Name: establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Bu araştırma alınan iş mali desteği yenilikçi ilaç girişimi ortak girişim anlaşması no 115188, Helsinki Üniversitesi doktora programı Biyomedikal burs (A.S.N.) ve Sigrid Juselius hibe ve Orion-Farmos temelleri (E.W.V.). Biz içtenlikle teşekkür bizim PREDECT doku dilim platformu konsorsiyum üyeleri (Taija af Hällström ve SIV Knaappila rotator sistem kurma desteği ve Riku Turkki desteği ile MATLAB analiz için. Jouko Siro Şekil 1 fotoğraf yakalamak için teşekkür etti. Histolojik slaytlar, tarama için FIMM WebMicroscope takım teşekkür ediyoruz ve laboratuvar hayvan merkezi yetiştiriciliği için destek.

Bu çalışmada açıklanan tüm fare deneyleri Fin Ulusal kurulu, hayvan deney yönergeleri izleyerek gerçekleştirilen ve Helsinki Üniversitesi ve devlet il deneysel hayvan Komitesi tarafından kabul edildi Southern Finland (lisans numarası ESAVI/9752/04.10.07/2015) ofisi.
1. dilimleme önce hazırlıklar
<ol><li>Aşağıdaki belgeleri hazır tutmak: vibratome numune sahibi, vibratome tepsi, 10 cm kültür plaka, 24-şey plaka, 10 mL pipet, pipet çocuk, atık torbası, % 70 arabellek aletleri ve doku yapıştırıcı dezenfekte alkol 50 mL tüp içinde.</li>
	<li>Vibratome hazırlamak: % 70 ile bıçak sahibi sil alkol, yeni bir bıçak eklemek ve bir vibrocheck (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) kılavuzda sağlanan yönergelere göre gerçekleştirin. Not: Blade dikey saptırma en aza indirir ve kaliteli dilimleri sağlar gibi vibrocheck adımı gerçekleştirmeniz önemlidir.</li>
	<li>Her doldurmak de 24-şey plaka ile 1 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin (HBSS + P/S); HBSS), plaka buz üzerinde tutun.</li>
	<li>F12 Kültür 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 2 mM glutamax, 22 mM glikoz ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile desteklenmiş orta hazırlayın. Not: Tümör dilim kültür orta ve büyüme faktörü takviyeleri tümör doku25bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>F12 orta gerekli miktarı 1.4. adımda açıklandığı gibi aynı kompozisyon kullanarak ama FBS atlama ilaç tedavisi için hazırlayın. Not: büyüme faktörleri serum oncogenic kültürlü dilimler halinde sinyal etkileyebilir beri kısa süreli uyuşturucu pertürbasyon araştırmalar tümör dilimleri serum-Alerjik Orta önerilir. Daha uzun vadeli dilim kültürler analiz edilir, ilk orta serum-alerjik etkisi doku canlılığı ve tedavi edilmezse dilim kültürlerde tümör özgü marker ifade değerlendirmek önemlidir.</li>
</ol>2. tümör taşıyan akciğerler topluluğu
<ol><li>Zahmetli nefes belirtileri ve vücut kilo kaybı ortaya çıktığında bir tümörü taşıyan fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Not: CO2-aracılı ötenazi dilim canlılığı veya hipoksik yanıt alabilme yolu ile oncogenic faaliyetleri üzerinde bir etkisi olabilir akciğerler hipoksik koşullarda ikna etmek için bilinir.</li>
	<li>Böylece göğüs maruz içinde tüm dört paws, 30 G iğneler ekleyerek euthanized fareyi bir Styrofoam kapağı üzerine streç.</li>
	<li>Doğru göğüs ve boyun bölgesi kadar karın derisini kesmiş. Göğüs kafesi ve akciğer ve kalp ortaya çıkarmak için diyafram kesmiş. Makas doku hasarı önlemek için açılı bir pozisyonda tutun.</li>
	<li>Tümörü taşıyan akciğerler kalp ile birlikte incelemek ve buz gibi HBSS + P/S 30 mL içeren bir 50 mL tüp içine koyun; tüp buz gibi tutmak ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin. Not: Akciğer tümörlerinin işlemedeki gecikmeler oncogenic işlevler, örneğin yol faaliyetleri sinyal değiştirebilir.</li>
</ol>3. nesil hassas kesim akciğer tümörü dilimleri
<ol><li>HBSS + P/S tümörü taşıyan akciğerlerde laminer kukuIeta içinde sürekli bir 10 cm doku kültürü tabak içine aktarın. Steril makas ve forseps kullanarak Akciğer lobları ayırın ve LOB tümörü yüzeyinde Dilimleme için seçin. Not: Tümör > 3 mm boyutunda Dilimleme için uygundur. Temizlenen tümör bölgesi vibratome bıçak yüzler öyle ki büyük tümör tavizler çevreleyen doku sertlik farklılıkları nedeniyle Dilimleme normal akciğer doku beri Dilimleme geçiren tümör dokusu normal doku uzak ayrılmalıdır.</li>
