Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
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Esta investigación trabajo recibió apoyo financiero de la iniciativa de medicinas innovadoras empresa común otorgar acuerdo no 115188, el programa de doctorado de Universidad de Helsinki en becas Biomedicina (A.S.N.) y la Sigrid Juselius y Orion-Farmos fundaciones (E.W.V.). Agradecemos sinceramente a nuestros miembros del consorcio plataforma PREDECT tejido rebanada (Taija af Hällström y Siv Knaappila para apoyo en el sistema de rotor y Riku Turkki para la ayuda con el análisis MATLAB. Jouko Siro se agradece para capturar las fotografías de la figura 1. Agradecemos al equipo de FIMM WebMicroscope para escanear diapositivas histológicas, y el centro de animales de laboratorio para la cría de apoyo.

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Autores no declaran ningún conflicto de interés.

Varios complejos en vitro modelos de tumores, incluyendo culturas 3D y organoides, se han desarrollado para recapitular la arquitectura y funciones oncogénicas en vivo 29,del tejido tumoral en30. Sin embargo, el establecimiento de culturas 3D u organitas implica disociación de tejidos y crecimiento selectivo de un solo tipo de células o cocultivo un selecto pocos tipos de células en un ambiente artificial. En consecuencia, tales modelos incompleto captan las complejidades de las interacciones de heterogeneidad y tumor de estroma del tumor. Organotypic rebanadas de tumor, por el contrario, mantienen el tejido arquitectura biológica complejidades y el tumor en situ sin manipulación extensa. Esta capacidad de rebanadas de tejido a células tumorales de modelo en su microambiente nativa hace particularmente atractivo para los estudios preclínicos. Divulgamos previamente un flujo de trabajo optimizado para el establecimiento y análisis de cortes de precisión de corte tumor, y demostró que, en comparación con los soportes del filtro, una unidad de incubación rotatoria mejorar la viabilidad a corto plazo murino NSCLC rebanada culturas25 , 31. sin embargo, el cultivo en rotación unidades es técnicamente difícil y requiere supervisión constante. Aquí presentamos un protocolo para tumor tejido sector generación y uso práctico de una rotación unidad de incubación para los de la cultura, así como acompañando a métodos para monitorear la capacidad de rebanadas para capturar en situ la biología del tumor, un prerrequisito antes de drogas pruebas de respuesta.
Varios pasos críticos en el protocolo de aseguran integridad del tejido y la viabilidad de las rebanadas del tumor. Si el tumor rodea a tejido pulmonar normal, el vibratome puede generar sectores con grosor inconsistente o dañar las láminas, debido a diferencias en la textura y rigidez entre los tejidos normal y tumoral. Así, es importante eliminar el tejido pulmonar normal circundante antes de corte del tumor. Otro paso fundamental es el grosor de corte, que debe ser cuidadosamente optimizado para cada tipo de tejido. Además, una vez cortado, es crítico que la rodaja se coloca aproximadamente en el centro de la red, para garantizar la exacta intermitente en medio de cultivo y exposición al oxígeno. Por último, es importante seguir la posición de un sector durante su periodo de rotación, como una rebanada puede caer el medio; Si esto sucede, más acciones se pueden tomar como se explica en el paso 3.6 del protocolo.
Además de manejo para asegurar la integridad del tejido, también hay pasos críticos en el análisis de IHQ para interpretar cómo la rebanada asemeja al tejido nativo. Nuestro estudio anterior demostró que tumores NSCLC murinos exhiben heterogeneidad espacial pronunciado intra-tumor oncogénico señalización actividades26. Esto significa que el uso del tejido espacial distinto rebanadas para controles o las muestras tratadas con drogas pueden afectar la interpretación de datos experimentales fiables, y por lo tanto rodajas estrechamente adyacentes se deben utilizar como controles y las muestras de prueba. Además demostramos que mientras proliferación o expresión oncogénica fosfoproteína en rebanadas recién cortada inculto 0 h fueron similares en situ tumores, sectores cultivados demostraron alteración oncogénica fosfoproteína expresión, específicamente alterado p4EBP1 pSRC, así como proliferación alterada por IHC Ki67. P4EBP1 alterada expresión similar fue detectada en 24 h NSCLC humano y el cáncer de próstata cortar culturas (Narhi et al., suplementario figura S3B-S3C S5 y S7)26. Estos resultados avalan que comparación de sectores cultivados con su rebanada inculto más cercano de 0 h es esencial para evaluar la preservación de en situ las funciones tumor en rebanadas cultivadas.
