Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Detta arbete fick finansiella forskningsstöd från gemensamma företaget av den innovativa läkemedel initiativ bevilja avtal no 115188, Helsingfors universitet doktorandprogrammet i biomedicin stipendier (A.S.N.) och den Sigrid Juselius och Orion-Farmos stiftelser (E.W.V.). Vi tackar våra PREDECT vävnad slice plattform konsortiemedlemmar (Taija af Hällström och Siv Knaappila för stöd i upprättandet av rotator systemet och Riku Turkki för stöd med MATLAB analysen. Jouko Siro är tackade för att fånga fotografierna som figur 1. Vi tackar FIMM WebMicroscope laget för skanning histologiska bilderna, och laboratorium djur centrum för djurhållning stöd.

Alla musen experiment som beskrivs i denna studie utfördes genom att följa riktlinjerna från den finska nationella styrelsen av djur experiment, och godkändes av utskottet experimentella djur av Helsingfors universitet och den statliga provinsiella Kontor i södra Finland (licens nummer ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. förberedelser innan skivning
<ol><li>Hålla följande material redo: vibratome preparathållaren, vibratome buffert 10 cm kultur plattan, 10 mL pipett, plattan 24 brunnar, fack, pipett pojke, skräppåse, 70% EtOH i en 50 mL tub att desinficera instrument, och vävnad lim.</li>
	<li>Förbereda vibratome: torka bladhållaren med 70% EtOH, bifoga ett nytt blad och utföra en vibrocheck enligt instruktionerna i manualen (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf). Obs: Det är viktigt att utföra steget vibrocheck eftersom det minimerar den vertikala omläggning av bladet och säkerställer god kvalitet skivor.</li>
	<li>Fylla varje väl av 24-väl plattan med 1 mL av Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) kompletteras med 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin (HBSS + P/S); hålla plattan på is.</li>
	<li>Förbereda F12 odlingsmedium kompletteras med 100 U/mL penicillin 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamax, 22 mM glukos och 10% fetalt bovint serum (FBS). Obs: Tumör slice odlingsmedium och tillväxtfaktor kosttillskott kan variera beroende på de tumör vävnad25.</li>
	<li>Förbereda den nödvändiga mängden F12 medium för missbruksbehandling, med samma sammansättning som beskrivs i steg 1.4, men utelämna FBS. Obs: Eftersom tillväxtfaktorer i serum kan påverka onkogena signalering i odlade skivor, rekommenderas serumfritt medium för drogen störning korttidsstudier på tumör skivor. Om långsiktiga slice kulturer analyseras, är det viktigt att först utvärdera effekten av serumfritt medium på vävnad livskraft och tumör-specifik markör uttryck i obehandlad skiva kulturer.</li>
</ol>2. insamling av tumör-bärande lungorna
<ol><li>Avliva en tumör-bärande mus av cervikal dislokation när den visar symtom på ansträngd andning och förlusten av kroppsvikt. Obs: CO2-medierad dödshjälp är kända för att inducera hypoxisk förhållanden i lungorna, vilket kan ha en effekt på skiva livskraft eller onkogena aktiviteter via framkalla en hypoxisk reaktion.</li>
	<li>Stretch euthanized musen på frigolit lock genom att infoga 30 G nålar i alla fyra tassar, så att bröstet är utsatt.</li>
	<li>Skar upp huden från buken mot bröstet och upp till halsen regionen. Skar upp bröstkorgen och sedan membranet att exponera lungan och hjärtat. Hålla saxen i en vinklad position för att undvika vävnadsskada.</li>
	<li>Dissekera tumör-bärande lungorna tillsammans med hjärtat och placera dem i en 50 mL tub innehållande 30 mL iskallt HBSS + P/S; Håll röret iskall och fortsätta till nästa steg så snabbt som möjligt. Obs: Förseningar i behandlingen av lungtumörer kan förändra onkogena funktioner, till exempel signalering utbildningsavsnitt aktiviteter.</li>
</ol>3. generation av Precision-cut Lung tumör skivor
<ol><li>Överföra tumör-bärande lungorna i HBSS + P/S till en 10 cm vävnadsodling platta höll insida en laminär huva. Separera de lung lober med steril sax och pincett, och välj lober med tumörer på ytan för skivning. Obs: Tumörer > 3 mm i storlek är lämplig för skivning. Eftersom normal lungvävnad kring de stora tumör kompromisserna skivning på grund av skillnader i vävnad stelhet, bör tumörvävnad som genomgår skivning särskiljas från den normala vävnaden, sådan att en avmarkerad tumör region ansikten vibratome bladet.</li>
	<li>Generera en platt bit vävnadsytan skärande delen av normal lungvävnad som omger tumören bort med en steril skalpell och doppa den platta bilden i en droppe av cyanoakrylatlim. Montera denna sida på den vibratome preparathållaren så att tumören vänd bladet i upprätt läge. Låt limmet torka i 2 – 3 min. Obs: Normal lungvävnad limmade till preparathållaren stör inte tumör vävnad skivning och skivning stoppas innan den normala vävnaden uppnås. Tumörvävnad böjer ibland på grund av svampig konsistens av normal lungvävnad limmade till preparathållaren, att äventyra upprätt läge. Om detta händer, limma en bit ytterligare normala stöd lungvävnad bredvid den förmonterade normal lungvävnaden att behålla tumören i upprätt läge (figur 1A iii).</li>
	<li>Placera preparathållaren i metall buffertbrickan och fyll den med kallt HBSS + P/S tills vävnaden är nedsänkt i bufferten. Placera metall buffertbrickan på det vita isbadet och tillsätt is så för att hålla vävnaden svalt medan skivning.</li>
	<li>Fäst det vita isbadet i vibratome. Välj lämplig skivning inställningar: amplitud mellan 2,5 – 2.8, skivning hastighet mellan 0,10-0,14 ms och en skärande tjocklek mellan 160-250 µm. Obs: Skivning inställningarna behöver justeras enligt hårdheten av vävnaden. Hårdvävnad är lättare att skiva än mjukare vävnad och mjukare vävnader kräver skivning med lägre hastighet (0,1 – 0,12 ms) och högre amplitud (2,6-2,8). En 4 – 5 mm stor tumör ger normalt 15 – 20 skivor med 200 µM tjocklek. Odlas på kort sikt, kan murina tumörer vara skivad under semi sterila förhållanden utanför laminar huven. Kliniska tumörer bör dock alltid vara skivad inuti en klass II biosäkerhet laminar huva att undvika exponering för eventuella smittämnen i den mänskliga vävnaden.</li>
	<li>Med hjälp av steril pincett, samla skivor i 1 mL av HBSS i separata brunnar 24-well platta som hölls på is, noga håller koll på ordningen där skivor skivas. Markera varje väl Skyltens 24-väl den experimentella planenligt. Till exempel drog Markera sekventiell brunnar 24-well platta som kultur tidpunkter eller 0 h, fordonskontroll (C), behandlade (T) (figur 1B ii). Obs: Inte störa eller dra tumörvävnad och samla en skiva, eftersom detta kommer att förändra tumörens orientering med avseende på vinkeln på bladet, vilket leder till inkonsekvenser i tjockleken av efterföljande skivor.</li>