	<li>Uzak steril neşter ile tümör çevreleyen normal akciğer doku parçası kesim tarafından bir düz doku parça yüzey oluşturmak ve düz slayt içinde bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı daldırma. Tümör dik bıçak yüzleri bu yan vibratome'nın numune tutucu üzerine bağlarsınız. İzin için 2-3 dakika kuru tutkal. Not: numune sahibine yapıştırılmış normal akciğer dokusu tümör doku Dilimleme ile engel değildir ve normal doku ulaşılmadan Dilimleme durdurulur. Tümör doku bazen onun dik duruma ödün numune sahibine yapıştırılmış normal akciğer dokusunun süngerimsi doku nedeniyle virajlı. Bu durumda, ek normal akciğer destek doku dik (Şekil 1A III) tümör korumak için önceden monte edilmiş normal akciğer dokusunun yanında bir parça tutkal.</li>
	<li>Numune tutucu metal arabellek tepsisine koyun ve doku arabellekte batırılır kadar soğuk HBSS + P/S ile doldurun. Metal arabellek tepsi beyaz buz banyosu üzerine yerleştirin ve çok doku Dilimleme süre serin tutmak için buz ekleyin.</li>
	<li>Beyaz buz banyosu için vibratome ekleyin. Uygun Dilimleme ayarlar seçin: 2,5-2,8, hız 0.10-0,14 arasında Dilimleme arasında değişen genlik ms ve 160-250 µm arasında değişen bir kesme kalınlığı. Not: Dilimleme ayarlar doku sertliğini göre ayarlanması gerekir. Sert doku daha yumuşak doku dilime daha kolay ve daha yumuşak doku gerektirir daha düşük hız ile Dilimleme (0,1-0,12 ms) ve daha yüksek genlik (2.6-2.8). 4 – 5 mm büyük tümör genellikle 15-20 dilim 200 µM kalınlık sağlar. Kısa vadeli ekimi için fare tümörler laminer başlık dışında yarı steril koşullarda dilimlenmiş. Ancak, klinik tümör her zaman olası bulaşıcı insan dokusu içinde maruz önlemek için bir sınıf II Biyogüvenlik laminer başlık içinde dilimlenmiş.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak, yakından takip içinde dilim dilimlenmiş sipariş edilmesi HBSS buz üzerinde düzenlenen 24-şey plaka ayrı Wells 1 ml dilim toplamak. Her işareti de, deneysel planına göre 24-şey plaka. Örneğin, mark sıralı kuyu kültür zaman puan veya 0 h, araç kontrol (C), olarak 24-şey plaka yapımı tedavi (T) (Şekil 1B II) uyuşturucu. Not: Değil rahatsız veya bu açı ile ilgili olarak tümör yönünü sonraki dilimleri kalınlıkları tutarsızlıklarına yol açan bıçak değiştirecek gibi tümör doku bir dilim toplarken çekin.</li>
	<li>Tüm dilimler toplandığında onları kültür orta iyi başına 2.5 mL içeren bir 6-şey plaka yerleştirilmiş titanyum ızgaralar (kılavuz başına 2-3 dilim) aktarmak. Titanyum kılavuz ve orta arasında hiçbir hava kabarcıkları oluşmuş emin olun.<ol>
<li>Bir dilim ızgara üzerine yüklemek için kılavuz orta bölümünü kaplar 6-şey plaka açılı bir konumda tutmak ve ızgara üzerinde orta dilimi yerleştirin; Forseps Bu bukleler dilimi yaymak için kullanın. 6-iyi plakaları % 95 hava ve % 5 CO237 ° C'de tutulan bir oksijen kuluçka makinesi içine yerleştirilen dönen kuluçka birimi üzerine yük ve rotasyon döngüsü (Şekil 1 c ı-II) başlatın. Not: Metalik ızgaralar ve 6-şey plakaları doğru dönen üniteyi açmadan önce dengeli kilo olması gerekir. Kılavuz ortasında dilimleri yerleştirin ki böylece onlar tam olarak hava ve sıvı döndürme döngüleri aşamalarında arasında geçiş yapar. Çok düşük veya yüksek yerleştirilir dilimleri uygun şekilde oksijen veya besin (Şekil 1 c ben), doku canlılığı olumsuz etkileyebilir maruz değildir. Dilimi zaman zaman aşağı slayt olabilir gibi dilimin konumunu ekimi sırasında ızgara üzerine getirmeniz önemlidir. Bu kültür başlangıçlı içinde 1-2 h olursa, konumunu düzeltin ve aşağı notu Bu örnek zarar görmüş olabilir. Doku canlılık önemli ölçüde yanlış oksijen ve besin kaynağı tarafından etkilenmiş olarak uzun bir süre için mispositioned dilimleri atılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir doku dilim kültürlü dilimlere bitişik bir 0 h, kültürsüz, başvuru toplamak. Üst, orta ve merkezi dilimlenmiş doku temsil etmek için en az üç başvuru dilimleri toplamak. 