Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Esta pesquisa trabalho recebeu apoio financeiro da empresa comum de iniciativa de medicamentos inovadores conceder acordo no 115188, o programa de doutorado de Universidade de Helsínquia em bolsas de estudo biomedicina (A.S.N.) e a Sigrid Juselius e Orion-Farmos fundações (E.W.V.). Agradecemos sinceramente membros de consórcio nossa plataforma de fatia de tecido PREDECT (af Taija Hallstrom e Siv Knaappila para suporte em configurar o sistema de rotor e Riku Turkki para suporte com a análise MATLAB. Jouko Siro é agradeceu para captura de fotografias da Figura 1. Agradecemos a equipe do FIMM WebMicroscope para digitalizar slides histológicas, e apoio do centro de Animal de laboratório para criação.

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Diversos complexos em vitro tumor modelos, incluindo culturas 3D e organoids, foram desenvolvidos para recapitular as funções oncogênicas em vivo de29,de tecido do tumor30e arquitetura. No entanto, o estabelecimento de culturas 3D ou organoids envolve a dissociação de tecido e crescimento seletivo de um único tipo de células ou cultura co um seleto poucos tipos de células em um ambiente artificial. Como consequência, tais modelos incompleta capturam a complexidade das interações de heterogeneidade e tumor estroma do tumor. Organotypic fatias de tumor, por outro lado, mantenham as complexidades de arquitetura e biológicos do tecido o tumor em situ , sem manipulação extensiva. Essa capacidade de fatias de tecido para as células de tumor de modelo na sua nativa microambiente os torna particularmente atraente para estudos pré-clínicos. Nós relatamos anteriormente um fluxo de trabalho otimizado para o estabelecimento e análise de fatias de tumor de precisão de corte, e mostrou que, em comparação com o suporte do filtro, uma unidade de incubação rotativa melhorar a viabilidade de curto prazo murino NSCLC fatia culturas25 , 31. no entanto, o cultivo em unidades de giro é tecnicamente desafiador e requer monitoramento constante. Aqui apresentamos um protocolo para geração de pedaço de tecido de tumor e o uso prático de uma unidade de incubação para a cultura deles de giro, bem como métodos para monitorar a capacidade de fatias de capturar em situ biologia tumor, um pré-requisito antes da droga de acompanhamento testes de resposta.
Vários passos críticos no protocolo de assegurar a integridade do tecido e a viabilidade das fatias de tumor. Se o tecido pulmonar normal rodeia o tumor, o vibratome pode gerar fatias com espessura inconsistente ou danificar as fatias, devido a diferenças na textura e rigidez entre tecidos normais e tumor. Assim, é importante remover o tecido circundante do pulmão normal antes da corte de tumor. Outro passo crítico é a espessura de corte, que deve ser cuidadosamente otimizada para cada tipo de tecido. Além disso, uma vez cortada, é fundamental que a fatia é colocada aproximadamente no meio da grade, então para garantir precisão intermitente, mergulhando no meio de cultura e exposição de oxigênio. Finalmente, é importante seguir a posição de uma fatia durante seu período de rotação, como uma fatia pode cair para baixo ao meio; Se isso acontecer, ainda mais, ações podem ser tomadas como explicado no passo 3.6 do protocolo.
Além de manipulação para garantir a integridade de tecido, há também passos críticos na análise IHQ para interpretar como a fatia se assemelha ao tecido nativo. Nosso estudo anterior mostrou que murino tumores NSCLC apresentam heterogeneidade espacial intra-tumor pronuncia-se em atividades de sinalização oncogênica26. Isso significa que o uso de tecido espacialmente distinto fatias para controles ou tratados com drogas amostras podem afetar a interpretação dos dados experimentais confiáveis, e, portanto, estreitamente adjacentes fatias devem ser usadas como controles e amostras de teste. Nós revelou ainda que enquanto a proliferação ou expressão phosphoprotein oncogênica em fatias h 0 inculto recém cortadas eram semelhantes a tumores em situ , fatias culturas mostraram expressão alterada phosphoprotein oncogênica, especificamente alterados p4EBP1 e pSRC, bem como alterada proliferação analisados pelo Ki67 IHC. Expressão p4EBP1 alterado da mesma forma foi detectado em 24 h NSCLC humano e câncer de próstata fatia culturas (Narhi et al., complementar figura S3B-S3C, S5 e S7)26. Esses achados endossam que comparação de fatias cultivadas com sua fatia de inculto h 0 mais próxima é fundamental para avaliar a preservação em situ funções de tumor em fatias culturas.
