plassert på is og fortsett til neste trinn så raskt som mulig. Overfør nå de tumorbærende lungene til en 10-centimeter vevskulturplate.Bruk steril saks og tang for å skille lungelappene og velg fliker med svulster på overflaten for kutting. Plasser en lungelapp med et tumorvev på et stykke filterpapir for å unngå å skli og kutte ut en del av den normale lunge- eller ekstra tumorvevet som omgir svulsten ved hjelp av en steril skalpell for å generere en flat vevsdeloverflate. Dypp den flate siden i en dråpe cyanoacrylate lim og monter den på vibratomprøveholderen slik at svulsten vender mot bladet i oppreist stilling, og la den tørke i to til tre minutter.Plasser vibratomprøveholderen i metallbufferbrettet. Fyll brettet med kaldt HBSS supplert med Pen-Strep til vevet er nedsenket i bufferen. Dekk bufferbrettet med Pleksiglasslokket som følger med instrumentet, og legg brettet i et hvitt isbad og tilsett is for å holde vevet kjølig under kutting.Fest det hvite isbadet til vibratomen. Velg deretter passende kutteinnstillinger og begynn å kutte. Før vibratombladet i skjæreposisjon og sett skjærevinduet.Bruk sterile tang til å samle skivene i en 24-brønns plate fylt med en milliliter HBSS supplert med Pen-Strep per brønn og hold på is. Mens du holder styr på kuttrekkefølgen, markerer du hver brønn av 24-brønnsplaten i henhold til den eksperimentelle planen. Samle en vevsskive ved siden av de kultiverte skiver som en null timer eller ukulturert referanse.Samle minst tre referanseskiver for å representere toppen, midten og bunnen av vevet. Og når kuttingen er fullført, fortsett med festing og behandling. Deretter lager du en seksbrønnsplate som inneholder 2,5 milliliter kulturmedium per brønn ved å plassere titangitter i den.Pass på at det ikke dannes luftbobler mellom titangitteret og mediet. Hvis du vil laste et stykke på gitteret, må du ha seksbrønnsplaten i vinklet posisjon slik at en del av mediet dekker gitteret. Plasser deretter stykket i mediet på rutenettet og bruk tang til å spre den.Etter plassering av skivene, legg seksbrønnplatene på den roterende inkubasjonsenheten plassert inne i en fuktet inkubator som vedlikeholdes ved 37 grader Celsius med 95% 02 og 5% CO2. Start rotasjonssyklusen. For langsiktig dyrking fylle kulturen medium hver dag ved hjelp av sterile tang for å løfte rutenettet som inneholder vev skiver og plassere den i en tom brønn av seks-brønn plate.Erstatt 70 % av mediet med et friskt kulturmedium og plasser rutenettet inn igjen. Fortsett rotasjonssyklusen som tidligere. For medikamentbehandling på tumorskivene legger du til 2,5 milliliter media med fortynnet legemiddel- eller kjøretøykontroll i seksbrønnsplaten.Plasser titangitteret i brønnene, og plasser deretter skivene på gitter som gjort tidligere. Etter å ha utført behandlingene i 24 timer, fortsett med fiksering og behandling. For å begynne å feste ønsket skive forsiktig overføre den ved hjelp av tang til en 10-centimeter plate som inneholder et gjennomvåt filterpapir fylt med to til tre milliliter PBS og la den flyte.Løft deretter ut filterpapiret med et par tang og legg det i en histokassett. Overfør filterpapiret til en histokassett. Tilsett en dråpe fortynnet hematoksylin på toppen av vevsskiven for å markere plasseringen av skiven for de påfølgende trinnene.Lukk kassetten, og overfør den til 4% nøytral bufret formalin løsning og la over natten på fire grader Celsius. Etter vask og behandling av kassetten som beskrevet i protokollen, åpne histokassetten og bruk en skalpell til å løfte den faste skiven forsiktig fra filterpapiret. Kast filterpapiret og overfør skiven til en mugg som inneholder flytende parafin.Bruk en flat vekt for å presse vevet mot bunnen av innebyggingsformen for å sikre jevn snitting. Plasser den nederste delen av histokassetten på toppen av formen. Tilsett flytende parafin på toppen av den.Og la formen avkjøles på en kald tallerken i 30 minutter. Deretter skiller den avkjølte formen fra parafinblokken. Bruk en mikrotom til å forberede fire mikrometer tynne deler av FFPE vev skive blokker.Trim bort overskuddet av parafin rundt vevet. For å oppnå jevne seksjoner i hele vevet justere vinkelen på blokken slik at overflaten av blokken er horisontalt orientert med hensyn til bladet. Ved hjelp av en tynn børste samle sekvensielle vev deler av parafin-innebygd vev skive starter på den øvre delen av glasset lysbilder.Fortsett å samle delene av de dypere vevslagene til midten, etterfulgt av den nederste delen av glassskliene. Samlingen av seksjoner fra forskjellige lag av hvert vevsskive til objektlysbildene gjøres for å muliggjøre fangst av potensielle kulturinduserte graderinger i levedyktighet, cellemigrasjon eller biomarkøruttrykk. Etter å ha samlet seksjonene fortsette med sin behandling og videre analyse som beskrevet i protokollen.Vev skive tykkelse kan påvirke levedyktigheten til kultiverte skiver. I dette tilfellet viser 250-mikrometer tykke skiver økt nekrose gradienter sammenlignet med 200-mikrometer tykke skiver på grunn av tykkere skiver blir utsatt for mangler i oksygen eller næringsdiffusivjon over skivene. Imidlertid inneholder 160-mikrometer tynne skiver store nekrotiske områder sannsynligvis forårsaket av teknisk håndtering under posisjonering av skivene, da disse er skjøre og har en tendens til å krølle seg.Analyse av NKX2-1, en markør for godt differensiert lunge adenokarsinom, viser at uttrykket ikke er vesentlig endret i kultiverte skiver sammenlignet med null time ukulturerte skiver. Kvantitativ analyse av NKX2-1-uttrykk bekreftet videre at uttrykket ikke ble signifikant endret i kultiverte versus ukulturerte skiver, noe som tyder på at prosessen med dyrking ikke synlig påvirker differensieringsstatusen til adenokarsinomvev. For å teste om tumorvevskiver kan brukes til å evaluere effekten av målrettede legemidler, ble de behandlet med DMSO eller titrerte mengder forbindelser.Når behandlet med en mikromolar dactolisib som retter seg mot mTOR-fosforylering av 4EBP1 ble hemmet. 0,5 mikromolar selumetinib som retter seg mot MAP kinasebanen var effektiv i å hemme fosforylering av ERK1/2. Etter å ha sett denne videoen bør du ha en god forståelse av hvordan du arbeider med og kritisk analysere skiver ferskt kuttet fra dyrebare tumorvev.Vår tidligere postdoc, Katja Narhi, bidro betydelig til etableringen av denne metoden i samarbeid med kolleger av IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Bruke BLT humanisert Mouse som en stamcelle basert Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE basert analyse for å studere migrasjon av murine Skin dendrittiske celler i Tømming lymfeknuter Under infeksjon med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Utnyttelse av kapsler for negativ farging av virale prøver innen biokonduksjon

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse av 18FDG PET/CT Imaging som et verktøy for studerer Mycobacterium tuberculosis infeksjon og behandling i ikke-menneskelige primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus spesifikke diagnostiske Epitope oppdagelsen

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infeksjoner som Screening verktøy for identifikasjon av Viral Immunomodulators og vert Antiviral faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...