Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Это исследования работы получили финансовой поддержке инновационных лекарств Инициатива совместных действий Грант соглашение no 115188, программу докторантуры Хельсинкского университета в биомедицине стипендий (A.S.N.) и Сигрид Juselius и Орион Farmos основы (E.W.V.). Мы искренне благодарим наших членов консорциума Платформа PREDECT ткани ломтик (Taija Аф Хёльстрём и Siv Knaappila за поддержку в создании системы ротатор и Рику Туркки для поддержки с анализом MATLAB. Сиро Jouko поблагодарил для захвата фотографий на рисунке 1. Мы благодарим FIMM WebMicroscope команды для сканирования гистологические слайды, и поддержки центра лабораторных животных для животноводства.

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Различные комплекс в vitro опухоли, включая 3D культур и organoids, были разработаны модели для пилки архитектуры и онкогенных функции в vivo опухоль ткани29,30. Тем не менее создание 3D культур или organoids включает в себя ткани диссоциации и селективный рост типа одной ячейки или совместного культуры выбрать несколько типов клеток в искусственной среде. Как следствие такие модели неполно захватить тонкости опухоли неоднородность и опухоли стромы взаимодействий. Organotypic опухоли фрагменты, с другой стороны, сохранить ткани архитектуры и биологического сложностей в situ опухоли, без большой манипуляции. Эта способность тканей срезы для модели опухолевых клеток в их родной микроокружения делает их особенно привлекательными для доклинических исследований. Мы сообщалось ранее Оптимизированный рабочий процесс для создания и анализа точности надреза опухоли фрагментов, и показал, что, по сравнению с фильтр поддерживает, блоком вращающихся инкубации улучшить жизнеспособность краткосрочных мышиных НМРЛ ломтик культур25 , 31. Однако, выращивание на вращающихся единиц является технически сложным и требует постоянного контроля. Мы здесь представляем протокол для поколения срез ткани опухоли и практическое использование вращающихся инкубационный блок к их культуре, а также сопровождающих методы мониторинга ломтики возможность захвата в situ опухоли биологии, предпосылкой до наркотиков Ответ тестирования.
Несколько важных шагов в протоколе обеспечения целостности тканей и жизнеспособности опухоли фрагменты. Если нормальной легочной ткани окружает опухоли, vibratome может генерировать фрагменты с несовместимым толщиной или повредить ломтики, из-за различия в текстуре и жесткость нормальных и опухолевых тканей. Таким образом важно удалить окружающие нормальной легочной ткани до нарезки опухоли. Другим важным шагом является Толщина нарезки, которая должны быть тщательно оптимизированы для каждого типа ткани. Кроме того после нарезанный, важно, что срез размещается примерно в середине сетки, поэтому для обеспечения точной прерывистый погружения в питательной среды и воздействия кислорода. Наконец важно следовать позиции ломтиком период его вращения, как кусочек может опускаться среду; Если это произойдет, дальнейшие действия могут быть приняты как описано в шаге 3.6 протокола.
В дополнение к обработке для обеспечения целостности тканей есть также важные шаги в анализе IHC интерпретировать как фрагмент напоминает родной ткани. Наши предыдущие исследования показали, что мышиных НМРЛ опухоли exhibit пространственная неоднородность произносится интра опухоль в онкогенные сигнальные деятельности26. Это означает, что использование пространственно различных тканей ломтиками для элементов управления или образцы наркотиков лечение может повлиять на интерпретацию надежных экспериментальных данных, и следовательно тесно прилегающих фрагментов должен использоваться как элементы управления и испытательных образцов. Мы также показали, что во время распространения или онкогенных фосфоропротеид выражение в свежесрезанных uncultured 0 h ломтики были аналогичны в situ опухоли, культивировали срезы показали изменены онкогенных фосфоропротеид выражение, специально измененной p4EBP1 Кроу, а также изменены распространения анализируемой Ki67 IHC. Изменены p4EBP1 выражение аналогично был обнаружен в 24 h человека НМРЛ и рак простаты ломтик культур (Narhi et al., дополнительная цифра S3B-S3C, S5 и S7)26. Эти выводы одобрить, что сравнение культивированный ломтики с их ближайших uncultured фрагмент 0 h имеет решающее значение для оценки сохранения в situ функций опухоли в культивированный ломтиками.