Apesar de melhorar a viabilidade de organotypic fatias25, há limitações com o sistema de rotor em termos técnicos. Colocar as fatias de tecido para grades de titânio é mais desafiador em comparação para filtrar as inserções, e uma unidade rotativa de incubação pode não estar disponível. Como alternativa, suporta filtro estagnada pode ser usada, mas nesse caso deve ser analisado apenas o lado ar-expostos das fatias, como filtro de ar para gradientes na viabilidade e hipoxia medido pela expressão HIF1α formam-se rapidamente na fatia de filtro-suporte culturas (Davies et al., Figura 5 e figura 7A-7B)25. Temos ainda mais demonstrado que culturas de fatia do tumor podem exibir alterada proliferação e atividades de sinalização oncogênicas em comparação com seus tumores nativo26, possivelmente por causa de respostas de cicatrização de feridas ou adaptação metabólica das fatias de ex vivo cultura32. Embora brutas características morfológicas dos tumores NSCLC murino foram mantidas durante o cultivo de 72 h, induzida pela cultura proliferativas alterações podem afetar classificação exata das fatias cultivadas. Assim, fatias de tecido só devem ser utilizadas para estudos funcionais a curto prazo.
Uso de uma unidade de incubação rotativo, pelo menos parcialmente resgata intrafatia viabilidade ou biomarcador gradientes de expressão, particularmente durante as primeiras 24 horas de cultura. Uma vez validado pela integridade e função, isto fornece material de tecido para estudos funcionais, tais como estudos de tratamento de drogas. Além de drogas resposta de perfilação, expressão-alvo alterado após tratamento medicamentoso pode também beneficiar de validação de anticorpo. Isto é particularmente relevante para a detecção de epítopos murino com anticorpos monoclonais de rato, que tendem a dar coloração de fundo elevado. Além disso, anticorpos bem validados são necessários para obter dados confiáveis e reproduzíveis em contextos clínicos e diagnósticos. Assim, a modulação da abundância ou fosforilação de epitopos relevantes após o tratamento de drogas em fatias de tecidos fornece uma útil aplicação prática na validação de anticorpo. Uma grande vantagem das culturas de fatia do tumor é a capacidade de funções modelo espacialmente distribuídos, incluindo atividades de sinalização oncogênicas ou resposta de droga no tumor ou células do estroma, que os torna um modelo atraente ex vivo . No entanto, fatias giram durante o cultivo, e o processo de cultivo mais pode danificar o tecido particularmente nas bordas. É, portanto, um desafio para overlay precisamente as imagens IHC manchadas de biomarcador de fatias 0 h com as regiões necróticas detectadas em fatias culturas, que compromete a capacidade de ligar precisamente as actividades espaciais biomarcador para resposta da droga. Além disso, respostas necróticas tumor intrínsecos, induzida pela cultura e induzida por drogas são indistinguíveis pelo menos em fatias de tecido NSCLC murino, comprometer a quantificação exata das respostas de droga espacial. Finalmente, o uso de culturas de fatia do tumor permite que um pesquisador para o teste de vários compostos do tumor mesmo, sem a necessidade de tratar os animais, assim, refinação, redução e substituição de experimentos em animais de laboratório.
Como uma aplicação futura, o protocolo descrito pode ser adotado para amostras clínicas tumor sólido. Mais modificações dependentes do tipo de tecido ou otimizações são provavelmente necessárias, começando com os ajustes para as configurações de vibratome incluindo a velocidade de espessura e vibração do fatia para otimizar estes para textura de tumor ou rigidez. Além disso, a exigência nutriente e fator de crescimento pode variar para tecidos de tumor diferente. Como exemplo, fatias de câncer de mama tem sido cultivadas com insulina completada em média13,18. Dado que o material tecido limitada é obtido durante a cirurgia ou biópsia, otimização das culturas de fatia de tumor derivado de paciente pode ser um desafio devido às dificuldades de obtenção de um número suficiente de amostras. Além disso, reprodutibilidade de dados também é contestada pela pronunciada heterogeneidade da amostra de paciente para paciente, nomeadamente a percentagem de células tumorais contra regiões fibróticas ou infiltração do estroma, bem como componentes de tecido necrótico. Finalmente, a aplicação de fatias de tumor em configurações de diagnósticos exigiria investigação da dimensão a qual droga respostas em explantes de fatia de biópsias de pré-tratamento corresponde às respostas de pós-tratamento na vivo .