	<li>När alla skivor samlas in, överföra dem på Titan rutnät (2-3 skivor per rutnät) placeras i en 6-well platta innehållande 2,5 mL odlingsmedium per brunn. Se till att inga luftbubblor bildas mellan rutnätet Titan och mediet.<ol>
<li>Att ladda en bit vidare till rutnätet, hålla 6-väl plattan i en vinklad position så att en del av medlet täcker rutnätet och placera slice på medellång på nätet; använda pincett för att sprida skiva om det lockar. Fyll 6-väl plattorna på roterande inkubation enheten placeras inuti en befuktade inkubator som hålls vid 37 ° C med 95% och 5% CO2och starta rotation cykeln (figur 1 c i-ii). Obs: Metalliska rutnät och 6-väl plattorna måste vara exakt vikt balanserad innan du slår på den roterande enheten. Det är viktigt att placera skivor mitt i rutnätet så att de fullt alternera mellan luft och flytande faser under rotation cyklerna. Skivor som placeras alltför låg eller hög exponeras inte lämpligt att syre eller näringsämnen (figur 1 c jag), som kan äventyra vävnad livskraft. Det är viktigt att följa positionen för segmentet på rutnätet under odling, som segmentet kan ibland glida ner. Om detta händer inom 1 – 2 h kultur debutåldern, korrigera sin ståndpunkt och anteckna att detta urval kan skadas. Skivor som är felplacerad under en längre tid ska kasseras, eftersom vävnad livskraft påverkas avsevärt av felaktig syresättning och näringstillförsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Samla en vävnad bit intill odlade skivor som en 0 h, obildade, referens. Samla minst tre referens skivor för att representera toppen, mitten och centrum av vävnad som skivad. Fixa 0 h skivor omedelbart och processen enligt beskrivningen i 5.1. Obs: Om antalet sektorer är begränsad, t.ex., om flera sammansatta behandlingar eller tekniska replikat görs, jämförelser av varje behandlat prov med dess angränsande 0 h prov kan vara svårt. I sådana fall använda närmaste 0 h segmentet (minst 400 – 600 µm apart) att bedöma relativa vävnad livskraft eller uttryck för relevanta markörer vid kultur uppkomsten.</li>
	<li>För långsiktig odling, fylla på odlingsmediet varje dag. Lyft rutnätet som innehåller vävnad skivor med steril pincett och placera den i en tom brunn av 6-väl plattan; ersätta 70% av medium med färska odlingsmedium och placera rutnätet tillbaka i mediet. Fortsätt Rotationscykel som beskrivs i steg 3.6.</li>
</ol>4. behandling av tumör skivor med liten molekyl-hämmare
<ol><li>Förbereda de nödvändiga koncentrationerna av föreningar i behandlingsmediet. Att uppnå målet hämning i vävnad skivor krävs vanligtvis en 10-faldig högre drog koncentration jämfört med de IC50s som mäts i cellkulturer. För att undvika ospecifikt cytotoxicitet, testa en serie koncentrationer att erhålla minimalt effektiva koncentrationen för varje förening. Här, vi testade 0,1 – 1 µM PI3K/mTOR hämmare dactolisib och 0,05 – 0,5 µM av den MEK hämmare selumetinib på murina NSCLC skivor.</li>
	<li>Tillsätt 2,5 mL medier med utspädda läkemedlet eller DMSO eller andra fordonskontroll i 6-väl plattan. Placera Titan rutnäten i brunnar.</li>
	<li>Placera vävnad skivor på gallren som beskrivs i steg 3.6.</li>
	<li>Utföra fordon eller läkemedel behandlingar för 24 h. Fortsätt med vävnad fixering och bearbetning av skivor till paraffinblock som beskrivs i avsnitt 5. Obs: Varaktigheten av läkemedelsbehandlingen kan optimeras beroende på målsättning av experimentet, med beaktande av vävnad skivor förmåga att behålla i situ vävnad funktioner analyseras under perioden kultur.</li>
</ol>5. fixering och bearbetning av vävnad skivor
<ol><li>Lyft försiktigt den obildade 0 h referens eller odlade skiva på ett filterpapper indränkt i PBS.<ol>
<li>För att göra detta, tillsätt 2-3 mL PBS i en 10 cm platta, låt slice flötet i PBS och 'fiska' det ut genom att lyfta på segmentet på filter papper med ett par pincett.</li>
		<li>Överför pappersfiltret till en histocassette, och tillsätt en droppe utspädd hematoxylin (1:1 i avjoniserat vatten) ovanpå vävnad segmentet till synligt markera positionen för segmentet under efterföljande processtegen (figur 1 d).</li>
		<li>Stäng kassetten och överför det till 4% neutral buffrad formalin lösning. Fixa vävnader över natten vid 4 ° C. Medan placera skiva ovanpå pappersfiltret, kontrollera att den övre delen av segmentet är vänd uppåt; Detta är nödvändigt att följa upp, mellersta och nedre delen av en skiva under snittning och analys som beskrivs i steg 6.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nästa dag, överför kassetter till 70% EtOH, och genast fortsätta med paraffin-inbäddning vävnad behandling steg.</li>
	<li>Före vävnad bearbetning, tvätta histocasettes i 100% EtOH 2 x 10 min varje. I detta fall använda en mikrovågsugn station för vävnad bearbetning. Välj det program som användes för 1 mm vävnad tjocklek och följ instruktionerna i manualen (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf). Obs: När du använder annan vävnad bearbetningsmaskiner, använda programmet passar tunna vävnadsprover.</li>
	<li>För paraffin-inbäddning, öppna en histocassette och använda en skalpell för att lyft försiktigt på segmentet från pappersfiltret. Kassera pappersfiltret och överför segmentet i en form som innehåller flytande paraffin.<ol>
<li>Tryck på vävnaden mot botten av inbäddning mögel, till exempel med en platt vikt, att säkerställa även snittning. Placera den nedre delen av histocasette ovanpå formen, låt mögel svalna på en kall pate i 30 min och separera mögel från blocket paraffin. Obs: Som ett alternativ till horisontella inbäddning, det är möjligt att bädda in en tumör slice vertikalt genom att placera segmentet i upprätt läge. Vertikala sektioner tillåta lätt analys av lutningar i livskraft eller funktionella markör uttryck på ett enda avsnitt 25. Gradient analysen med horisontellt-embedded skivor kräver paraffin snittning som beskrivs i steg 6,2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. bearbetning och analys av Formalin-fasta och Paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader
<ol><li>Förbered 4 µm tunnslip av FFPE vävnad slice blocken med hjälp av en mikrotom. Vid snittning, justera vinkeln på blocket så att ytan på blocket är horisontellt orienterade med avseende på bladet; Detta är nödvändigt att erhålla även sektioner i hela vävnaden.</li>
	<li>För att fånga en potentiell kultur-inducerad livskraft lutning, cellmigration över skivor eller lutningar i biomarkör uttryck över odlade segment, samla sektioner från toppen, mitten och botten lager av vävnad slice på objektet diabilder som förklaras nedan.</li>