Несмотря на улучшение жизнеспособности organotypic ломтиками25, есть ограничения с системой ротатор с точки зрения технических аспектов. Размещение фрагментов ткани на Титан сетки является более сложным по сравнению с фильтрации вставок и блоком вращающихся инкубации могут быть недоступны. В качестве альтернативы застойные фильтр поддерживает могут быть использованы, но в этом случае только воздух облученных сторону срезы должны быть проанализированы, как воздух фильтр градиенты в жизнеспособности и гипоксии, измеряется HIF1α выражение быстро образуются в поддержке фильтр среза культуры (Дэвис и др., рисунок 5 и Рисунок 7а и 7B)25. Далее мы показали, что опухоль ломтик культур могут exhibit изменены распространения и онкогенные сигнальные деятельности, по сравнению с их родной опухоли26, возможно из-за ранозаживляющим ответы или метаболической адаптации фрагментов для ex vivo культура32. Хотя грубые морфологические особенности опухолей мышиных НМРЛ были сохранены в течение 72 ч культивирования, культуры индуцированной пролиферативные изменения могут повлиять на точной классификации обрабатываемые ломтиков. Таким образом кусочки ткани следует использовать только для краткосрочных функциональных исследований.
Использование блоком вращающихся инкубации по крайней мере частично спасает интра ломтик жизнеспособности или биомаркер выражение градиенты, особенно в течение первых 24 ч культуры. После проверки целостности и функции, это обеспечивает материал ткани для функциональных исследований, например исследований лечения наркотиков. В дополнение к наркологических ответ, изменены конечным выражением, после лечения также могут воспользоваться антитела проверки. Это особенно актуально для обнаружения мышиных epitopes с мышиных моноклональных антител, как эти, как правило, дают высокие окрашивания фона. Кроме того для достижения надежных и воспроизводимых данных в диагностических и клинических параметров требуются хорошо проверенных антител. Таким образом модуляция изобилия или фосфорилирования соответствующей epitopes после медикаментозного лечения в срезах тканей обеспечивает удобный практическое применение в антитела проверки. Основным преимуществом культур кусочек опухоли является способность модели пространственно распределенных функций, включая онкогенные сигнальные деятельности или ответ наркотиков в опухоли или стромальных клеток, что делает их привлекательным ex vivo модель. Однако фрагменты вращаться во время выращивания, и процесс выращивания далее может повредить ткани особенно на краях. Это поэтому сложно точно оверлей биомаркер окрашенных IHC изображения срезов 0 h с некротическими регионами обнаружен искусственный ломтиками, который подрывает способность точно связать пространственные биомаркер деятельности ответ наркотиков. Кроме того опухоль внутренние, культуры индуцированной и лекарственно индуцированные некротические ответы неразличимы по крайней мере в мышиных кусочки ткани НМРЛ, ущерба точный количественный пространственных наркотиков ответов. Наконец использование опухоли ломтик культур позволяет исследователь на тест несколько соединений на же опухоли, без необходимости для лечения животных, таким образом переработки, сокращение и замене экспериментов на лабораторных животных.
Как будущее приложение описанных протокол можно было принять образцы клинических твердые опухоли. Ткани типа зависимые изменения или оптимизации требуются дополнительные вероятно, начиная с корректировки параметров vibratome, включая срез толщины и вибрации скорость оптимизировать эти опухоли текстуру или жесткость. Кроме того питательных веществ и фактор роста требования могут отличаться для различных опухолевых тканей. В качестве примера ломтики рака молочной железы было культивированный с инсулином, дополнена в средних13,18. Учитывая, что ограниченные ткани материал получается во время операции или биопсии, оптимизация опухоли пациента производные ломтик культур может быть сложным из-за трудностей в получении достаточного количества повторных выборок. Кроме того воспроизводимость данных также оспаривается произносится неоднородность пациента к пациенту образца, особенно в процентах опухолевых клеток против фиброзных регионов или стромы инфильтраты, а также компоненты некротических тканей. Наконец применение опухоли фрагменты в диагностических параметров потребует расследование степени наркотиками ответы в ломтик эксплантов предварительной обработки биопсий матчей после лечения в vivo ответов.