Tecidos de tumores sólidos, incluindo câncer de pulmão, apresentam heterogeneidade fenotípica e genética e abrigam microambiente complexo1,2. A interação entre as células do tumor e sua influência microambiente circundante na droga sensibilidade e resistência mecanismos3. Isto sublinha a necessidade de modelos pré-clínicos que pode modelar com precisão complexidades biológicas e funções, atuando em tumores nativos. Precisão de corte fatias imediatamente derivadas de tumores frescas fornecem um recurso exclusivo, como eles têm uma capacidade principal para representar a biologia na vivo , pelo menos por um curto espaço de tempo, incluindo fenótipos espacialmente distribuídos em um tumor individual. Ressecado tumores clínicas são um dos poucos espécimes personalizados que podem ser obtidos de um paciente com câncer, e seu uso diagnóstico merece escrutínio.
A história da organotypic culturas remonta ao século cedo 19th , quando tumores intracranianas humanas eram mão-corte em pedaços de tecido e cultivadas usando os chamados pendurado método drop. Fragmentos de tecido foram anexados uma lamela e permissão para mergulhar em plasma humano heparinizado, após o qual as lamelas foram invertidas, seladas e cultivadas por várias semanas4. Cortar manualmente tumor peças já foram cultivadas usando uma variedade de outros métodos, tais como coágulos plasma5, em meio líquido6, ou em 0,45 µm poro de filtros de tamanho6. O termo "organotypic" foi usado primeiramente em 1954, em um estudo sobre a diferenciação da retina do olho embrião garota7. Isto foi seguido por estudos que utilizados explantes de tecido de pulmão e coração derivados de embriões de pintainho8e explantes de cérebro de ratos adultos9.
Vários métodos de corte foram helicópteros descrito, ou seja manual10,11, Krumdieck tecido fatiador12,13e vibratomes11,14,15, 16. O cortador de tecido Krumdieck gera núcleos do tecido cilíndrico, que depois são cortados em fatias de tecido circular usando um micrótomo. Um vibratome, por outro lado, usa um micrótomo lâmina vibratória. Em um estudo sobre fatias de fígado, foi demonstrado que a Leica vibratome gera mais consistentes e reprodutíveis fatias em comparação com o cortador de Krumdieck15. Fatia de espessuras que variam de 250 a 500 µm foram usadas, e estudos relatam a manutenção da viabilidade e das características morfológicas mesmo até 16 dias14,10,17,18. No entanto, tumores têm perfis metabólicos variáveis que podem afetar as necessidades de nutrientes e parâmetros como a composição de matriz e rigidez do tecido podem influenciar na aeração e fluxo de nutrientes. Portanto, é provável que cada tipo de tecido requer a otimização das condições de corte e cultura.
Métodos de cultivo diferentes foram usados para apoiar a fatia culturas: eu) cultura estacionária interfase, também chamada de cultura estagnada suporte, em que as fatias são colocadas em cima de uma inserção de membrana semi porosas imergida em meio de cultura. Neste, o topo das fatias é exposto ao ar, enquanto a parte inferior é suplementada com nutrientes através da inserção porosa14,19; II) o método de espátula, originalmente desenvolvido para órgãos inteiros de cultura ou fatias de tecido embrionário. Neste, as fatias são colocadas em cima de uma folha de algodão ou filtro suportado por uma grade de metal, e o filtro é embebido em meio de cultura. Para manter os tecidos húmidos, uma fina camada do meio é adicionada em cima as fatias de20,21,22. Esses dois primeiros são chamados culturas interfase ar-líquido; III) culturas de tubo rolo, em que as fatias são colocadas dentro do lado plano de um tubo de plástico contendo meio e tubo lenta rotação assegura que o tecido é coberto com média durante a primeira parte de um ciclo, ou arejado durante o segundo23; IV) rotativa unidades de incubação, em que as fatias intermitentemente são expostas ao meio com nutrientes e aeração. Diferente dos tubos do rolo, neste método, as fatias são colocadas em cima de grades de titânio poroso colocados em 6-poços placas com meio de cultura24.