	<li>Samla sekventiell vävnadssnitt paraffin-inbäddat vävnad skiva först på den övre delen av glasskivor. Fortsätta att samla delarna av de djupare vävnaderna till mitten följt av nedre delen av glas glasen (figur 1E). Obs: För att rymma tre sektioner på en glasskiva, klipp bort överskottet av paraffin som omger inbäddade vävnad segmentet.</li>
	<li>Tillåta avsnitten att torka över natten vid 37 ° C, och fortsätt med H & E färgning eller immunohistokemi som beskrivs nedan. Obs: Förlust av antigenicitet kan uppstå när FFPE avsnitt lagras vid höga temperaturer eller för längre tid. Paraffin avsnitt rekommenderas som skall lagras vid 4 ° C och IHC analyser bör utföras inom 6 månader efter snittning.<ol>
<li>För H & E färgning, deparaffinize och rehydrera i paraffin avsnitt följande: xylen 3 x 5 min, 100% EtOH 3 x 1 min, 96% EtOH 2 x 1 min, 70% EtOH 1 x 1min och avjoniserat vatten 2 x 1 min.</li>
		<li>Inkubera i avsnitt i nymalen filtrerade hematoxylin lösning för 10 min och tvätta under rinnande vatten i 5 min. dopp avsnitten i syra alkohol (1% HCl i 70% EtOH) för 2 gånger och tvätta under rinnande vatten för 5 min följt av inkubation med 0,5% eosin för 2 m i.</li>
		<li>Efter steget eosin torkar avsnitten av doppa glasen i alkohol och xylen lösningar, enligt följande: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x 30 s, xylen 3 x 1 min. Slutligen, bädda in avsnitten i en xylen-baserade monteringsmedium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analys av vävnad livskraft och biomarkör uttryck
<ol><li>Förvärva högupplösta bilder genom att generera hela bilden skanningar av H & E-färgade bilder med hjälp av en skanner. För att bedöma vävnad livskraft, ta ögonblicksbilder från vävnad skanningar som representerar de övre, mellersta och nedre delarna av skivor.<ol>
<li>Foto manipulator programvara manuellt rita masker på nekrotiska områden av vävnaderna, följt av kvantifiering av nekrotisk regioner med hjälp av MATLAB.</li>
		<li>Beräkna relativa lönsamheten för de skivor som odlas för olika tidpunkter jämfört med närmaste 0 h segmentet som gjort i vår tidigare studie (Närhi et al., Figur S2B och C)26. På samma sätt bedöma potentiella intra-slice livskraft övertoningar genom att kvantifiera lönsamhet i den övre, mellersta och nedre delen av en odlade slice, och beräkna relativa lönsamheten för varje avsnitt att dess närmaste 0 h-skiva. Obs: Medan enbart odling av murina NSCLC skivor inducerar nekrotisk celldöd, biologiska Svaren till ex vivo odlingsbetingelser varierar beroende på tumörvävnad. Exempelvis upptäcktes lutningar i HIF1α, ER och makrofager präglas av F4/80 i filter-stödda slice kulturer härstammar från en breast cancer modell25. H & E - samt IHC-baserade analyser av odlade skivor måste därför övervägas för varje vävnadstyp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utföra IHC på avsnitten paraffin. Följande IHC protokoll är en utgångspunkt, och kräver ytterligare optimering för andra antikroppar. Kort, deparaffinize och rehydrera i paraffin avsnitt följande: xylen 3 x 5 min, 100% EtOH 3 x 1 min, 96% EtOH 2 x 1 min, 70% EtoH 1 x för 1 min och avjoniserat vatten 2 x 1 min.<ol>
<li>Att exponera de antigena epitoper, utföra värme-medierad antigen hämtning med 10 mM citronsyra vid pH 6 i en PT modul, följt av blockering med 1% bovint serumalbumin (BSA) och 10% normala get Serum (NGS) i 1 x PBS i 30 min i rumstemperatur (21-23 ° C).</li>
		<li>Inkubera i primär antikropp utspätt i 1% BSA och 5% NGS i 1 x PBS, antingen för 1 – 2 h vid rumstemperatur. Inkubera med anti-kanin sekundär antikropp, under 30 minuter vid omgivningstemperatur, följt av detektering med 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB).</li>
		<li>Sektioner är counterstained med hematoxylin (utspädd 1:10 i avjoniserat vatten) för 30 s och tvätta under vatten i 5 min, följt av uttorkning av doppa glasen i alkohol och xylen lösningar, enligt följande: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xylen 3 x ( 1 min varje steg). Slutligen, bädda in avsnitten i en xylen-baserade monteringsmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förvärva hela bilden skanningar av IHC-färgade bilder, exportera dem som TIFF-bilder med en förstoringsgrad på 1:4 med med en bildvisare och utföra de kvantifieringar som använder ImageJ. Obs: som ett alternativ till skannern, mikroskopiska bilder på 20 X eller 40 X förstoring kan förvärvas för kvantifieringar. Förstoringen kan väljas beroende på markören för att kvantifieras; hög förstoring bilder rekommenderas för nukleär färgning, medan cytoplasmiska eller membran markörer kan kvantifieras med 20 X bilder.<ol>
<li>För kvantifiering av nukleära markörer, i detta fall NKX2-1 uttryck, konvertera varje bild till 16-bitars bilder med hjälp av Fiji-ImageJ och ladda upp bilder för bildanalys.</li>
		<li>Anpassa bild analys rörledningen beroende på analysen. I detta protokoll, använda den följande rörledningen för kvantifiering av NKX2-1 positiva kärnor: identifiera primära objekt | Mäta objekt intensitet | Filtrera objekt (minimala värde = 0,0025) | Beräkna Math. Resultaten är representerade som procentandelar av DAB-färgade kärnor av det totala antalet kärnor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Olika komplexa in vitro- tumör modeller, inklusive 3D kulturer och organoids, har utvecklats för att sammanfatta arkitektur och onkogena funktioner i vivo tumör vävnad29,30. Dock innebär inrättandet av 3D kulturer eller organoids vävnad dissociation och selektiv tillväxt av en enda celltyp eller samtidig odling av en Välj några celltyper i en artificiell miljö. Följaktligen, fånga sådana modeller ofullständigt krångligheter av tumör heterogenitet och tumör-stroma interaktioner. Organotypic tumör skivor, upprätthålla däremot, den vävnad arkitektur och biologiska komplexiteten i situ tumören, utan omfattande manipulation. Denna förmåga av vävnad skivor till modell tumörceller i deras infödda närmiljön gör dem särskilt attraktiv för prekliniska studier. Vi tidigare rapporterat ett optimerat arbetsflöde för etablering och analys av precision-cut tumör skivor, och visade att, jämfört med om du vill filtrera stöder, en roterande inkubation enhet förbättra lönsamheten för kortsiktiga murina NSCLC slice kulturer25 , 31. men odling på roterande enheter är tekniskt utmanande och kräver ständig övervakning. Vi presenterar här ett protokoll för tumör vävnad slice generation och praktisk användning av en roterande inkubation enhet till kultur dem, samt kompletterande metoder för att övervaka skivor förmåga att fånga i situ tumörbiologi, en förutsättning innan drogen Response Test.