5. 1'açıklandığı gibi saptamak 0 h dilimleri hemen ve işlem. Not: dilim sayısı sınırlı ise, birden fazla bileşik tedaviler veya teknik çoğaltır yapılırsa, Örneğin, onun komşu 0 h örnek ile tedavi her örneğinin karşılaştırmalar zor olabilir. Bu gibi durumlarda, en yakın 0 h dilim (en az 400-600 µm apart) göreli doku canlılığı veya ifade kültür başlangıçlı, ilgili işaretleri değerlendirmek için kullanın.</li>
	<li>Uzun vadeli ekimi için her gün kültür orta doldurmak. Steril forseps kullanarak doku dilimler içeren bir kılavuz kaldırın ve 6-şey plaka boş bir kuyuya yerleştirin; orta % 70'i ile taze kültür orta yerine ve ızgara orta geri yerleştirin. Döndürme döngü adım 3.6 açıklandığı gibi devam.</li>
</ol>4. küçük molekül inhibitörleri dilimlerle tümör tedavisinde
<ol><li>Tedavi orta bileşikler gerekli konsantrasyonları hazırlayın. Tipik olarak, hücre kültürleri içinde ölçülen IC50s göre 10 kat daha yüksek ilaç konsantrasyonu dokusu dilimlerin hedef inhibisyon elde etmek için gereklidir. Belirsiz sitotoksisite önlemek için konsantrasyonları her bileşik için en az etkili konsantrasyonu elde etmek için bir dizi test. Burada, test ettik 0.1-1 PI3K/mTOR inhibitörü dactolisib ve 0,05 – 0,5 µM MEK inhibitörü selumetinib fare NSCLC dilimleri üzerinde µM.</li>
	<li>Medya ile seyreltilmiş uyuşturucu veya DMSO ya da diğer araç kontrol 2.5 mL 6-şey plaka ekleyin. Titanyum ızgaralar kuyu yerleştirin.</li>
	<li>3.6. adımda açıklandığı gibi doku dilimleri ızgaralar üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Araç ya da ilaç tedavileri 24 h devam et doku fiksasyon ve 5 bölümde açıklandığı gibi parafin bloklara dilimleri işleme gerçekleştirir. Not: Uyuşturucu tedavi süresi deneme, amacı bağlı olarak dokusu dilimlerin kültür döneminde analiz in situ doku işlevleri korumak yeteneği de dikkate alınarak hale getirilebilir.</li>
</ol>5. fiksasyon ve dokusu dilimlerin işlenmesi
<ol><li>Kültürsüz 0 h başvuru veya PBS içinde batırılmış bir filtre kağıdı üzerine kültürlü dilim çýkýntýdan.<ol>
<li>Bunu yapmak için 2-3 mL PBS bir 10 cm tabak içinde ekleyin, PBS dilim float izin ve 'o forseps bir çift ile dilim filtre kağıdı üzerine kaldırarak balık'.</li>
		<li>Filtre kağıdı bir histocassette aktarmak ve seyreltilmiş hematoksilen (1:1. deiyonize suyla) gözle görülür (Şekil 1 d) sonraki işlem adımları sırasında dilimin konumunu işaretlemek için doku dilim üzerine bir damla ekleyin.</li>
		<li>Kaset kapatın ve % 4 tarafsız tampon formalin çözüm aktarın. Dokular gecede 4 ° C'de düzeltmek Not: filtre kağıdı üstüne dilim yerleştirerek süre dilimi üst bölümünde yukarı dönük olduğundan emin olun; Bu üst, orta ve alt bölümünde bir dilim kesit ve 6,3 adımda anlatıldığı gibi analiz sırasında takip etmek gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, kasetleri transfer % 70 alkol ve hemen parafin katıştırma doku işleme adımının ile devam edin.</li>
	<li>Doku işlem önce histocasettes % 100 yıkama alkol 2 x 10 dk için. Bu durumda, bir mikrodalga İstasyonu doku işleme için kullanın. 1 mm doku kalınlığı için kullanılan program seçin ve Kılavuzu (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) sağlanan yönergeleri izleyin. Not: diğer doku işleme makinaları kullanırken, ince bir doku örnekleri için uygun programı kullanın.</li>
	<li>Parafin gömme, bir histocassette açın ve filtre kağıdı dilimden çýkýntýdan için neşter kullanın. Filtre kağıdı atmak ve dilimi Sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.<ol>