A pesar de mejorar la viabilidad de organotypic rodajas25, existen limitaciones con el sistema del rotor en términos de tecnicismos. Colocar las rebanadas de tejido sobre rejillas de titanio es más difícil en comparación con los partes movibles del filtro, y una unidad de incubación rotatoria puede no estar disponible. Como alternativa, pueden utilizar soportes de filtro estancada, pero en ese caso sólo el lado expuesto de aire de las rebanadas debe ser analizado, como gradientes de filtro de aire en la viabilidad y la hipoxia por HIF1α expresión se forman rápidamente en apoyo de filtro laminar culturas (Davies et al., figura 5 y Figura 7A-7B)25. Además hemos demostrado que las culturas de rebanada de tumor pueden exhibir proliferación alterada y actividades de señalización oncogénicas en comparación con los tumores nativo26, posiblemente debido a las respuestas de cicatrización o adaptación metabólica de las rodajas a ex vivo 32de la cultura. Aunque brutas características morfológicas de los tumores murinas del NSCLC se mantuvieron durante el cultivo de 72 h, cambios proliferativos inducido por la cultura pueden afectar clasificación precisa de los sectores cultivados. Por lo tanto, sólo deben utilizarse rebanadas de tejido para estudios funcionales a corto plazo.
Uso de una unidad de incubación rotatoria rescata por lo menos parcialmente intra-slice viabilidad o biomarcadores gradientes de expresión, particularmente durante las primeras 24 h de cultivo. Una vez validado por la integridad y función, proporciona material de tejido para estudios funcionales, tales como estudios de tratamiento de drogas. Además de drogas perfiles de respuesta, expresión objetivo alterado después del tratamiento de drogas también puede beneficiarse validación de anticuerpo. Esto es particularmente relevante para la detección de epítopos murino con anticuerpos monoclonales de ratón, ya que estos tienden a dar alta fondo tinción. Además, anticuerpos validados debe conseguir datos fiables y reproducibles en contextos clínicos y de diagnóstico. Así, la modulación de la abundancia o la fosforilación de los epitopos pertinentes siguiendo tratamiento farmacológico en cortes de tejidos proporciona una aplicación práctica útil en la validación de anticuerpo. Una ventaja importante de las culturas de rebanada de tumor es la capacidad para modelo espacial distribuido funciones, incluyendo actividades de señalización oncogénicas o respuesta del fármaco en el tumor o las células estromales, que hace un modelo atractivo ex vivo . Sin embargo, rebanadas giran durante el cultivo y el proceso de cultivo puede dañar más el tejido especialmente en los bordes. Es por lo tanto un reto a recubrimiento precisamente las imágenes IHC teñido de biomarcadores de rebanadas de 0 h con las regiones necróticas en rebanadas cultivadas, que compromete la capacidad precisamente vincular las actividades de biomarcadores espacial a la respuesta de la droga. Además, las respuestas necróticas tumor intrínseco, inducida por la cultura y droga-inducida son indistinguibles por lo menos en murinos rebanadas de tejido de CPCNP, comprometer la cuantificación precisa de las respuestas de droga espacial. Finalmente, el uso de culturas de corte del tumor permite un investigador a prueba múltiples compuestos en el tumor mismo, sin necesidad de tratar a los animales, así refinar, reducir y sustituir los experimentos en animales de laboratorio.
Como una aplicación futura, el protocolo descrito puede ser adoptado para las muestras clínicas tumor sólido. Otras modificaciones de depende del tipo de tejido u optimizaciones son probablemente necesarias, a partir de ajustes a la configuración de vibratome incluyendo rebanada grueso y vibración de velocidad para optimizar estos para textura de tumor o rigidez. Además, requerimiento de nutrientes y factor de crecimiento puede variar para los tejidos del tumor diferentes. Por ejemplo, rodajas de cáncer de mama han sido cultivadas con la insulina en el medio13,18. Dado que el material tejido limitada se obtiene durante la cirugía o biopsia, optimización de las culturas de rebanada de tumor derivados del paciente puede ser difícil debido a las dificultades en la obtención de un número suficiente de muestras replicadas. Además, reproducibilidad de datos está cuestionada también por una pronunciada heterogeneidad de la muestra de paciente a paciente, particularmente en el porcentaje de células del tumor versus regiones fibróticas o stromal infiltra, así como componentes de tejido necrótico. Por último, aplicación de rodajas de tumor en configuración diagnóstico requeriría investigación del grado a que droga respuestas en explantes de rebanada de biopsias pre-tratamiento coincide con respuestas después del tratamiento en vivo .