Тканей твердых опухолей, включая рак легких, экспонат генетических и фенотипической неоднородности и гавани комплекс микросреды1,2. Взаимодействие между опухолевых клеток и их окружающие влияния микроокружения на наркотиков чувствительность и сопротивления механизмы3. Это подчеркивает необходимость для доклинических моделей, которые можно точно модель биологической сложности и функции, действуя в родной опухоли. Точность cut ломтики непосредственно производным от свежих опухоли обеспечивают уникальный ресурс, как они имеют основные возможности представлять в vivo биологии, по крайней мере на короткий промежуток времени, в том числе фенотипов пространственно распределенных в отдельных опухоли. Резекции клинических опухоли являются одной из немногих персонализированные образцов, которые могут быть получены от больного раком, и их диагностики использования заслуживает изучения.
Истории organotypic культуры восходит кначале 19 века, когда человека внутричерепной опухоли были руки разрезать на куски ткани и культивировали, используя так называемый висит метод drop. Фрагменты тканей были прикреплены к coverslip и возможность окунуться в гепаринизированным человеческой плазмы, после чего coverslips были инвертированы, опечатаны и культивировали несколько недель4. Вручную вырезать опухоль штук с были культивируемых с помощью целого ряда других методов, таких как плазмы сгустки5, в жидких средах6, или на 0,45 мкм поры размер фильтры6. Термин «organotypic» был впервые использован в 1954 году, в исследование сетчатки дифференциация куриных эмбрионов глаз7. Это последовало исследования, используемые эксплантов ткани легких и сердца, производный от куриных эмбрионов8и мозг эксплантов от взрослых крыс9.
Различные нарезки методы были описаны, а именно ручной чопперы10,11, Krumdieck ткани среза12,13и vibratomes11,14,15, 16. Срез ткани Krumdieck генерирует сердечников цилиндрических ткани, которые затем нарезанный ломтиками круговая ткани, используя микротом. Vibratome, с другой стороны, использует вибрирующий микротом лезвия. В исследовании на кусочках печени было показано, что Leica vibratome генерирует более воспроизводимые и последовательной ломтиками, по сравнению с Тесак Krumdieck15. Были использованы толщины срез, начиная от 250 до 500 мкм, и исследования доклад поддержания жизнеспособности и морфологические особенности даже до 16 дней14,10,17,18. Однако опухоли имеют переменную метаболические профили, которые могут повлиять на потребности в питательных веществах, и такие параметры, как жесткость и матрица состав ткани могут влиять на поток питательных веществ и аэрации. Поэтому вполне вероятно, что каждый тип ткани требует оптимизации условий нарезки и культуры.
Различные культивирования методы были использованы для поддержки ломтик культур: я) стационарные межфазной культуры, также называется застойной поддержки культуры, в которой фрагментов помещаются поверх полу пористые мембраны Вставка, погруженный в среде культуры. В этом в верхней части ломтики подвергается воздействию воздуха, в то время как внизу дополняется питательные вещества через пористые вставки14,19; II) шпатель метод, первоначально разработанные для культуры целые органы или фрагментов эмбриональной ткани. В этом фрагментов помещаются поверх листа хлопка или фильтр, поддерживаемых металлической сеткой, и фильтр замачивают в культурной среде. Чтобы сохранить влажной ткани, тонкий слой среднего добавляется поверх фрагментов20,21,22. Эти первые два являются так называемые воздуха жидкость межфазной культур; III) ролик трубки культур, в которых фрагменты помещены внутри плоской стороне пластиковой трубки, содержащих среднего, и медленно труба вращения гарантирует, что ткань покрыта средне во время первой части цикла, или пористый во второй23; IV) вращающейся инкубации единицы, в которых фрагменты периодически подвергаются воздействию среды питательными веществами и аэрации. Отличается от прямошовных труб, в этом методе, фрагменты помещены на вершине пористых титановых сеток в 6-ну пластины с питательной среды24.