Fatias de tecido derivado de tumores sólidos ressecados logicamente presentes um modelo atraente ex vivo em que para testar a resposta do tratamento dos agentes anti-câncer, que permitam a avaliação da viabilidade, alvo de atividade de percurso e perfis moleculares de um tumor específico na presença de seu microambiente do tumor nativo. No entanto, para avaliar se as respostas de drogas medidas em fatias de tumor são preditivas de respostas em situ , é importante avaliar em que medida fatias de tecido preservar tumor-específicos funções biológicas como a proliferação celular, diferenciação celular histopatologia específicas ou atividades de sinalização oncogênicas. O impacto do estresse mecânico eliciado durante a preparação da fatia, fatia de manipulação ou adaptações induzida pela cultura, tanto pela qualidade e funções biológicas das fatias de tecido são questões fundamentais, fortemente ligados à capacidade de implementar o tumor derivado fatias de diagnóstico funcional.
Nosso projeto financiado pelo IMI consórcio PREDECT (http://www.predect.eu) visa sistematicamente endereço estas questões fundamentais, através do estudo de explantes de fatia de uma variedade de fontes. Usando fatias derivadas de modelos de câncer de mama, de próstata e de pulmão, este esforço conjunto utilizado qualitativas leituras bem como hematoxilina quantitativa e leituras de eosina (H & E) - com base para demonstrar um requisito para o oxigênio atmosférico e filtro estagnado suportes para sustentar a viabilidade de fatias cultivadas até 72 h. Além disso, análises imuno-histoquímica (IHC) em fatias cultivadas revelaram gradientes de viabilidade intrafatia, evidenciados como gradientes de necrose em fatias derivadas de câncer de pulmão murino não-pequenas células (NSCLC), receptor de estrógeno (ER), HIF1α e γH2AX 25fatias de gradientes em fatias de câncer de mama, ou gradientes de expressão de receptores (AR) de andrógeno no cancro da próstata. Curiosamente, gradientes de viabilidade intrafatia em culturas de 24 h de NSCLC murino foram resgatados pelo cultivo em uma unidade de incubação rotativa, e nosso estudo recente mostrou que a viabilidade foi estendida para 72 h26. Particularmente o lado superior permaneceu mais viável26, endossando que as análises de resposta de droga em fatias melhor são efectuadas neste lado do tecido.
Mesmo que continua a ser uma questão de saber como longe fatias de tecido podem recapitular em situ funções do tumor, eles têm sido extensivamente usados para testar respostas a agentes anti-câncer, incluindo drogas alvo, anticorpos monoclonais e agentes quimioterápicos 10,11,13,14,18,27. Recentemente mostramos que fatias NSCLC murino mostram mudanças dinâmicas em proliferação e oncogênicas atividades sinalização após o cultivo, quando comparado com o cortado recentemente h 0 fatias26. Isto indica que é importante investigar se o alvo em situ funções biológicas são adequadamente preservadas durante o cultivo, antes estudos de perturbação. Apesar destas constatações, mostramos que fatias do tumor podem modelar spatial resposta a terapias alvo, meio drogas tratamentos permanecem breve (24h) e são iniciadas no início de cultivo26. O seguinte protocolo descreve validação importantes aspectos relevantes para o estabelecimento e análise de culturas de fatia do tumor, antes da sua aplicação em testes de drogas farmacológicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Culturas de explant organotypic tecido primário, que inclui a precisão de corte fatias, representam a arquitetura do tecido tridimensional (3D), bem como as interações multicelulares do tecido nativo. Fatias de tecido imediatamente cortadas da recém ressecadas tumores preservam aspectos espaciais da heterogeneidade intratumor, tornando-os úteis substitutos de biologia na vivo . Cuidado de otimização das condições de preparação e cultivo de fatia de tecido é fundamental para o potencial de diagnóstico preditivo de tumor fatia explants. A este respeito, modelos murino são valiosos, como estes fornecem um fluxo consistente de material do tumor para realizar experiências reprodutíveis e replicar. Este protocolo descreve a cultura de fatias de tumor