Tejidos de tumor sólido, incluyendo el cáncer de pulmón, exhiben heterogeneidad genética y fenotípica y albergan complejos microambientes1,2. La interacción entre las células del tumor y su influencia de microambiente circundante en drogas mecanismos de sensibilidad y resistencia3. Esto destaca la necesidad de modelos preclínicos que puede modelar con precisión la complejidad biológica y funciones actúan en tumores nativos. Precisión de corte rebanadas inmediatamente derivadas de tumores frescos proporcionan un recurso único, ya que tienen una capacidad principal para representar en vivo la biología, al menos por un corto período de tiempo, incluyendo fenotipos espacialmente distribuidos en un tumor individual. Resecado tumores clínicos son uno de los pocos ejemplares personalizados que pueden obtenerse de un paciente de cáncer, y su uso diagnóstico merece escrutinio.
La historia de las culturas organotypic remonta alsiglo temprano 19, cuando tumores intracraneales humanos fueron cortados a mano en trozos de tejido y culta con el supuesto de suspensión el método de caída. Fragmentos de tejido fueron conectados a un cubreobjetos y permitió sumergir en plasma humano heparinizado, después de lo cual el cubreobjetos fueron invertidas, se sellan y cultivados durante varias semanas4. Cortar manualmente tumor puesto que han sido cultivados utilizando una variedad de otros métodos, tales como el plasma coágulos5, en medios líquidos6, o de 0.45 μm de poro de filtros de tamaño6. El término "organotypic" primero fue utilizado en 1954, en un estudio sobre la diferenciación retiniana del polluelo embrión ojo7. Esto fue seguido por estudios que utilizaron explantes de tejido de pulmón y corazón derivados de embriones de pollo8y explantes de cerebro de ratas adultas9.
Varios métodos de corte han sido helicópteros descrito, a saber, manual10,11, Krumdieck tejido cortar12,13y vibratomes11,14,15, 16. La máquina de cortar de tejido Krumdieck genera núcleos de tejido cilíndrico, que entonces se rebanan en rodajas circulares tejido utilizando un micrótomo. Un vibratome, por el contrario, utiliza un microtomo de cuchilla vibrante. En un estudio sobre rebanadas de hígado, fue demostrado que la Leica vibratome genera más rebanadas consistente y reproducibles en comparación con la máquina de cortar de Krumdieck15. Se han utilizado espesores de rebanada que van desde 250 a 500 μm, y estudios informan mantenimiento de viabilidad y características morfológicas hasta 16 días14,10,17,18. Sin embargo, los tumores tienen variable perfiles metabólicos que pueden afectar los requerimientos de nutrientes, y pueden influir en parámetros como la composición de rigidez y matriz de tejido de aireación y flujo de nutrientes. Por lo tanto es probable que cada tipo de tejido requiere optimización de condiciones de corte y la cultura.
Métodos de cultivo diferentes han sido utilizados para apoyar las culturas rebanada: i) cultura de interfase inmóvil, también llamada cultura apoyo estancada, en la que rodajas se colocan encima de un inserto de membrana semi poroso sumergido en el medio de cultivo. En este sentido, la parte superior de las láminas es expuesta al aire, mientras que la parte inferior se complementa con nutrientes a través de la inserción porosa14,19; II) el método de paleta, originalmente desarrollado para órganos toda cultura o rebanadas de tejido embrionario. En este sentido, rodajas se colocan encima de una hoja de algodón o filtro apoyada por una red metálica, y el filtro se empapa en el medio de cultivo. Para mantener los tejidos húmedos, se agrega una capa delgada de medio encima de las rebanadas20,21,22. Estos dos primeras son denominados culturas de la interfase aire-líquido; III) culturas de tubo rodillos, rodajas se colocan dentro de la parte plana de un tubo plástico que contiene medio y tubo lenta rotación asegura que el tejido es cubierto con medio durante la primera parte de un ciclo, o aireado durante el segundo23; IV) unidades de incubación, en la que rodajas están expuestas intermitentemente al medio con nutrientes y aireación de la rotación. Diferentes de los tubos del rodillo, en este método de rebanadas se colocan encima de las rejillas de titanio poroso colocadas en placas de 6 pocillos con medio de cultivo24.