Фрагменты тканей производным от резекции солидных опухолей логически настоящей привлекательным ex vivo модель, в которой для проверки реакции лечение анти-рак агентов, как они разрешают оценки жизнеспособности, целевой путь активность и молекулярных профили конкретной опухоли в присутствии его родной опухоли микроокружения. Однако оценить ли ответы наркотиков, измеряется в опухоли фрагменты прогнозирования в situ ответов, важно оценить, какие фрагменты тканей степени сохранить опухоль – специфичные биологических функций, таких как пролиферации клеток, Гистопатология конкретных клеток или онкогенные сигнальные деятельности. Влияние механического стресса, вызвало во время подготовки срез, ломтик обработки или культуры индуцированной приспособления как качества, так и биологических функций кусочков ткани являются фундаментальные вопросы, тесно связаны с способность осуществлять опухоли производные фрагменты для функциональной диагностики.
Наш IMI-финансируемые консорциум проекта PREDECT (http://www.predect.eu) излагаются систематически адрес эти фундаментальные вопросы, изучая эксплантов фрагментов из различных источников. Использование фрагментов, полученных от модели рака груди, простаты и легких, эти совместные усилия используются качественные read-outs, а также количественные гематоксилином и эозином (H & E) - на основе показаний продемонстрировать требование для атмосферного кислорода и застойные фильтр опоры для поддержания жизнеспособности культивированный срезов до 72 ч. Кроме того, иммуногистохимия (IHC) анализы на искусственный ломтики показали интра фрагментные жизнеспособность градиенты, свидетельствует в градиенты некроза в фрагментов, полученных из мышиных немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), эстрогеновый рецептор (Эр), HIF1α и γH2AX градиенты в ломтики рака груди, или андрогенных рецепторов (АР) выражение градиенты в рак простаты фрагменты25. Интересно, что внутри ломтик жизнеспособности градиенты в 24 h культур мышиных НМРЛ были спасены культивирования в блоком вращающихся инкубации, и наши недавние исследования показали, что жизнеспособность был продлен до 72 ч26. Особенности верхней стороне остается наиболее жизнеспособным26, одобрив, что ответ анализа наркотиков на ломтики лучше всего осуществляется на этой стороне ткани.
Хотя он по-прежнему остается вопрос о том, как далеко кусочки ткани можно резюмировать в situ функции опухоли, они широко используются для проверки ответов на анти-рак агентов, включая целевые наркотики, моноклональных антител и химиотерапевтических агентов 10,11,13,14,18,27. Мы недавно показал, что мышиных НМРЛ ломтики Показать динамические изменения в распространение и онкогенных сигнальной деятельности после выращивания по сравнению с свежесрезанных 0 h ломтиками26. Это означает, что важно расследовать ли целевой в situ биологические функции надлежащим образом сохраняются во время выращивания, до исследования возмущений. Несмотря на эти выводы, мы показали, что опухоли фрагменты можно моделировать пространственное ответ целевой терапии, среди наркотиков, лечения остаются краткое (24 ч) и начато в самом начале культивирования26. Следующий протокол описывает важные проверки аспектам, касающимся создания и анализа культур кусочек опухоли, до их применения в фармакологических Наркологическая экспертиза.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic основной ткани экспланта культур, которые включают точность резки ломтиками, представляют архитектуру трехмерной (3-D) ткани, а также многоклеточных взаимодействия родной ткани. Кусочки ткани немедленно вырезать из свеже резекции опухоли сохранить пространственных аспектов неоднородности intratumor, таким образом делая их полезным суррогаты в vivo биологии. Осторожны, оптимизация условий подготовки и культивирования срез ткани имеет основополагающее значение для прогнозирования диагностический потенциал опухоли срез эксплантах. В этой связи мышиных моделях являются ценными, поскольку они обеспечивают последовательного потока материала опухоли для выполнения репликации и воспроизводимость экспериментов. Этот протокол описывает культивирования мышиных легких тканей, опухоли, полученных фрагментов с помощью блоком вращающихся инкубации, систему, позволяющую периодически воздействия тканей кислородом и питательными веществами. Наши предыдущие работы показали, что использование вращающихся инкубации единиц повышает жизнеспособность по сравнению с другими методами культуры, особенно плавающие фрагменты тканей и застойные фильтр поддерживает. Здесь, мы также показывают, что толшины влияет на жизнеспособность культивировали срезов, предполагая, что оптимизация толшины должно быть сделано для типов различных тканей. Произносится как ITH в соответствующих онкогенных функций, таких как сигнальный деятельности, стромальных клеток инфильтрата или выражение дифференциации маркеров, требует оценки фрагментов прилегающих тканей для выражения маркеров, изменено, медикаментозное лечение или культивирование, сам. Таким образом этот протокол описывает поколения мышиных легкого опухолевые фрагментов и их культура на блоком вращающихся инкубации и демонстрирует, как ломтики следует систематически анализировать для выражения маркеров разнородных тканей, как предварительное условие до исследования ответ наркотиков.