Flera kritiska steg i protokollet säkra vävnad integritet och livskraft i tumör skivor. Om normal lungvävnad omger tumören, kan vibratome generera skivor med inkonsekvent tjocklek eller skada skivor, på grund av skillnader i textur och styvhet mellan normal och tumör vävnader. Det är således viktigt att ta bort den omgivande normal lungvävnaden före tumör skivning. Ett annat viktigt steg är skivning tjockleken, som noga bör optimeras för varje vävnadstyp. Dessutom när skivad, är det kritiskt att segmentet är placerad ungefär i mitten av rutnätet, så för att säkerställa korrekt intermittent doppning i odlingsmedium och syrgasexponeringen. Slutligen är det viktigt att följa positionen för en bit under dess rotationstid, som en bit kan släppa till medium; om detta händer, kan ytterligare åtgärder vidtas som förklaras i steg 3.6 i protokollet.
Förutom vävnad hantering för att säkerställa integritet, finns det också kritiska steg i IHC analysen att tolka hur segmentet liknar infödda vävnaden. Vår tidigare studie visade att murina NSCLC tumörer uppvisar uttalad intra-tumör rumslig heterogenitet i onkogena signalering verksamhet26. Detta innebär att användningen av rumsligt skilda vävnad skivor för kontroller eller drog-behandlade prover kan påverka tillförlitlig experimentella data tolkning, och därmed nära angränsande skivor bör användas som kontroller och proven. Vi ytterligare visade att medan spridning eller onkogena phosphoprotein uttryck i nyklippt obildade 0 h skivor liknade i situ tumörer, odlade skivor visade förändrad onkogena phosphoprotein uttryck, speciellt förändrad p4EBP1 och pSRC, samt förändrade spridning analyseras av Ki67 IHC. Förändrad p4EBP1 uttryck upptäcktes på samma sätt i 24 h mänskliga NSCLC och prostatacancer skiva kulturer (Narhi et al., kompletterande figur S3B-S3C, S5 och S7)26. Dessa resultat stöder att jämförelse av odlade skivor med deras närmaste 0 h obildade skiva är avgörande för att bedöma bevarandet av i situ tumör funktioner i odlade skivor.
Trots att förbättra lönsamheten för organotypic skivor25, finns det begränsningar med rotator systemet i fråga om teknikaliteter. Att placera vävnad skivor på Titan stödraster är mer utmanande jämfört om du vill filtrera skär och en roterande inkubation enhet kanske inte är tillgängliga. Som ett alternativ, stillastående filtret stöder kan användas, men i så fall bara den air-exponerade sidan av skivor bör analyseras, som luft-till-filter lutningar i livskraft och hypoxi mätt av HIF1α uttryck bildas snabbt i filter-stödda slice kulturer (Davies et al., figur 5 och figur 7A-7B)25. Vi har vidare visat att tumören slice kulturer kan uppvisar förändrad spridning och onkogena signalering aktiviteter jämfört med deras infödda tumörer26, möjligen på grund av sårläkning Svaren eller metabol anpassning av skivor till ex vivo kultur32. Trots att brutto morfologiska egenskaper av murina NSCLC tumörer bibehölls under 72 h odling, kan kultur-inducerad proliferativa förändringar påverka korrekt gradering av odlade skivor. Vävnad skivor bör således endast användas för funktionella korttidsstudier.
Användning av en roterande inkubation enhet räddar åtminstone delvis intra-slice livskraft eller biomarkör uttryck övertoningar, särskilt under de första 24 h av kultur. När validerat för integritet och funktion, ger detta vävnadsmaterial för funktionella studier, såsom narkotika behandlingsstudier. Förutom läkemedel svar profilering får förändrad mål uttryck efter läkemedelsbehandling också antikropp validering. Detta är särskilt relevant för detektion av murina epitoper med musen monoklonala antikroppar, eftersom dessa tenderar att ge hög färgning bakgrund. Dessutom är väl validerade antikroppar krävs för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara data i diagnostiska och kliniska inställningar. Modulering av överflödet eller fosforylering av relevanta epitoper efter läkemedelsbehandling i vävnader skivor ger således en händig praktisk tillämpning i antikropp validering. En stor fördel med tumör slice kulturer är möjligheten till modell rumsligt-distribuerade funktioner, inklusive onkogena signalering verksamhet eller narkotika svar i tumören eller stromaceller, vilket gör dem en attraktiv ex vivo -modell. Men skivor rotera under odling, och processen för odling kan ytterligare skada vävnaden särskilt i kanterna. Det därför svårt att just overlay biomarkör-färgade IHC bilder av 0 h skivor med nekrotiska områden upptäcks i odlade skivor, som äventyrar möjligheten att länka just rumsliga biomarkör aktiviteter till narkotika svar. Tumör-inneboende, kultur-inducerad och läkemedelsinducerad nekrotisk svar är dessutom omöjlig att skilja minst i murina NSCLC vävnad skivor, att kompromissa med noggrann kvantitering av rumsliga drog svaren. Slutligen, tillåter användning av tumör slice kulturer forskare på prov flera föreningar på samma tumören, utan att behöva behandla djuren, därmed förfina, minska och ersätta experiment på laboratoriedjur.