Rebanadas de tejido derivado de resecado tumores sólidos lógicamente presentes un modelo atractivo ex vivo en el que poner a prueba la respuesta al tratamiento de agentes contra el cáncer, pues permiten la evaluación de viabilidad, dirigido vía actividad y perfiles moleculares de un tumor específico en presencia de su microambiente tumoral nativo. Sin embargo, para evaluar las respuestas de medicamentos medidas en rebanadas tumor predicción de respuestas en situ , es importante evaluar qué rebanadas de tejido de punto preservar las funciones biológicas del tumor-específicas tales como proliferación celular, diferenciación de la célula de histopatología específica o las actividades de señalización oncogénicas. El impacto del estrés mecánico sacado durante la preparación de rebanada, slice manejo o adaptaciones inducidas por la cultura de la calidad y funciones biológicas de rebanadas de tejido son cuestiones fundamentales, estrechamente ligados a la capacidad de implementar derivadas de tumor láminas para el diagnóstico funcional.
Nuestro proyecto de consorcio financiado por la IMI PREDECT (http://www.predect.eu) propone sistemáticamente dirección estas preguntas fundamentales, mediante el estudio de explantes de la rebanada de una variedad de fuentes. Utilizando láminas derivadas de modelos de cáncer de mama, próstata y pulmón, este esfuerzo conjunto utilizado lectura cualitativa como cuantitativa hematoxilina y lecturas de eosina (H & E) - basado en demostrar un requerimiento de oxígeno atmosférico y filtro estancada soportes para mantener la viabilidad de sectores cultivados hasta 72 h. Además, análisis de inmunohistoquímica (IHQ) en rebanadas cultivados revelaron gradientes de viabilidad intra-slice, evidenciados como gradientes de necrosis en sectores derivados de cáncer de pulmón murino de células no pequeñas (CPCNP), receptor de estrógeno (ER), HIF1α y γH2AX 25rodajas de gradientes en rebanadas de cáncer de mama, o gradientes de expresión de receptor (AR) de andrógenos en el cáncer de próstata. Curiosamente, gradientes de viabilidad intra-rebanada en cultivos de 24 h de CPCNP murino fueron rescatados por los cultivos en una rotación unidad de incubación, y nuestro reciente estudio demostró que la viabilidad se extendió a 72 h26. Particularmente en el lado superior seguía siendo más viable26, avalando que análisis de respuesta de drogas en rebanadas se realizan mejor en este lado del tejido.
Aunque sigue siendo una cuestión de cómo mucho rebanadas de tejido pueden recapitular en situ las funciones de tumor, se han utilizado para probar las respuestas a los agentes contra el cáncer, incluyendo drogas específicas, anticuerpos monoclonales y agentes de la quimioterapia 10,11,13,14,18,27. Recientemente demostramos que rodajas de CPCNP murinos muestran cambios dinámicos en la proliferación y rebanadas de actividades señalización oncogénicas tras cultivo comparado con recién cortado 0 h26. Esto indica que es importante investigar si las funciones biológicas específicas en situ se conservan adecuadamente durante el cultivo, antes de los estudios de perturbación. A pesar de estos hallazgos, hemos demostrado que rodajas de tumor pueden modelar espacial respuesta a terapias dirigidas, medio drogas tratamientos siguen siendo breve (24 h) y se inician en el inicio de cultivo26. El siguiente protocolo describe validación importantes aspectos relevantes para el establecimiento y análisis de las culturas de rebanada de tumor, antes de su aplicación en las pruebas de drogas farmacológicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Culturas de explante primario del tejido Organotypic, que incluyen cortes de precisión de corte, representan la arquitectura del tejido tridimensional (3D), así como las interacciones multicelulares de tejido propio. Rebanadas de tejido cortadas inmediatamente de recién resecados tumores preservan aspectos espaciales de la heterogeneidad intratumor, así haciéndolos útiles sustitutos de la biología en vivo . Cuidadosa optimización de condiciones de preparación y cultivo de rodaja de tejido es fundamental para el potencial diagnóstico predictivo del tumor rebanada de explantes. En este sentido, los modelos murinos son valiosos, ya que esto proporciona un flujo constante de material tumoral para realizar experimentos reproducibles y repetición. Este protocolo describe el cultivo de rebanadas de tumor derivado del tejido pulmonar murino utilizando una rotación unidad de incubación, un sistema que permite la exposición intermitente de los tejidos de oxígeno y nutrientes. Nuestro trabajo previo demostró que el uso de unidades de incubación de rotación mejora la viabilidad del tejido en comparación con otros métodos de cultivo, particularmente flotante rebanadas y filtro estancada es compatible. Aquí, mostramos más que grosor de corte influye en la viabilidad de sectores cultivados, sugiriendo que optimización de grosor de corte debe hacerse para los tipos de tejido diferentes. Pronuncia ITH en funciones oncogénicas, como señalización de actividades, infiltración de células estromales o expresión de marcadores de diferenciación, exige una evaluación de rebanadas de tejido adyacente para la expresión de marcadores alterados por el tratamiento de drogas o cultivo de sí mismo. En Resumen, este protocolo describe la generación de rebanadas de tumor de pulmón murinas y su cultura en una rotación unidad de incubación y demuestra cómo sectores deben analizarse sistemáticamente para la expresión de marcadores de tejido heterogéneo, como requisito previo antes de estudios de la respuesta del fármaco.