Рисунок 1 представляет рабочий процесс для поколения, выращивания и анализа точности надреза ткани фрагментов, полученных из мышиных НМРЛ опухоли. Для этой демонстрации мы использовали опухоли из генетически мыши модели (ГЭММ), укрывательство условного активации KrasG12D вместе с потерей Lkb1 (также известный как Серин/треонин киназу 11), называемой ФОК Мышь селекции и легких опухоль начала была выполнена, как описано в26,28. Рисунок 2A демонстрирует влияние толщины срез ткани на жизнеспособность культивировали в течение 24 ч с использованием блоком вращающихся инкубации срезов. Результаты показывают, что 160 мкм тонкими ломтиками содержат большие некротические участки через фрагмент. Кроме того 250 мкм тонкими ломтиками показывают некроза градиента через срез, по сравнению с 200 мкм тонкими ломтиками. Вполне вероятно, что бедные общей жизнеспособности тонкий 160 мкм вызванных технической обработки во время позиционирования кусочки поверх сетки, как эти хрупкие и имеют тенденцию к скручиванию. С другой стороны когда фрагменты слишком густой, они могут стать подверженным недостатки в кислорода и питательных веществ диффузии через срезы, который в мышиных НМРЛ эксплантах свидетельствует как некротическая смерть градиента25. Следует, однако, отметить, что фрагменты с переменной толщины могут быть сгенерированы из одной опухоли, несмотря на использование одинаковых vibratome параметров. Поэтому рекомендуется проанализировать несколько реплицирует из образцов различных опухоли. Важно каждый тип ткани требует оптимизации толщины срез для достижения максимальной жизнеспособности, как текстура ткани и твердость может повлиять на оксигенации и поток питательных веществ. Рисунок 2B -2c иллюстрирует количественный анализ IHC выражения NKX2-1, маркер высокодифференцированных легких аденокарциномы (AC) в образцах культивируемых до 72 ч и соответствует 0 h ломтиками. Результаты показывают, что NKX2-1 выражение существенно не изменяется в культивированный ломтика по сравнению с 0 h uncultured ломтиками, предполагая, что процесс выращивания открыто не затрагивает статус дифференциация переменного тока опухолевой ткани. 2D рисунок демонстрирует полезность кусочки ткани опухоли для оценки эффективности целевых препаратов. Недавно мы показали что крас мутант мышиных ACs экспонат высокое выражение фосфорилированных ERK1/2 (маркировка повышенная активность MAPK путь) по сравнению с железисто (ASC) опухоли, а выражение фосфорилированных 4EBP1 (маркировка mTOR активность ) аналогичным образом выражается в переменного тока и ASC опухоли. Для проверки, если эти пути могут быть эффективно нацелены на кусочки ткани, кусочки ткани KL AC лечили ДМСО или титруют количество соединений, а именно: 0,1 – 1 мкм dactolisib целевой путь mTOR или 0,05 – 0,5 мкм selumetinib целевой MAPK путь. Результаты показывают, что 1 мкм dactolisib или 0,5 мкм selumetinib эффективны в подавлении фосфорилирование 4EBP1 или ERK1/2, соответственно. Кроме того дозозависимый ингибирование целевых фосфолипопротеиновый указывает, что фрагменты тканей также могут быть использованы для проверки фосфорилирования специфические антитела.