<li>Doku karşı gömme kalıp, örneğin düz ağırlığı bile kesit emin olmak için alt tuşuna basın. Üstünde tepe-in kalıp histocasette alt kısmı yer, 30 dk için kalıp soğumaya soğuk pate tarih ve kalıp parafin blok ayırın. Not: yatay katıştırma alternatif olarak, tümör dilim dilim dik bir pozisyonda konumlandırma tarafından dikey olarak gömmek mümkündür. Dikey bölümleri kolayca canlılığı veya işlev işaretçisi ifadedeki tek bölüm 25degradeler analizine izin verir. 6.2. adımda açıklandığı gibi kesit parafin yatay olarak gömülü dilimleri ile degrade analiz gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. işleme ve analiz Formalin sabit ve parafin gömülü (FFPE) doku
<ol><li>Bir microtome kullanarak FFPE doku dilim blokların 4 µm ince bölüm hazırlamak. Blok yüzeyini bıçak ile ilgili olarak yatay olarak yönlendirilmiş kesit zaman blok açısını ayarlamak; Bu bile bölümleri doku boyunca elde etmek gereklidir.</li>
	<li>Bölümler arasında kültürlü dilimleri dilimleri veya degradeler biyomarker ifade yakalama bir potansiyel kültür kaynaklı canlılığı degrade, hücre geçiş etkinleştirmek için nesne slaytlarda her doku dilimin üst, merkezi ve alt katmanlardan toplamak aşağıda açıklandığı gibi.</li>
	<li>Parafin gömülü doku dilim bölümlerini sıralı doku ilk cam slaytlara üst kısmındaki toplamak. Cam slaytlar (Şekil 1E) alt bölümü tarafından takip orta derin doku katmanları bölümlerini toplama devam edin. Not: bir cam slayt üzerinde üç bölüme kabul ettirmek için uzakta katıştırılmış doku dilim çevreleyen parafin fazlalığı kırpın.</li>
	<li>37 ° C'de kuru gecede bölümlerine izin ve H & E boyama veya immünhistokimya ile aşağıda anlatıldığı gibi devam edin. Not: FFPE bölümleri yüksek sıcaklıklarda veya uzun bir süre için depolanan antigenicity kaybı oluşabilir. Parafin kesitler 4 ° C'de depolanan tavsiye edilir ve kesit sonra 6 ay içinde IHC analizleri yapılmalıdır.<ol>
<li>H & E boyama, deparaffinize ve parafin bölümler aşağıdaki gibi suyla temasa: ksilen 3 x 5 min, % 100 için alkol 3 x 1 dk, % 96'sı için alkol 2 x 1 dk, % 70 alkol 1 x 1 dk ve deiyonize su 2 x 1 dk. için.</li>
		<li>Taze filtre uygulanmış hematoksilen çözüm için 10 dk bölümlerde kuluçkaya ve dokunun 5 dk. Dip bölümleri asit alkol akan suyun altında yıkayın (%1 HCl % 70 alkol) 2 kez ve musluk suyu 5 min % 0.5 eozin için 2 m ile kuluçka takip için çalışan altında yıkama için içinde.</li>
		<li>Eozin adım takip kurutmak bölümleri aşağıdaki gibi alkol ve Ksilen çözümleri, slaytları çeker tarafından: % 96'sı alkol 2 x 15 s, %100 alkol 3 x 30 s, ksilen 3 x 1 dk için. Son olarak, bölümleri montaj ksilen tabanlı ortamda gömün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. doku canlılığı ve biyomarker ifade Analizi
<ol><li>Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek H & E lekeli slaytlar bir tarayıcı kullanarak tüm slayt taranmasını oluşturarak. Doku viability değerlendirmek için anlık dilimler üst, orta ve alt bölümlerini temsil eden doku taramaları alabilir.<ol>
<li>Fotoğraf manipülatör yazılımı kullanarak el ile maskeleri nekrotik bölgeler MATLAB kullanma miktar tarafından takip dokuların nekrotik alanlar üzerinde çizin.</li>
		<li>Bizim önceki çalışma (Närhi vd., Şekil S2B ve C)26yılında bitmiş gibi yakın 0 h dilime göre farklı zaman noktaları için ekili dilimleri nispi canlılık hesaplayın. Benzer şekilde, üst, orta ve alt kısmındaki kültürlü bir dilim canlılığı miktarının tarafından potansiyel içi dilimli canlılığı degradeler değerlendirmek ve onun en yakın 0 h dilim için her bölümün nispi canlılık hesaplayın. Not: ex vivo kültür koşulları biyolojik yanıt iken fare NSCLC dilimleri sadece ekimi nekrotik hücre ölümüne neden olmaktadır, tümör doku bağlı olarak değişir. Örneğin, HIF1α, ER ve F4/80 tarafından işaretlenmiş makrofajlar degradeler bir meme kanseri modeli25türetilmiş filtresi destekli dilim kültürlerde tespit edildi. Bu nedenle, H & E - yanı sıra IHC tabanlı analizler kültürlü dilimleri her doku türü için dikkate alınması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IHC parafin kesitler üzerinde gerçekleştirin. Aşağıdaki IHC iletişim kuralı bir başlangıç noktası ve daha fazla en iyi duruma getirme için diğer antikorlar gerektirir. Kısaca, deparaffinize ve parafin bölümler aşağıdaki gibi suyla temasa: ksilen 3 x 5 min, % 100 için alkol 3 x 1 dk, % 96'sı için alkol 2 x 1 dk, % 70 alkol 1 x 1 min ve deiyonize su 2 x 1 dk için.<ol>