La figura 1 representa el flujo de trabajo para la generación, cultivo y análisis de rebanadas de tejido de corte de precisión derivado de tumores murinos de NSCLC. Para esta demostración, utilizamos tumores de un modelo de ratón genéticamente (GEMM) albergando activación condicional de KrasG12D junto con la pérdida de Lkb1 (también conocido como serina/treonina quinasa 11), en lo sucesivo Mal Iniciación de ratón cría y del pulmón tumor fue realizado como se describe en26,28. Figura 2A muestra el efecto del grosor de corte de tejido sobre la viabilidad de sectores cultivados durante 24 horas utilizando una rotación unidad de incubación. Los resultados muestran que 160 μm rebanadas contienen grandes áreas necróticas en el segmento. Además, rodajas finas de 250 μm muestran una necrosis degradado en el segmento en comparación con rodajas finas de 200 μm. Es probable que la pobre viabilidad general del μm 160 más delgado es causada por manipulación técnica durante la colocación de las rodajas encima de las rejillas, ya que son frágiles y tienden a rizarse. Por otro lado, cuando rodajas demasiado gruesas, pueden ser propensos a deficiencias de oxígeno o nutrientes difusión a través de las láminas, que en el CPCNP murino explantes se evidencia como gradiente de muerte necrótica25. Sin embargo, cabe señalar que pueden generarse cortes con espesores variables de un tumor, a pesar de uso de vibratome idéntica configuración. Por lo tanto se recomienda analizar múltiples repeticiones de muestras tumorales diferentes. Lo importante es que, cada tipo de tejido requiere optimización de espesor rebanada para lograr la máxima viabilidad, ya que el tejido textura y dureza pueden afectar la oxigenación y el flujo de nutrientes. Figura 2B -2C ilustra el análisis de IHQ cuantitativos de la expresión de NKX2-1, un marcador de adenocarcinoma bien diferenciado de pulmón (CA) en muestras cultivadas hasta 72 h y empareja rebanadas de 0 h. Los resultados muestran que expresión de NKX2-1 no se altera significativamente en sectores cultivados en comparación con 0 HS rebanadas incultos, lo que sugiere que el proceso de cultivo no afecta abiertamente el estado de diferenciación del tejido tumoral de AC. Figura 2D muestra la utilidad de rebanadas de tejido del tumor para evaluar la efectividad de los fármacos específicos. Recientemente demostró que Kras mutante murino ACs exposición alta expresión de ERK1/2 fosforilado (mayor actividad MAPK camino marcado) en comparación con los tumores Adenoescamoso (ASC), mientras que la expresión de 4EBP1 fosforilada (marcando la actividad de mTOR ) del mismo modo se expresa en tumores CA y ASC. Para comprobar si estas vías pueden ser efectivamente objeto de rebanadas de tejido, rebanadas de tejido KL AC fueron tratados con DMSO o contiene cantidades de compuestos, es decir, 0.1-1 μm dactolisib a la vía de mTOR o 0.05 – 0.5 μm selumetinib atacar la vía MAPK. Resultados muestran que 1 μm dactolisib o 0,5 μm de selumetinib son eficaces en la inhibición de la fosforilación de ERK1/2, o de 4EBP1 respectivamente. Además, la inhibición dosis dependiente de las fosfoproteínas específicas indica que rebanadas de tejido también pueden ser utilizados para validar los anticuerpos específicos de fosforilación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo para el establecimiento y análisis de explantes de rebanada tumor derivado de CPCNP murinos. (A) diagrama esquemático que describe la colección y preparación de los pulmones con tumores para rebanar. Lóbulos del pulmón se cosechan de un ratón y se diseca tejido tumoral de tejido normal. La