derivado de tecido de pulmão murino usando uma unidade rotativa de incubação, um sistema que permite a exposição intermitente de tecidos de oxigênio e nutrientes. Nosso trabalho anterior mostrou que o uso de unidades de incubação de giro melhora a viabilidade do tecido, em comparação com outros métodos de cultura, particularmente flutuante fatias e suporta filtro estagnado. Aqui, mostramos ainda mais que a espessura da fatia influencia a viabilidade de fatias culturas, sugerir que a otimização da espessura da fatia deve ser feito para tipos diferentes de tecido. Pronuncia-se OM em funções oncogênicas relevantes, tais como sinalização atividades, infiltração de células do estroma ou expressão de marcadores de diferenciação, exige avaliação de fatias de tecido adjacente para a expressão de marcadores alterada por tratamento medicamentoso ou cultivo próprio. Em resumo, este protocolo descreve a geração de fatias de tumor de pulmão murino e sua cultura em uma unidade de incubação rotativa e demonstra como fatias devem ser analisadas sistematicamente para a expressão de marcadores de tecido heterogêneo, como um pré-requisito antes de estudos de resposta de drogas.

A Figura 1 representa o fluxo de trabalho para a geração, o cultivo e a análise de precisão de corte tecido fatias derivado murino tumores NSCLC. Para esta demonstração, utilizamos o tumores de um modelo de rato geneticamente (GEMM), abrigando a ativação condicional de KrasG12D juntamente com a perda de Lkb1 (também conhecido como serina/treonina quinase 11), a seguir designada KL. Iniciação de tumor de reprodução e pulmão de rato foi realizada conforme descrito em26,28. Figura 2A demonstra o efeito da espessura da fatia de tecido sobre a viabilidade de fatias cultivadas por 24 h, usando uma unidade rotativa de incubação. Os resultados mostram que 160 µm de fatias finas contêm grandes áreas de necrose em toda a fatia. Além disso, 250 µm de fatias finas mostram uma necrose gradiente através da fatia em comparação com 200 µm de fatias finas. É provável que a pobre viabilidade global o mais fino 160 µm é causada por manipulação técnica durante o posicionamento das fatias em cima das redes, como estes são frágeis e tendem a enrolar. Por outro lado, quando as fatias são muito espessas, que eles podem se tornar propensos a deficiências em oxigênio ou difusão de nutrientes através das fatias, que em NSCLC murino explants é evidenciado como morte necrótica gradiente25. No entanto, deve notar-se que as fatias com espessuras variáveis podem ser geradas de um tumor, apesar do uso de configurações de vibratome idênticos. Portanto, é aconselhável analisar várias réplicas de amostras diferentes de tumor. Importante, cada tipo de tecido requer otimização de espessura fatia para alcançar viabilidade máxima, como a textura do tecido e a dureza podem afetar o fluxo de nutrientes e oxigenação. Figura 2B -2C ilustra análises quantitativas de IHC de expressão NKX2-1, um marcador de adenocarcinoma do pulmão bem diferenciados (AC) em amostras cultivadas até 72 h e correspondido fatias 0 h. Os resultados mostram que expressão NKX2-1 não é significativamente alterado em fatias cultivadas em comparação com 0 h fatias incultos, sugerindo que o processo de cultivo abertamente não afecta o estatuto de diferenciação do tecido do tumor de AC. Figura 2D demonstra a utilidade de fatias de tecido do tumor para avaliar a eficácia das drogas específicas. Recentemente mostramos esse Kras mutante murino ACs exposição alta expressão de ERK1/2 fosforilada (marcando o aumento da atividade via MAPK) quando comparado aos tumores adenosquamous (ASC), enquanto expressão de 4EBP1 fosforilada (marcação mTOR atividade ) da mesma forma é expressa em tumores ambos AC e ASC. Para testar se estes caminhos podem ser efetivamente direcionados em fatias de tecido, fatias de tecido KL AC foram tratadas com DMSO ou titulado quantidades de compostos, ou seja, 0,1 – 1 µM dactolisib alvo via mTOR ou 0,05-0,5 µM selumetinib alvo via MAPK. Resultados mostram que 1 µM dactolisib ou 0,5 µM de selumetinib são eficazes em inibir a fosforilação de 4EBP1 ou ERK1/2, respectivamente. Além disso, a inibição dose-dependente