<li>Antijenik epitopları ortaya çıkarmak, 10 mM sitrik asit pH 6 PT modülündeki kullanarak ısı-aracılı antijen alma gerçekleştirmek için takip %1 sığır Serum Albumin (BSA) ve % 10 ile Normal keçi Serum (NGS) 1 x PBS için ortam sıcaklığı (21-23 ° C), 30 dk içinde bloke ederek.</li>
		<li>% 1 BSA ve % 5 içinde seyreltilmiş birincil antikor kuluçkaya NGS 1 x PBS, ortam sıcaklığı, 1-2 h için de içinde. Anti-tavşan ikincil antikor, 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) kullanarak algılama tarafından takip ortam sıcaklığında 30 dakika ile kuluçkaya.</li>
		<li>Bölümler (1: 10'a deiyonize suyla seyreltilmiş) hematoksilen 30 s ve dehidratasyon tarafından aşağıdaki gibi alkol ve Ksilen çözümleri, slaytları çeker tarafından takip 5 min için musluk suyu altında yıkama ile counterstained: % 70 alkol 1 x, % 96'sı alkol 2 x, %100 alkol 3 x, ksilen 3 x ( Adım 1 dk). Son olarak, bölümleri montaj ksilen tabanlı ortamda gömün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm slayt tarama IHC lekeli slaytların elde etmek, bir büyütme oranı 1:4 kullanarak bir resim görüntüleyici kullanarak TIFF görüntüleri olarak dışa aktarın ve ImageJ kullanarak quantifications gerçekleştirmek. Not: quantifications için alternatif tarayıcı, 20 X veya 40 X büyütme mikroskobik görüntüler elde edilebilir gibi. Görüntü büyütme sayısal için işaretçiyi bağlı olarak seçilebilir; yüksek büyütme görüntüleri nükleer boyama için süre sitoplazmik tavsiye edilir veya membran işaretleri 20 X görüntüleri kullanarak quantified.<ol>
<li>Miktar nükleer işaretleri için bu durumda NKX2-1 ifade, her görüntü Fiji-ImageJ kullanarak 16-bit görüntüleri dönüştürmek ve görüntü analizi için resim yüklemek.</li>
		<li>Görüntü analiz boru hattı bağlı olarak analiz özelleştirmek. Bu protokol için aşağıdaki potansiyel NKX2-1 pozitif hücre çekirdeği miktar için kullanın: birincil nesneleri tanımlamak | Nesne yoğunluk ölçme | Nesneleri filtre (en az değer 0.0025 =) | Math. hesaplamak Sonuçları DAB lekeli çekirdekleri çekirdeklerin sayısı yüzde olarak gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution.">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).</li><li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors:+Impact+of+Genetic,+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification.">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li><li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response.">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer.">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li><li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors.">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li><li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro].">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li><li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+cultures+of+chick+embryo+lung;+some+histologic+and+histochemical+aspects].">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li><li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Organotypic+culture,+on+natural+and+artificial+media,+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis].">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des s&#233;ances de la Soci&#233;t&#233; de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-death+receptor+5+(DR5)+antibody+(TRA-8)+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model.">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li><li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li><li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue.">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li><li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer.">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).