flecha negra y asterisco indican aproximadamente 4 mm y los tumores de 1 mm, respectivamente. La punta de flecha blanca indica tejido pulmonar pegado a la superficie de las mordazas. Los puntos de la flecha roja en una pieza adicional de tejido de soporte pulmonar normal para mantener el tumor en una posición vertical. (B) Vibratome corte y colección de rebanadas de tejido. Flecha blanca indica la dirección de corte. Colección de Cortes secuenciales en una placa de 24 pocillos que contienen frío HBSS + P/S. Las rodajas pueden ser cultivadas para diferentes puntos temporales (aquí, 24 – 72 h) para evaluar la expresión de marcadores tumorales durante el cultivo (fila superior), o pueden utilizarse para realizar tratamientos con fármacos. C: control del vehículo de, T: tratamiento contra las drogas. (C) colocar la rodaja de tejido para cultivo mediante rotación unidades de incubación. Incline la placa de 6 pozos para que algún medio cubre la parte superior de la cuadrícula, coloque la rebanada de tejido en el centro de la rejilla en la parte superior del medio y unta la rebanada con unas pinzas. Asegurar que las placas de 6 pozos peso equilibrado para un ciclo de rotación suave. X: indica incorrecta, y <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: indica la colocación correcta de la rebanada. (D) fotografía del bloque FFPE de una porción del tumor. Puntos de la flecha negra en el segmento de tejido parafina-encajado teñidas con hematoxilina. (E) esquema que muestra el orden de seccionamiento de las rebanadas en bloques FFPE; Estas secciones se pueden procesar para evaluar la viabilidad del tejido y la expresión de biomarcadores tumorales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figura 2: evaluación de expresión de marcador de viabilidad y histotype específicos y tratamiento específicos en segmentos de tejido de CPCNP. (A) representante de H & E imágenes de rebanadas de NSCLC de CA de los espesores indicados se cultivan para rodajas finas de 24 h. 200 μm mantienen mejor viabilidad en comparación con 160 μm o rodajas de 250 μm. Azul oscuro representa H & E tinción de tejido viable, y rosa indica regiones necróticas pseudocolored. Luz azul indica regiones excluidas del análisis, debido a la presencia de estroma fibroso o tejido pobre calidad. T1 y T2 representan repeticiones biológicos derivados de dos tumores diferentes. Barra de escala = 500 μm. (B) IHC representativas imágenes de la expresión de NKX2-1 en rodajas AC se cultivan para los puntos de tiempo indicado. La flecha indica la zona que se muestra en la ampliación más alta. Los resultados muestran que la expresión de NKX2-1 no se altera en los sectores cultivados comparados con rebanadas de 0 h. Barra de escala = 500 μm y 50 μm para los aumentos bajos y altos, respectivamente. (C) la cuantificación de los datos que se muestra en (B). (D) representante IHC imágenes de 4EBP1 fosforilada o expresión pERK1/2 en 0 h rodajas o rebanadas tratados con DMSO o contiene cantidades de dactolisib (dact, fila superior) o fosforila pERK1/2 expresión en 0 h sector, o sectores tratados con DMSO o selumetinib (sel, fila inferior). Cajas cuadradas negras indican las áreas indicadas en mayor aumento. Barra de escala = 1 mm o 50 μm para un aumento bajo o alto, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Nos proporcionan un método para la generación, cultivo y análisis sistemático de rebanadas organotypic derivadas de tumores de pulmón murino. También se describe cómo optimizar el grosor de corte y cómo seleccionar las concentraciones de la droga para el tratamiento de rodajas de tumor.