de fosfoproteínas as alvo indica que fatias de tecido também podem ser utilizadas para validar os anticorpos específicos de fosforilação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho para estabelecimento e análise de explantes de fatia derivado de tumor murino NSCLC. (A) diagrama esquemático descrevendo a recolha e preparação dos pulmões de tumor-rolamento para fatiar. Lobos pulmonares são colhidos de um rato e tecido do tumor é dissecado do tecido normal. A seta preta e asterisco indicam aproximadamente 4 mm e tumores de 1 mm, respectivamente. A seta branca indica colado à superfície do titular da amostra de tecido pulmonar. Os pontos de seta vermelha em uma peça adicional de suporte do tecido pulmonar normal para manter o tumor em uma posição ereta. (B) Vibratome corte e coleção de fatias de tecido. Seta branca indica a direção de corte. Coleção de fatias sequenciais em uma placa de 24 contendo frio HBSS + P/S. As fatias podem ser cultivadas para pontos de tempo diferentes (aqui, 24-72 h) para avaliar a expressão do marcador do tumor-específicos durante o cultivo (linha superior), ou podem ser usadas para realizar tratamentos com drogas. C: o controle do veículo de, t: tratamento de drogas. (C) colocar o pedaço de tecido para cultivo usando unidades de incubação rotativa. Inclinar a placa de 6 até que alguma mídia cobre a parte superior da grade, coloque a fatia de tecido no meio da grade em cima do meio e espalhar a fatia usando fórceps. Certifique-se de que as placas de 6-poços são peso equilibrado para um ciclo de rotação suave. X: indica incorreto, e <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: indica o posicionamento correto da fatia. (D) fotografia do bloco FFPE de uma fatia de tumor. Pontos de seta preta na fatia de tecido parafina corados com hematoxilina. (E) esquema mostrando a ordem de corte as fatias em blocos FFPE; Essas seções podem ser processadas para avaliar a viabilidade do tecido e expressão de biomarcador de tumor-específicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figura 2: avaliação da viabilidade e histotype específicos expressão do marcador e tratamento de drogas alvo em fatias de tecido NSCLC. Imagens do (A) representante H & E de fatias de NSCLC AC das espessuras indicadas cultivadas para fatias finas de 24 h. 200 µm mantêm viabilidade melhor em comparação com 160 µm ou 250 µm de fatias finas. Azul escuro representa H & E manchada tecido viável, e rosa indica pseudocolored regiões necróticas. Azul claro indica as regiões excluídas da análise, ou devido à qualidade do tecido pobre ou presença de estroma fibrosa. T1 e T2 representam réplicas biológicas derivadas de dois tumores diferentes. Barra de escala = 500 µm. (B) representante IHC imagens de NKX2-1 expressão em fatias AC cultivadas para os pontos de tempo indicado. A seta indica a área mostrada em maior ampliação. Os resultados mostram que expressão NKX2-1 não é alterado das fatias cultivadas em comparação com fatias 0 h. Barra de escala = 500 µm e 50 µm para ampliações de altas e baixas, respectivamente. (C) a quantificação dos dados mostrados em (B). (D) representante IHC imagens de 4EBP1 fosforilada ou expressão de pERK1/2 em 0 h fatias ou fatias tratadas com DMSO ou titulado quantidades de dactolisib (dact, linha superior) ou fosforilada pERK1/2 expressão na fatia de 0 h, ou fatias tratadas com DMSO ou selumetinib (sel, linha inferior). Caixas quadradas pretas indicam áreas mostradas em maior ampliação. Barra de escala = 1 mm ou 50 µm para ampliação de alta ou baixa, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Nós fornecemos um método para a geração, cultivo e análise sistemática de fatias de organotypic derivadas de tumores de pulmão murino. Descrevemos também como otimizar para espessura da fatia e como selecionar as concentrações de drogas para tratar a fatias de tumor.