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса для создания и анализа мышиных НМРЛ опухоли производные ломтик эксплантов. (A) схема описания сбора и подготовки опухоли подшипник легких для нарезки. Долях легких собирают от мыши и опухолевой ткани рассекается от нормальной ткани. Черные стрелки и звездочки указывают на примерно 4 мм и 1 мм опухоли, соответственно. Белая стрелка указывает легочной ткани на приклеены к поверхности держателя образца. Красная стрелка указывает на дополнительную часть нормальной легочной ткани поддержки сохранить опухоли в вертикальном положении. (B) Vibratome нарезки и сбор кусочков ткани. Белая стрелка указывает направление нарезки. Совокупность последовательных фрагментов в 24-ну плиту содержащие холодной HBSS + P/S. Ломтики может быть культивировали для различных временных точек (здесь, 24-72 ч), чтобы оценить выражение опухоль – специфичные маркер во время выращивания (верхняя строка), или может использоваться для выполнения медикаментозного лечения. C: транспортного средства контроля, T: медикаментозное лечение. (C) размещение кусочек ткани для выращивания с использованием вращающихся инкубации единиц. Наклона пластины 6-Ну так, что некоторые среды охватывает в верхней части сетки, Поместите кусочек ткани в середине сетки поверх среды и распространение фрагмента, используя пинцет. Обеспечить 6-ну пластины вес, баланс для плавного вращения цикла. X: указывает неправильный, и <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: указывает правильное позиционирование фрагмента. (D) фотография блока FFPE кусочек опухоли. Черная стрелка указывает на фрагмент парафин врезанных тканей, окрашивали гематоксилином. (E) схемы, показаны порядок секущей ломтики в FFPE блоков; Эти разделы могут быть обработаны для оценки жизнеспособности тканей и опухоль – специфичные биомаркер выражение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Рисунок 2: оценка жизнеспособности и histotype специфических маркеров выражение и целевых медикаментозное лечение на кусочках ткани НМРЛ. (A) представитель H & E изображения переменного тока NSCLC ломтики указанной толщины, культивированный за 24 ч. 200 мкм тонкими ломтиками поддерживать лучше жизнеспособность по сравнению с 160 мкм и 250 мкм тонкими ломтиками. Темно-синий представляет жизнеспособных ткани запятнанных H & E и розовый показывает pseudocolored некротических регионов. Светло-голубой указывает регионы, исключены из анализа, либо из-за плохой ткани качества или наличием фиброзной стромы. T1 и T2 являются биологические реплицирует производным от двух различных опухолей. Шкалы бар = 500 мкм. (B) представитель IHC изображения NKX2-1 выражение в AC ломтиками, культивированный для указанного времени точек. Стрелка указывает области показано увеличение. Результаты показывают, что NKX2-1 выражение не изменено культивировали ломтиками, по сравнению с 0 h ломтиками. Шкалы бар = 500 мкм и 50 мкм для низких и высоких увеличениях, соответственно. (C) количественной оценке данные, показанные в пункте (B). (D) представитель IHC фото фосфорилированных 4EBP1 или pERK1/2 выражение в 0 ч ломтики, ломтики относились с ДМСО или титруют количество dactolisib (dact, верхний ряд) или фосфорилированных выражение pERK1/2 в 0 ч фрагмента или фрагментов, относились с ДМСО или selumetinib (sel, нижней строке). Черные квадратные коробки указывают области показано увеличение. Шкалы бар = 1 мм или 50 мкм для низких или высоких увеличение, соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Мы предоставляем метод для генерации, выращивания и систематического анализа organotypic фрагментов, полученных от опухоли мышиных легких. Мы также описывают, как оптимизировать для толшины и как выбрать концентрации препарата для лечения опухоли фрагменты.