Establecimiento y análisis de segmento de Tumor explantes como prerrequisito para la prueba de diagnóstico

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación preclínica, donde los estudios de respuesta a fármacos en explantes de rebanadas tumorales pueden servir para fines diagnósticos. La principal ventaja de esta técnica es que los explantes de rebanadas pueden para un corto período de tiempo modelar la compleja biología de los tejidos nativos, incluidas las funciones distribuidas espacialmente. Aunque este método puede proporcionar información sobre el uso de rebanadas de tumores pulmonares murinos, también se puede aplicar a otros tipos de tejido, incluidos los tejidos humanos.Para empezar, prepare el vibratome y realice un VibraCheck de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual. A continuación, llene cada pozo de la placa de 24 pozos con un mililitro de solución de sal equilibrada de Hank complementada con penicilina y estreptomicina y mantenga la placa en hielo. Inserte agujas de calibre 25 en las cuatro patas de un ratón eutanizado colocado en una tapa de espuma de poliestireno para que el pecho quede expuesto y el animal se estire.Rocíe 70%alcohol en la superficie de la piel expuesta. Utilice tijeras colocadas en una posición en ángulo para abrir la piel desde el abdomen hacia el pecho y hasta la región del cuello. Estire la piel a cada lado con fórceps e inserte agujas de calibre 25.Abra la región abdominal. Luego abre la caja torácica y el diafragma para exponer el pulmón y el corazón. Exponga la tráquea cortando el tejido circundante.Disecciona los pulmones, junto con el corazón. Coloque los tejidos en un tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de HBSS helado complementado con Pen-Strep colocado en hielo y proceda al siguiente paso lo más rápido posible. Ahora transfiera los pulmones que soportan tumores a una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros.Utilice tijeras y fórceps estériles para separar los lóbulos pulmonares y seleccionar lóbulos con tumores en la superficie para cortar. Coloque un lóbulo pulmonar con un tejido tumoral en un pedazo de papel de filtro para evitar resbalones y corte parte del pulmón normal o tejido tumoral adicional que rodea el tumor utilizando un bisturí estéril para generar una superficie plana de la pieza de tejido. Sumerja el lado plano en una gota de adhesivo de cianoacrilato y colóquelo en el soporte de la muestra de vibratoma para que el tumor se enfrente a la hoja en posición vertical, y déjela secar durante dos o tres minutos.Coloque el soporte de la muestra de vibratomo en la bandeja de tampón de metal. Llene la bandeja con HBSS frío complementado con Pen-Strep hasta que el tejido se sumerja en el tampón. Cubra la bandeja tampón con la tapa del plexiglás que se suministra con el instrumento y coloque la bandeja en un baño de hielo blanco y agregue hielo para mantener el tejido fresco durante el corte.Fije el baño de hielo blanco al vibratome. A continuación, seleccione los ajustes de corte adecuados y comience a cortar. Lleve la hoja vibratome a la posición de corte y ajuste la ventana de corte.Utilice fórceps estériles para recoger las rodajas en una placa de 24 pocillos llenas de un mililitro de HBSS complementado con Pen-Strep por pozo y mantener en hielo. Mientras realiza un seguimiento del orden de corte, marque cada pozo de la placa de 24 pozos de acuerdo con el plan experimental. Recopile una rebanada de tejido adyacente a las rebanadas cultivadas como una referencia de cero horas o sin cultura.Recoja al menos tres rebanadas de referencia para representar la parte superior, central e inferior del tejido. Y una vez completado el corte, continúe con la fijación y el procesamiento. Después de eso, preparar una placa de seis pozos que contenga 2,5 mililitros de medio de cultivo por pozo mediante la colocación de rejillas de titanio en él.Asegúrese de que no se forman burbujas de aire entre la rejilla de titanio y el medio. Para cargar un corte en la rejilla, mantenga la placa de seis pozos en una posición en ángulo para que una parte del medio cubra la rejilla. A continuación, coloque la rebanada en el medio en la cuadrícula y use fórceps para esparcirla.Después de colocar las rodajas, cargue las placas de seis pocillos sobre la unidad de incubación giratoria colocada dentro de una incubadora humidificada mantenida a 37 grados celsius con 95%02 y 5%CO2. Inicie el ciclo de rotación. Para el cultivo a largo plazo reponer el medio de cultivo todos los días mediante el uso de fórceps estériles para levantar la rejilla que contiene las rodajas de tejido y colocarlo en un pozo vacío de la placa de seis pocillos.Sustituya el 70% del medio por un medio de cultivo fresco