Som en framtida ansökan, kan beskrivna protokollet antas att kliniska solid tumörprover. Ytterligare krävs vävnad typberoende modifieringar eller optimeringar sannolikt börjar med justeringar till vibratome inställningar inklusive skiva tjocklek och vibrationer hastighet att optimera dessa för tumör textur eller stelhet. Dessutom kan näringsämne och tillväxtfaktor krav variera för olika tumörvävnad. Som ett exempel, har breast cancer skivor varit odlade med insulin kompletteras i medelstora13,18. Med tanke på att begränsad vävnadsmaterial erhålls under operation eller biopsi, kan optimering av patientderiverade tumör slice kulturer vara svårt på grund av svårigheter att få tillräckligt antal identiska prover. Dessutom är data reproducerbarhet också utmanas av uttalad patient-till-patient prov heterogenitet, särskilt i procentandelen av tumörceller jämfört med fibrotiska regioner eller stromal infiltrat samt nekrotisk vävnad komponenter. Slutligen skulle tillämpningen av tumör skivor i diagnostikinställningar kräva undersökning av i vilken utsträckning som drog svaren i slice bladsticklingar av förbehandling biopsier matcher till efterbehandling i vivo svaren.

Solid tumör vävnader, inklusive lungcancer, uppvisar genetiska och fenotypiska heterogenitet, och hamnen komplexa mikromiljö1,2. Samspelet mellan tumörceller och deras omgivande närmiljön inflytande på drogen känslighet och resistens mekanismer3. Detta belyser behovet av prekliniska modeller som exakt kan modellera biologisk komplexitet och funktioner agerar i native tumörer. Precision-cut skivor omedelbart härrör från färska tumörer ger en unik resurs, eftersom de har en rektor kapacitet att representera i vivo biologi, åtminstone för ett kort tidsfönster, inklusive fenotyper rumsligt fördelade i en enskild tumör. Opererande kliniska tumörer är en av få personliga exemplar som kan erhållas från en cancerpatient och deras diagnostik förtjänar granskning.
Historien av organotypic kulturer har anor från det tidigt 19: e århundradet, när intrakraniella tumörer var handskurna i vävnad bitar och odlade med hjälp av den så kallade hängande släpp-metoden. Vävnaden fragment var kopplad till ett täckglas och tillåtet att doppa i hepariniserad humanplasma, varefter coverslips var inverterad, förseglade och odlade för flera veckor4. Manuellt klippa tumören bitar har sedan varit odlade med en mängd andra metoder, såsom på plasma blodproppar5, i flytande media6, eller på 0,45 µm porstorlek storlek filter6. Termen ”organotypic” användes först 1954, i en studie på retinal differentiering av chick embryo ögat7. Detta följdes av studier som använde lunga och hjärta vävnad bladsticklingar härrör från chick embryon8och hjärnan bladsticklingar från vuxna råttor9.
Olika metoder för skivning har varit beskrivs, nämligen manuell choppers10,11, Krumdieck vävnad slicer12,13och vibratomes11,14,15, 16. Utsnittet Krumdieck vävnad genererar cylindriska vävnad kärnor, som sedan skivas i cirkulär vävnad skivor använder en mikrotom. En vibratome, däremot, använder en vibrerande blad mikrotomen. I en studie på levern skivor visades det att den Leica vibratome genererar fler reproducerbara och konsekvent skivor jämfört med de Krumdieck slicer15. Slice tjocklekar allt från 250 till 500 µm har använts, och studier rapporterar underhåll av livskraft och morfologiska egenskaper ända till 16 dagar14,10,17,18. Dock tumörer har variabel metaboliska profiler som kan påverka näringsbehov och parametrar såsom vävnadssammansättning stelhet och matris kan påverka på luftning och näringsämnen flöde. Det är därför troligt att varje vävnadstyp kräver optimering av skivning och odlingsbetingelser.
Olika odlingsmetoder har använts för att stödja slice kulturer: jag) stationära interphase kultur, även kallad stillastående stöd kulturen, där skivor placeras ovanpå en semi porösa membran infoga nedsänkt i odlingssubstratet. I detta exponeras toppen av skivor för luften, medan botten kompletteras med näringsämnen via porösa infoga14,19; (II) murslev metoden utvecklades ursprungligen för kultur hela organ eller embryonal vävnad skivor. I detta segment är placerade ovanpå ett bomull lakan eller filter som stöds av ett metallgaller och filtret är indränkt i odlingssubstratet. För att hålla vävnader fuktig, läggs ett tunt lager av medium ovanpå skivor20,21,22. De två första är så kallade luft-vätska interphase kulturer; (III) rulle tube kulturer, där skivor är placerade inuti den platta sidan av ett plaströr som innehåller medium och långsam tube rotation garanterar att vävnaden är täckt med medium under den första delen av en cykel, eller kolsyrat under den andra23; IV) roterande inkubation enheter, där skivor utsätts ibland för medium med näringsämnen och luftning. Olika från rullen rör i denna metod skivor placeras ovanpå porösa Titan galler placeras i 6-väl plattor med odlingsmedium24.
Vävnaden skivor härrör från opererande solida tumörer logiskt närvarande en attraktiv ex vivo modell där att testa behandlingssvar av anti-cancer, som de medger utvärdering av livskraft, riktade väg aktivitet och molekylära profiler av en specifik tumör i närvaro av dess infödda tumör mikromiljö. För att utvärdera om läkemedlet Svaren mätt i tumör skivor är prediktiva för i situ svaren, är det dock viktigt att bedöma i vilken utsträckning vävnad skivor bevara tumör-specifika biologiska funktioner såsom cellproliferation, histopatologi-specifika celldifferentiering eller onkogena signalering verksamhet. Effekterna av mekanisk stress framkallas under slice förberedelse, slice hantering eller kultur-inducerad anpassningar på både kvalitet och biologiska funktioner av vävnad skivor är grundläggande frågor, tätt kopplad till förmågan att genomföra tumör-derived skivor för funktionsdiagnostik.