Создание и анализ кусочек опухоли эксплантах как предпосылкой для диагностики

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в доклинкологических исследованиях, где исследования реакции на наркотики в эксплантах ломтика опухоли могут служить диагностическим целям. Основным преимуществом этого метода является то, что ломтик explants может в течение короткого периода времени моделировать сложную биологию родных тканей, включая пространственно распределенные функции. Хотя этот метод может дать представление об использовании ломтиков от опухолей легких мурина, он также может быть применен к другим типам тканей, включая человеческие ткани.Для начала подготовьте виброметр и выполните VibraCheck в соответствии с инструкциями, предусмотренными в руководстве. Затем заполните каждый колодец 24-хорошо пластины с одним миллилитром сбалансированного соленого раствора Хэнка дополняется пенициллин и стрептомицин и держать пластину на льду. Вставьте 25-го калибра иглы во всех четырех лапах усыпляемой мыши, помещенной на крышку пенополистирола, так что грудь подвергается и животное растягивается.Спрей 70% алкоголя на поверхности открытой кожи. Используйте ножницы, помещенные в угловое положение, чтобы разрезать кожу от живота к груди и до области шеи. Растянуть кожу с обеих сторон с помощью типсов и вставить 25-го калибра иглы.Разрежьте область живота. Затем разрежьте грудную клетку и диафрагму, чтобы разоблачить легкие и сердце. Разоблачить трахею, отрезав окружающие ткани.Рассекают легкие вместе с сердцем. Поместите ткани в 50-миллилитровую трубку, содержащую 30 миллилитров ледяного HBSS, дополненную Pen-Strep, помещенной на лед, и как можно быстрее перейти к следующему шагу. Теперь перенесите опухоленосные легкие в 10-сантиметровую пластину культуры тканей.Используйте стерильные ножницы и миппы, чтобы отделить легочные доли и выбрать доли с опухолями на поверхности для нарезки. Поместите легочную долей с опухолевой тканью на лист фильтровальной бумаги, чтобы избежать скольжения и вырезать часть нормального легкого или дополнительной опухолевой ткани, которая окружает опухоль с помощью стерильного скальпеля для создания плоской поверхности ткани. Опустите плоскую сторону в каплю клея цианоакрилата и смонтировать его на держатель образца вибромы так, чтобы опухоль лицом к лезвию в вертикальном положении, и дайте ему высохнуть в течение двух-трех минут.Поместите держатель образца вибромы в металлический буферный лоток. Заполните лоток холодным HBSS, дополненным Pen-Strep, пока ткань не будет погружена в буфер. Обложка буфер лоток с крышкой Plexiglas, который предоставляется с инструментом и поместить лоток в белую ледяную ванну и добавить лед, чтобы сохранить ткань прохладной во время нарезки.Прикрепите белую ледяную ванну к виброме. Затем выберите подходящие настройки нарезки и начните нарезку. Принесите лезвие вибромы в положение нарезки и установите нарезанное окно.Используйте стерильные типсы, чтобы собрать ломтики в 24-хорошо пластины заполнены одним миллилитров HBSS дополняется Pen-Strep за колодец и держать на льду. Отслеживая порядок нарезки, отметь каждый колодец из 24-хорошо пластины в соответствии с экспериментальным планом. Соберите кусочек ткани, прилегающий к культурным ломтикам, в качестве нулевого часа или некультурной ссылки.Соберите по крайней мере три эталонных ломтика, чтобы представлять верхнюю, центральную и нижнюю часть ткани. И как только нарезка завершена, продолжайте чинить и обрабатывать. После этого подготовьте шестиясную пластину, содержащую 2,5 миллилитров среды культуры на колодец, поместив в нее титановые сетки.Убедитесь, что между титановой сеткой и средой не образуются пузырьки воздуха. Чтобы загрузить срез на сетку держать шесть хорошо пластины в угловом положении, так что часть среды охватывает сетку. Затем поместите срез в среду на сетку и использовать типсы, чтобы распространить его.После размещения ломтиков загрузите шесть пластин на вращающийся инкубационный блок, расположенный внутри увлажненные инкубатора поддерживается на 37 градусов по Цельсию с 95%02 и 5%CO2. Запустите цикл вращения. Для длительного культивирования пополнить культуру среды каждый день с помощью стерильных типсов, чтобы поднять сетку, содержащую ломтики ткани и поместить его в пустой колодец из шести хорошо пластины.Замените 70% среды свежей средой культуры и поместите сетку обратно. Продолжить цикл вращения, как и раньше. Для медикаментозного лечения на ломтиках опухоли добавьте 2,5 миллилитров носителя с разбавленным препаратом или контроль транспортного средства в шести-хорошо пластины.