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em pesquisas pré-clínicas, onde estudos de resposta a medicamentos em explants de fatias de tumores podem servir para fins diagnósticos. A principal vantagem dessa técnica é que as explanações de fatias podem por uma pequena janela de tempo modelar a biologia complexa dos tecidos nativos, incluindo funções espacialmente distribuídas. Embora este método possa fornecer informações sobre o uso de fatias de tumores pulmonares murinos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, incluindo tecidos humanos.Para começar, prepare o vibratome e realize um VibraCheck de acordo com as instruções fornecidas no manual. Em seguida, encha cada poço da placa de 24 poços com um mililitro da solução de sal balanceado hank-s complementada com penicilina e estreptomicina e mantenha a placa no gelo. Insira agulhas de calibre 25 nas quatro patas de um rato eutanizado colocado em uma tampa de isopor para que o peito seja exposto e o animal seja esticado.Pulverizar 70% de álcool na superfície da pele exposta. Use uma tesoura colocada em posição angulada para cortar a pele do abdômen em direção ao peito e até a região do pescoço. Estique a pele de ambos os lados usando fórceps e insira agulhas de calibre 25.Abra a região abdominal. Em seguida, abra a caixa torácica e o diafragma para expor o pulmão e o coração. Exponha a traqueia cortando o tecido circundante.Dissecar os pulmões, junto com o coração. Coloque os tecidos em um tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de HBSS gelado suplementado com Pen-Strep colocado no gelo e prossiga para o próximo passo o mais rápido possível. Agora transfira os pulmões portadores de tumores para uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros.Use tesouras estéreis e fórceps para separar os lóbulos pulmonares e selecionar lóbulos com tumores na superfície para cortar. Coloque um lobo pulmonar com um tecido tumoral em um pedaço de papel filtro para evitar escorregar e cortar parte do pulmão normal ou tecido tumoral adicional que envolve o tumor usando um bisturi estéril para gerar uma superfície de peça de tecido plano. Mergulhe o lado plano em uma gota de adesivo de cianoacrilato e monte-o no suporte da amostra de vibratome para que o tumor fique de frente para a lâmina em uma posição vertical, e deixe secar por dois a três minutos.Coloque o suporte da amostra vibratome na bandeja de tampão de metal. Encha a bandeja com HBSS frio suplementado com Pen-Strep até que o tecido esteja imerso no tampão. Cubra a bandeja de tampão com a tampa plexiglas que é fornecida com o instrumento e coloque a bandeja em um banho de gelo branco e adicione gelo para manter o tecido frio durante o corte.Coloque o banho de gelo branco no vibratome. Em seguida, selecione as configurações de corte adequadas e comece a cortar. Leve a lâmina vibratome para a posição de corte e ajuste a janela de corte.Use fórceps estéreis para coletar as fatias em uma placa de 24 poços cheias de um mililitro de HBSS suplementado com Pen-Strep por poço e manter no gelo. Enquanto acompanha a ordem de corte, marque cada poço da placa de 24 poços de acordo com o plano experimental. Colete uma fatia de tecido adjacente às fatias cultivadas como uma referência zero horas ou não cultivada.Colete pelo menos três fatias de referência para representar a parte superior, central e inferior do tecido. E uma vez que o corte é concluído, continue com a fixação e processamento. Depois disso, prepare uma placa de seis poços contendo 2,5 mililitros de cultura média por poço colocando grades de titânio nele.Certifique-se de que não se formem bolhas de ar entre a rede de titânio e o meio. Para carregar uma fatia na grade mantenha a placa de seis poços em uma posição angular para que uma parte do meio cubra a grade. Em seguida, coloque a fatia no meio na grade e use fórceps para espalhá-la.Após colocar as fatias, carregue as placas de seis poços na unidade de incubação rotativa colocada dentro de uma incubadora umidificada mantida a 37 graus Celsius com 95%02 e 5%CO2. Inicie o ciclo de rotação. Para o cultivo de longo prazo reabastecer o meio de cultura todos os dias usando fórceps estéreis para levantar a grade contendo as fatias de tecido e colocá-la em um poço vazio da placa de seis poços.Substitua 70% do meio por meio de cultura fresca e coloque a grade de volta. Continue o ciclo de rotação como anteriormente. Para o tratamento medicamentoso nas fatias tumorais adicione 2,5 mililitros