Vårt IMI-finansierade konsortiet projekt PREDECT (http://www.predect.eu) fastställs att systematiskt adress dessa grundläggande frågor, genom att studera slice bladsticklingar från olika källor. Använda skivor som härrör från bröst-, prostata- och lung cancer modeller, utnyttjas denna gemensamma insats kvalitativa Läs-outs samt kvantitativa hematoxylin och eosin (H & E) - baserat utläsningar att demonstrera ett krav för luftens syre och stagnerande filter stöd för att upprätthålla livskraften hos odlade skivor tills 72 h. Immunhistokemi (IHC) analyser på odlade skivor visade dessutom intra-slice livskraft övertoningar, framgår som nekros övertoningar i skivor som härrör från murina icke-småcellig lungcancer (NSCLC), östrogenreceptor (ER), HIF1α och γH2AX övertoningar i bröst cancer skivor eller androgen receptor (AR) uttryck övertoningar i prostatacancer skivor25. Intressant, intra-slice livskraft övertoningar i 24 h kulturer av murina NSCLC räddades av odling i en roterande inkubation enhet, och vår senaste studie visade att livskraft förlängdes till 72 h26. Särskilt på ovansidan återstod mest livskraftiga26, godkänna att drogen svar analyser på skivor utförs bäst på denna sida av vävnaden.
Även om det återstår en fråga om hur långt vävnad skivor kan sammanfatta i situ tumör funktioner, de har använts i stor utsträckning att testa Svaren till anti-cancer, inklusive riktade läkemedel, monoklonala antikroppar och cytostatika 10,11,13,14,18,27. Vi visade nyligen att murina NSCLC skivor Visa dynamiska förändringar i spridning och onkogena signalering aktiviteter efter odling jämfört med nyklippt 0 h skivor26. Detta indikerar att det är viktigt att undersöka huruvida de riktade i situ biologiska funktionerna bevaras på rätt sätt under odling, innan störning studier. Trots dessa fynd, visade vi att tumören skivor kan modellen rumsliga svar riktade terapier, mitt läkemedel behandlingar förbli kort (24 h) och inleds i början av odlingsskålar26. Följande protokoll beskriver viktiga validering aspekter relevanta för etablering och analys av tumören slice kulturer, innan deras tillämpning i farmakologiska drogtester.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Organotypic primära explant vävnadskulturer, bland annat precision-cut skivor, representerar tredimensionell (3-D) vävnad arkitekturen samt de flercelliga interaktioner av infödda vävnad. Vävnaden skivor omedelbart skär från färska opererande tumörer bevara rumsliga aspekter intratumor heterogenitet, vilket gör dem användbara surrogat i vivo biologi. Noggrann optimering av vävnad slice villkor för förberedelse och odling är grundläggande för den prediktiva diagnostiska potentialen av tumör skiva explants. I detta avseende är murina modeller värdefulla, eftersom dessa ger en konsekvent materialflödet tumör att utföra replikera och reproducerbara experiment. Det här protokollet beskriver odling av murina lung tumör-derived vävnad skivor med hjälp av en roterande inkubation enhet, ett system som möjliggör intermittent exponering av vävnader att syre och näringsämnen. Vårt tidigare arbete visade att användning av roterande inkubation enheter förbättrar lönsamheten för vävnad jämfört med andra kultur metoder, särskilt flytande skivor och stagnerande filtret stöder. Här visar vi ytterligare att skiva tjocklek påverkar lönsamheten av odlade skivor, vilket tyder på att optimering av slice tjocklek bör göras för olika vävnadstyper. Uttalad ITH i relevanta onkogena funktioner, såsom signalering verksamhet, stromal cell infiltration eller uttryck av differentiering markörer, kräver utvärdering av intilliggande vävnad skivor av uttryck för markörer ändras genom läkemedelsbehandling eller odling själv. Sammanfattningsvis, detta protokoll beskriver generationen av murina lung tumör skivor och deras kultur på en roterande inkubation enhet och visar hur skivor bör analyseras systematiskt av uttryck för heterogen vävnad markörer, som en förutsättning innan läkemedlet svar studier.

Figur 1 representerar arbetsflödet för generering, odling och analys av precision-cut vävnad skivor härrör från murina NSCLC tumörer. För denna demonstration utnyttjade vi tumörer från en genetiskt modifierade musmodell (GEMM) härbärgerat villkorlig aktivering av KrasG12D tillsammans med förlust av Lkb1 (även känd som serin/treonin-Kinas 11), nedan kallad KL. Mus avel och lung tumör inledande utfördes enligt beskrivningen i26,28. Figur 2A visar effekten av vävnad slice tjocklek på viabilityen av skivor odlade för 24 h med hjälp av en roterande inkubation enhet. Resultaten visar att 160 µm tunna skivor innehåller stora nekrotiska områden i segmentet. Dessutom visar 250 µm tunna skivor en nekros gradient över skiva jämfört med 200 µm tunna skivor. Det är troligt att den tunnaste 160 µm fattiga övergripande lönsamhet orsakas av teknisk hantering under positionering av skivor ovanpå gallren, som dessa är bräcklig och tenderar att krypa. Däremot, när skivor är för tjock, de kan bli utsatta för brister i syre eller näringsämnen diffusion över sektorerna, framgår som i murina NSCLC explants som nekrotisk död gradient25. Det bör dock noteras att skivor med varierande tjocklekar kan genereras från en tumör, trots användning av identiska vibratome inställningar. Det rekommenderas därför att analysera flera replikat från olika tumörprover. Ännu viktigare, kräver varje vävnadstyp slice tjocklek optimering för att uppnå maximal lönsamhet, eftersom vävnad struktur och hårdhet kan påverka syresättning och näringsämnen flödet. Figur 2B -2C illustrerar kvantitativa IHC analyser av NKX2-1 uttryck, en markör för väl differentierade lunga adenokarcinom (AC) i prover odlas upp till 72 h och matchas 0 h skivor. Resultaten visar att NKX2-1 uttryck i odlade skivor jämfört med 0 h obildade skivor, vilket tyder på att processen för odling inte öppet påverkar statusen differentiering av AC tumörvävnad inte är signifikant. Figur 2D visar nyttan av tumör vävnad skivor för att bedöma effektiviteten av målinriktade läkemedel. Vi visade nyligen att Kras mutant murina ACs uppvisar hög uttryck för fosforyleras ERK1/2 (märkning ökad MAPK utbildningsavsnitt aktivitet) jämfört med adenosquamous (ASC) tumörer, medan uttryck av fosforylerade 4EBP1 (märkning mTOR aktivitet ) uttrycks på samma sätt i både AC och ASC tumörer. För att testa om dessa vägar kan vara effektivt inriktat på vävnad skivor, KL AC vävnad skivor behandlades med DMSO eller titreras mängder föreningar, nämligen 0,1 – 1 µM dactolisib att rikta den mTOR-signalvägen eller 0,05 – 0,5 µM selumetinib att rikta den MAPK-signalvägen. Resultaten visar att 1 µM dactolisib eller 0,5 µM av selumetinib är effektiva i att hämma fosforyleringen av 4EBP1 eller ERK1/2, respektive. Dessutom indikerar dosberoende hämning av de riktade phosphoproteins att vävnad skivor kan också användas för att validera fosforylering-specifika antikroppar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet för etablering och analys av murina NSCLC tumör-derived slice bladsticklingar. (A) Schematisk beskrivning av samlingen och beredning av tumör-bärande lungorna för skivning. Lungan lober skördas från en mus och tumörvävnad är dissekeras från normal vävnad. Den svarta pilspets och asterisk anger ca 4 mm och 1 mm tumörer, respektive. Den vita pilspetsen anger lungvävnad limmade till ytan på preparathållaren. Den röda pil pekar på en extra bit av normal lungvävnad stöd att behålla tumören i upprätt läge. (B) Vibratome skivning och samling av vävnad skivor. Vit pil anger skivning riktning. Samling av sekventiell skivor i en 24-well platta som innehåller kall HBSS + P/S. Skivor kan antingen vara odlade för olika tidpunkter (här, 24-72 h) för att bedöma tumör-specifik markör uttryck under odling (översta raden), eller kan användas för att utföra läkemedelsbehandlingar. C: fordonskontroll, T: läkemedelsbehandling. (C) Placera vävnad segmentet för odling med roterande inkubation enheter. Luta den 6-väl plattan så att vissa medium täcker överst i rutnätet, placera vävnad segmentet mitt i rutnätet ovanpå medium och sprida segmentet med hjälp av tången. Se till att 6-väl plattorna vikt balanserad för en smidig Rotationscykel. X: anger felaktiga, och <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: indikerar rätt placering av segmentet. (D) fotografi av FFPE blocket för en tumör slice. Svart pilen pekar på paraffin-inbäddat vävnad slice färgas med hematoxylin. (E) scheman visar snittningen ordningen på skivor i FFPE block; dessa delar kan bearbetas för att bedöma vävnad livskraft och tumör-specifika biomarkör uttryck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Figur 2: bedömning av bärkraft och tidstrender-specifik markör uttryck och riktade missbruksbehandling på NSCLC vävnad skivor. (A) representant H & E bilder av AC NSCLC skivor av de angivna tjocklekar odlade för 24 h. 200 µm tunna skivor upprätthålla bättre lönsamhet jämfört med 160 µm eller 250 µm tunna skivor. Mörk blå representerar H & E målat livskraftig vävnad och rosa indikerar pseudocolored nekrotiska områden. Ljusblå anger regioner uteslutits från analysen, antingen på grund av dålig vävnad kvalitet eller närvaro av fibröst stroma. T1 och T2 representerar biologiska replikat härrör från två olika tumörer. Skalstapeln = 500 µm. (B) representativa IHC bilder av NKX2-1 uttryck i AC skivor odlade för angivna punkter. Pilen anger det område som visas i högre förstoring. Resultaten visar att NKX2-1 uttryck inte ändras i odlade skivor jämfört med 0 h skivor. Skalstapeln = 500 µm respektive 50 µm för låga och höga förstoringar,. (C) kvantifiering av de data som visas i (B). (D) representant IHC bilder av fosforylerade 4EBP1 eller pERK1/2 uttryck i 0 h skivor eller skivor behandlas med DMSO eller titreras mängder dactolisib (dact, översta raden) eller fosforyleras pERK1/2 uttryck i 0 h segment eller skivor behandlas med DMSO eller selumetinib (sel, nedersta raden). Svarta fyrkantiga rutor visar områden visas i högre förstoring. Skalstapeln = 1 mm eller 50 µm för låg eller hög förstoring, respektive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Vi tillhandahåller en metod för generering, odling och systematisk analys av organotypic skivor härrör från murina lungtumörer. Vi beskriver också hur du optimerar för slice tjocklek och hur du väljer läkemedelskoncentrationen att behandla tumören skivor.

Etablering och analys av tumören Slice Explants som en förutsättning för diagnostiska tester

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i preklinisk forskning, där läkemedelsresponsstudier i tumörskiva explants kan tjäna diagnostiska syften. Den största fördelen med denna teknik är att skiva explants kan för ett kort tidsfönster modell den komplexa biologi inhemska vävnader inklusive rumsligt fördelade funktioner. Även om denna metod kan ge insikt i användningen av skivor från murin lungtumörer, det kan också tillämpas på andra vävnadstyper inklusive mänskliga vävnader.Till att börja med förbereda vibratomen och utföra en VibraCheck enligt instruktioner som finns i manualen. Fyll sedan varje brunn av 24-brunnsplattan med en milliliter av Hanks balanserade saltlösning kompletterad med penicillin och streptomycin och håll plattan på is. Sätt in 25-gauge nålar i alla fyra tassar av en avlivad mus placeras på en frigolit lock så att bröstet exponeras och djuret sträcks.Spraya 70%alkohol på ytan av den exponerade huden. Använd sax placeras i ett vinklat läge för att skära upp huden från buken mot bröstet och upp till halsen regionen. Sträck huden på vardera sidan med hjälp av tänjningar och sätt in 25-gauge nålar.Skär upp bukregionen. Skär sedan upp bröstkorgen och membranet för att exponera lungan och hjärtat. Exponera luftstrupen genom att skära bort den omgivande vävnaden.Dissekera lungorna, tillsammans med hjärtat. Placera vävnaderna i ett 50-milliliter rör som innehåller 30 milliliter iskall HBSS kompletteras med Pen-Strep placeras på is och gå vidare till nästa steg så snabbt som möjligt. Överför nu de tumörbärande lungorna till en 10-centimeters vävnadskulturplatta.Använd steril sax och tivlingar för att separera lungloberna och välj lober med tumörer på ytan för skivning. Placera en lunglob med en tumörvävnad på en bit filterpapper för att undvika att halka och skära ut en del av den normala lungan eller ytterligare tumörvävnad som omger tumören med hjälp av en steril skalpell för att generera en plan vävnad bit yta. Doppa den platta sidan i en droppe cyanoakrylatlim och montera den på vibratome-preparathållaren så att tumören vetter mot bladet i upprätt läge, och låt den torka i två till tre minuter.Placera vibratome-preparathållaren i metallbuffertstråget. Fyll brickan med kall HBSS kompletterad med Pen-Strep tills vävnaden är nedsänkt i bufferten. Täck buffertbrickan med plexiglaslocket som är försett med instrumentet och placera brickan i ett vitt isbad och tillsätt is för att hålla vävnaden sval under skivning.Fäst det vita isbadet