Поместите титановые сетки в скважины, а затем поместите ломтики на сетки, как это было сделано ранее. После выполнения процедур в течение 24 часов, продолжить фиксацию и обработку. Чтобы начать фиксацию желаемого ломтик тщательно передать его с помощью типсов в 10-сантиметровую пластину, содержащую пропитанную фильтровальную бумагу, наполненную двумя-тремя миллилитров PBS и дайте ему плавать.Затем поднимите фильтровальную бумагу с парой типсов и поместите ее в кассету с гисто. Перенесите фильтровальную бумагу в кассету с гисто. Добавить каплю разбавленного гематоксилина на верхней части ткани ломтик, чтобы отметить положение ломтик для последующих шагов.Закройте кассету и перенесите ее в 4%нейтральный буферный раствор формалина и оставьте на ночь при четырех градусах по Цельсию. После мытья и обработки кассеты, как описано в протоколе, откройте кассету с гисто и используйте скальпель, чтобы аккуратно снять фиксированный кусок с фильтровальной бумаги. Откажитесь от фильтровальной бумаги и перенесите кусочек в форму, содержащую жидкий парафин.Используйте плоский вес, чтобы прижимать ткань к нижней части встраивания формы для обеспечения даже секции. Поместите нижнюю часть кассеты гисто поверх формы. Добавить жидкий парафин на нем.И дайте плесени остыть на холодной тарелке в течение 30 минут. После этого отделить охлажденую плесень от парафин блока. Используйте микротом для подготовки четырехмиметровых тонких секций блоков ткани FFPE.Обрезать избыток парафина, окружающего ткани. Для получения овых секций по всей ткани отрегулируйте угол блока так, чтобы поверхность блока была горизонтально ориентирована по отношению к лезвию. С помощью тонкой кисти собирайте последовательные участки тканей парафиновой ткани, начиная с верхней части стеклянных слайдов.Продолжить сбор разделов глубоких слоев ткани к середине, а затем в нижней части стеклянных слайдов. Сбор секций из разных слоев каждого среза ткани на слайды объекта делается для того, чтобы можно было зафиксировать потенциальные градиенты, вызванные культурой, в жизнеспособности, миграции клеток или выражении биомаркеров. После сбора разделов продолжить их обработку и дальнейший анализ, как описано в протоколе.Толщина ломтика ткани может повлиять на жизнеспособность культурных ломтиков. В этом случае, 250-микрометров толщиной ломтики показывают увеличение градиентов некроза по сравнению с 200-микрометров толщиной ломтики из-за толще ломтики становятся склонными к дефициту кислорода или диффузии питательных веществ через ломтики. Тем не менее, 160-микрометровые тонкие ломтики содержат большие некротические области, вероятно, вызванные технической обработкой во время позиционирования ломтиков, поскольку они хрупкие и имеют тенденцию к завитку.Анализ NKX2-1, маркера хорошо дифференцированной аденокарциномы легких, показывает, что его экспрессия не изменяется существенно в культурных ломтиках по сравнению с нулевым часом некультурных ломтиков. Количественный анализ выражения NKX2-1 также подтвердил, что выражение не было существенно изменено в культурных по сравнению с некультурными ломтиками, предполагая, что процесс выращивания не влияет заметно влияет на дифференциацию статуса аденокарциномной ткани. Чтобы проверить, можно ли использовать ломтики опухолевых тканей для оценки эффективности целевых препаратов, их лечили ДМСО или титровали количество соединений.При лечении одним микромоляным дактолизибом, который нацелен на фосфорилирование путей mTOR 4EBP1, был ингибирован. 0,5 микромоляного селеметинова, который нацелен на путь киназы MAP, был эффективен в ингибировании фосфорилирования ERK1/2. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как работать и критически анализировать ломтики свежевырезанные из драгоценных опухолевых тканей.Наша бывшая постдок, Катя Нари, в значительной степени способствовала созданию этого метода в сотрудничестве с коллегами из консорциума IMI Predect Tissue Slice Platform.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать<em&gt; Эпидермальный стафилококк</em&gt; И<em&gt; Mycobacterium Marinum</em&gt; Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Пробирного CFSE основе для изучения миграции мышиной кожи дендритных клеток в Опорожнение лимфатических узлов во время инфекции с<em&gt; Mycobacterium Bovis</em&gt; Кальметта-Герена

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...