y vuelva a colocar la rejilla. Continúe el ciclo de rotación como se ha publicado anteriormente. Para el tratamiento farmacológico en las rodajas tumorales añadir 2,5 mililitros de medios con el medicamento diluido o el control del vehículo en la placa de seis pozos.Coloque las rejillas de titanio en los pozos y luego coloque las rodajas en las rejillas como se hizo anteriormente. Después de realizar los tratamientos durante 24 horas, continúe con la fijación y el procesamiento. Para empezar a fijar la rebanada deseada, transfiérala cuidadosamente usando fórceps en una placa de 10 centímetros que contenga un papel de filtro empapado lleno de dos a tres mililitros PBS y déjelo flotar.A continuación, levante el papel de filtro con un par de fórceps y colóquelo en un casete histo. Transfiera el papel de filtro a un cassette histo. Agregue una gota de hematoxilina diluida en la parte superior de la rebanada de tejido para marcar la posición de la rebanada para los pasos posteriores.Cierre el cassette y transfiérelo a una solución de formalina tamponada 4%neutral y déjela durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de lavar y procesar el cassette como se describe en el protocolo, abra el cassette histo y utilice un bisturí para levantar cuidadosamente la rebanada fija del papel de filtro. Deseche el papel de filtro y transfiera la rebanada a un molde que contenga parafina líquida.Utilice un peso plano para presionar el tejido contra la parte inferior del molde de incrustación para asegurar una sección uniforme. Coloque la parte inferior del cassette histo en la parte superior del molde. Agregue parafina líquida encima.Y deje que el molde se enfríe en una placa fría durante 30 minutos. Después de eso separar el molde enfriado del bloque de parafina. Use un microtoma para preparar secciones delgadas de cuatro micrómetros de los bloques de corte de tejido FFPE.Recorta el exceso de parafina que rodea el tejido. Para obtener secciones pares a lo largo del tejido, ajuste el ángulo del bloque de modo que la superficie del bloque esté orientada horizontalmente con respecto a la hoja. Usando un cepillo delgado, recoja secciones de tejido secuenciales de la rebanada de tejido incrustada en parafina comenzando en la parte superior de los portaobjetos de vidrio.Continúe recogiendo las secciones de las capas de tejido más profundas hacia el centro, seguidas de la parte inferior de los portaobjetos de vidrio. La colección de secciones de diferentes capas de cada sector de tejido a las diapositivas de objetos se realiza para permitir la captura de posibles gradientes inducidos por el cultivo en viabilidad, migración celular o expresión de biomarcador. Después de recopilar las secciones continuar con su procesamiento y análisis posterior como se describe en el protocolo.El grosor de las rebanadas de tejido puede influir en la viabilidad de las rodajas cultivadas. En este caso, las rodajas gruesas de 250 micrómetros muestran gradientes de necrosis aumentados en comparación con las rodajas de 200 micrómetros de espesor debido a que las rodajas más gruesas se vuelven propensas a deficiencias en la difusión de oxígeno o nutrientes a través de las rodajas. Sin embargo, las rodajas delgadas de 160 micrómetros contienen grandes áreas necróticas probablemente causadas por el manejo técnico durante el posicionamiento de las rodajas, ya que son frágiles y tienden a curvarse.El análisis de NKX2-1, un marcador de adenocarcinoma pulmonar bien diferenciado, muestra que su expresión no se altera significativamente en las rodajas cultivadas en comparación con las rodajas no cultivadas de hora cero. El análisis cuantitativo de la expresión NKX2-1 confirmó además que la expresión no se alteró significativamente en las rodajas cultivadas frente a las no cultivadas, lo que sugiere que el proceso de cultivo no afecta visiblemente al estado de diferenciación del tejido adenocarcinoma. Para comprobar si se pueden utilizar rebanadas de tejido tumoral para evaluar la eficacia de los medicamentos dirigidos, se trataron con DMSO o cantidades valoradas de compuestos.Cuando se trata con un dactolisib micromolar que se dirige a la fosforilación de la vía mTOR de 4EBP1 se inhibió. 0.5 selumetinib micromolar que se dirige a la vía de la quinasa MAP fue eficaz para inhibir la fosforilación de ERK1/2. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo trabajar con y analizar críticamente las rebanadas recién cortadas de los tejidos tumorales preciosos.Nuestro antiguo postdoc, Katja Narhi, contribuyó significativamente al establecimiento de este método en colaboración con colegas de la plataforma IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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