på vibratomen. Välj sedan lämpliga skivningsinställningar och börja skivning. För vibratombladet till skivningsläge och ställ in skivningsfönstret.Använd sterila tlyck för att samla skivorna i en 24-brunnsplatta fylld med en milliliter HBSS kompletterad med Pen-Strep per brunn och håll dig på is. Medan du håller reda på skivningsordningen markerar du varje brunn av 24-brunnsplattan enligt experimentplanen. Samla en vävnadsskiva i anslutning till de odlade skivorna som en noll timmar eller okulterad referens.Samla minst tre referenssegment för att representera toppen, mitten och botten av vävnaden. Och när skivning är klar, fortsätta med fastställande och bearbetning. Därefter förbereder du en sex-brunnsplatta som innehåller 2,5 milliliter odlingsmedium per brunn genom att placera titannät i den.Se till att inga luftbubblor bildas mellan titannätet och mediet. För att ladda en skiva på gallret hålla sex-väl plattan i ett vinklat läge så att en del av mediet täcker gallret. Placera sedan skivan i mediet på gallret och använd tuppar för att sprida den.Efter att ha placerat skivorna, lasta sex-brunnsplattorna på den roterande inkubationsenheten som placeras inuti en befuktad inkubator som bibehålls vid 37 grader Celsius med 95%02 och 5%CO2. Starta rotationscykeln. För långsiktig odling fylla på odlingsmediet varje dag genom att använda sterila trikåer för att lyfta gallret som innehåller vävnadsskivorna och placera den i en tom brunn av sex-brunnsplattan.Ersätt 70%av mediet med färskt odlingsmedium och placera tillbaka gallret. Fortsätt rotationscykeln som tidigare. För läkemedelsbehandling på tumörskivorna lägger 2,5 milliliter media med den utspädda drogen eller fordonskontrollen i sex-brunnsplattan.Placera titangallren i brunnarna och placera sedan skivorna på gallren som tidigare gjorts. Efter att ha utfört behandlingarna i 24 timmar, fortsätt med fixering och bearbetning. För att börja fästa önskad skiva överför den försiktigt med hjälp av tlyck i en 10-centimeters tallrik som innehåller ett indränkt filterpapper fyllt med två till tre milliliter PBS och låt den flyta.Lyft sedan ut filterpapperet med ett par tnyningar och placera det i en histo-kassett. Överför filtrerpapperet i en histo-kassett. Tillsätt en droppe utspädd hematoxylin ovanpå vävnadsskivan för att markera skivans position för de efterföljande stegen.Stäng kassetten, och överför den till 4% neutral buffrad formalinlösning och lämna över natten vid fyra grader Celsius. Efter tvättning och bearbetning av kassetten enligt beskrivningen i protokollet, öppna histo-kassetten och använd en skalpell för att försiktigt lyfta det fasta segmentet från filtrerpapperet. Kassera filtrerpapperet och överför skivan till en form som innehåller flytande paraffin.Använd en platt vikt för att trycka vävnaden mot botten av inbäddning mögel för att säkerställa jämn snittning. Placera den nedre delen av histo kassetten ovanpå formen. Tillsätt flytande paraffin ovanpå den.Och låt formen svalna på en kall tallrik i 30 minuter. Efter det separera den kylda formen från paraffinblocket. Använd en mikrotom för att förbereda fyra mikrometer tunna sektioner av FFPE vävnads slice block.Trimma bort överskottet av paraffin som omger vävnaden. För att erhålla jämna sektioner i hela vävnaden justera vinkeln på blocket så att ytan av blocket är horisontellt orienterad med avseende på bladet. Med hjälp av en tunn pensel samla sekventiell vävnad delar av paraffin-inbäddade vävnad skiva börjar vid den övre delen av glaset diabilder.Fortsätt samla de sektioner av de djupare vävnadsskikten till mitten, följt av den nedre delen av glasglasen. Insamling av sektioner från olika lager av varje vävnads slice till objektet diabilder görs för att möjliggöra fångst av potentiella kultur-inducerad lutningar i viabilitet, cell migration eller biomarkör uttryck. Efter att samla de avsnitt fortsätta med sin bearbetning och ytterligare analys som beskrivs i protokollet.Vävnad skiva tjocklek kan påverka livskraften i odlade skivor. I detta fall visar 250-mikrometer tjocka skivor ökade nekros gradienter jämfört med 200-mikrometer tjocka skivor på grund av tjockare skivor blir benägna att brister i syre eller näringsämnen diffusion över skivorna. Men 160-mikrometer tunna skivor innehåller stora nekrotiska områden troligen orsakas av teknisk hantering under positionering av skivorna eftersom dessa är bräckliga och tenderar att krypa.Analys av NKX2-1, en markör för väl differentierade lunga adenocarcinom, visar att dess uttryck inte väsentligt ändras i odlade skivor jämfört med noll timme oodlade skivor. Kvantitativ analys av NKX2-1 uttryck bekräftade ytterligare att uttrycket inte väsentligt ändrats i odlade kontra oodlade skivor, vilket tyder på att processen för odling inte synligt påverkar differentiering status adenocarcinom vävnad. För att testa om tumörvävnad skivor kan användas för att utvärdera effekten av riktade läkemedel, de behandlades med DMSO eller titrerade mängder av föreningar.När behandlas med en mikromolar dactolisib som riktar sig till mTOR utbildningsavsnitt fosforylering av 4EBP1 hämmades. 0,5 mikromolarslumetinib som riktar sig mot MAP-kinasvägen var effektivt för att hämma fosforylering av ERK1/2. Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man arbetar med och kritiskt analysera skivor nyklippt från dyrbara tumör vävnader.Vår tidigare postdoc, Katja Narhi, bidrog avsevärt till inrättandet av denna metod i samarbete med kollegor i IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Använda BLT Humaniserad Pigg som en stamcell baserad genterapi tumörmodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Upprättande och optimering av en hög genomströmning Setup för att studera<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Och<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som en modell för Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserad analys för att studera migration av dendritiska Murin hudceller i dränerande lymfkörtlar under infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analys av 18FDG PET/CT Imaging som ett verktyg för att studera Mycobacterium tuberculosis infektion och behandling i icke-mänskliga primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zikaviruset specifika diagnostiska epitop Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening verktyg för identifiering av Viral immunmodulerande och värd antivirala faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...