de mídia com a droga diluída ou controle do veículo na placa de seis poços.Coloque as grades de titânio nos poços e, em seguida, coloque as fatias nas grades como feito anteriormente. Após a realização dos tratamentos por 24 horas, continue com a fixação e o processamento. Para começar a fixar a fatia desejada transfira-a cuidadosamente usando fórceps em uma placa de 10 centímetros contendo um papel de filtro encharcado cheio com PBS de dois a três mililitros e deixe-o flutuar.Em seguida, levante o papel filtro com um par de fórceps e coloque-o em um histo. Transfira o papel do filtro para uma fita histo. Adicione uma gota de hematoxilina diluída em cima da fatia de tecido para marcar a posição da fatia para os passos subsequentes.Feche o e transfira-o para uma solução de formalina tamponada 4% neutra e deixe durante a noite a quatro graus Celsius. Após a lavagem e processamento do, conforme descrito no protocolo, abra o histo e use um bisturi para levantar cuidadosamente a fatia fixa do papel filtro. Descarte o papel do filtro e transfira a fatia em um molde contendo parafina líquida.Use um peso plano para pressionar o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação para garantir a secção uniforme. Coloque a parte inferior do histo em cima do molde. Adicione parafina líquida em cima dela.E deixe o molde esfriar em uma placa fria por 30 minutos. Depois disso, separe o molde resfriado do bloco de parafina. Use um microtoma para preparar seções finas de quatro micrômetros dos blocos de fatia de tecido FFPE.Corte o excesso de parafina ao redor do tecido. Para obter seções uniformes ao longo do tecido ajuste o ângulo do bloco para que a superfície do bloco seja orientada horizontalmente em relação à lâmina. Utilizando uma escova fina coletar sequenciais sequenciais sequenciais seções da fatia de tecido embutido na parafina, começando na parte superior das lâminas de vidro.Continue coletando as seções das camadas de tecido mais profundas para o meio, seguido pela parte inferior das lâminas de vidro. A coleta de seções de diferentes camadas de cada fatia de tecido aos slides do objeto é feita para permitir a captura de gradientes potenciais induzidos pela cultura em viabilidade, migração celular ou expressão biomarcadora. Após a coleta das seções continuam com seu processamento e análises posteriores, conforme descrito no protocolo.A espessura da fatia de tecido pode influenciar a viabilidade de fatias cultivadas. Neste caso, fatias de 250 micrômetros de espessura mostram aumento dos gradientes de necrose em comparação com fatias de 200 micrômetros de espessura devido a fatias mais grossas se tornando propensas a deficiências de oxigênio ou difusão de nutrientes nas fatias. No entanto, fatias finas de 160 micrômetros contêm grandes áreas necróticas provavelmente causadas pelo manuseio técnico durante o posicionamento das fatias, pois estas são frágeis e tendem a enrolar.A análise do NKX2-1, um marcador de adenocarcinoma pulmonar bem diferenciado, mostra que sua expressão não é significativamente alterada em fatias cultivadas em comparação com zero hora de fatias não cultivadas. A análise quantitativa da expressão NKX2-1 confirmou ainda que a expressão não foi significativamente alterada em fatias cultivadas versus não cultivadas, sugerindo que o processo de cultivo não afeta visivelmente o status de diferenciação do tecido adenocarcinoma. Para testar se as fatias de tecido tumoral podem ser usadas para avaliar a eficácia de medicamentos-alvo, foram tratadas com DMSO ou quantidades tituladas de compostos.Quando tratado com um dactolisib micromolar que tem como alvo a fosforilação da via mTOR de 4EBP1 foi inibida. 0,5 micromolar selumetinib que tem como alvo a via quinase MAP foi eficaz na inibição da fosforilação de ERK1/2. Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como trabalhar e analisar criticamente fatias recém-cortadas de tecidos tumorais preciosos.Nossa ex-pós-doutora, Katja Narhi, contribuiu significativamente para o estabelecimento desse método em colaboração com colegas da Plataforma de Fatia de Tecido do Consórcio Predect IMI.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...