</li><li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue.">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture.">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells International. , 959807 (2015).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement.">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li><li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro:+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices.">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187 (2015).</li><li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours.">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li><li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity.">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169 (2015).</li><li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1.">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li><li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+and+characterization+data+for+2D,+3D,+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project.">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170 (2017).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

3D kültür ve organoids, dahil olmak üzere çeşitli karmaşık vitro tümör modelleri mimarisi ve oncogenic görev-in vivo tümör doku29,30özetlemek için geliştirilmiştir. Ancak, 3D kültürler veya organoids kurulması doku ayrılma ve bir tek hücre türü Seçici büyüme veya ortak kültür seçme kaç hücre tiplerinin bir yapay ortamda içerir. Sonuç olarak, modelleri gibi eksik olarak tümör heterojenite ve tümör-stroma etkileşimleri inceliklerini yakalamak. Organotypic tümör dilimleri, öte yandan, geniş manipülasyon olmadan in situ tümör doku mimarisi ve biyolojik karmaşıklığı korumak. Bu yeteneği kendi yerel microenvironment modeli tümör hücreleri doku dilim onları özellikle çekici preklinik çalışmaları için işler. Biz daha önce kurulması ve hassas kesim tümör dilimleri analizi için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı rapor ve gösterdi ki, destekler filtre uygulamak için karşılaştırıldığında, dönen bir kuluçka birimi kısa vadeli fare NSCLC dilim kültürler25 canlılık geliştirmek , 31. Bununla birlikte, ekimi birimleri dönen üzerinde teknik olarak zordur ve sürekli izlenmesi gerekir. Biz burada tümör doku dilim üretimi ve pratik kullanımı bir kuluçka birimi onları kültür dönen yanı sıra dilimleri in situ tümör biyolojisi, uyuşturucu önce bir ön koşul yakalama yeteneği izlemek için yöntemleri eşlik için bir iletişim kuralı mevcut tepki testi.
Birkaç kritik protokolündeki doku bütünlüğü ve tümör dilimleri canlılığı garanti. Normal akciğer dokusu çevreleyen tümör, vibratome ile tutarsız kalınlığında dilimler oluşturmak veya dilimleri, doku ve sertliği normal ve tümör doku arasındaki farklılıkları nedeniyle zarar verebilir. Böylece tümör dilimleme önce çevresindeki normal akciğer doku kaldırmak önemlidir. Başka bir kritik dikkatle her doku türü için optimize edilmelidir Dilimleme kalınlığı adımdır. Ayrıca, bir kez dilimlenmiş, bu dilimi çok doğru sağlamak için yaklaşık kılavuz ortasında, kültür orta ve oksijen pozlama daldırma aralıklı yerleştirilir önemlidir. Son olarak, bir dilim orta olarak düşüş olabilir gibi bir dilim konumunu, döndürme süresi sırasında izlemeniz önemlidir; daha fazla bu durumda, Eylemler iletişim kuralının 3.6 adım açıklandığı gibi alınabilir.
Doku bütünlüğü sağlamak için işleme ek olarak, aynı zamanda nasıl benzer dilimi yerel doku yorumlamaya IHC analizde kritik adım vardır. Bizim önceki çalışma fare NSCLC tümörler oncogenic sinyal faaliyetleri26belirgin içi tümör kayma heterojenite sergi gösterdi. Bu denetimler için dağınık şekilde farklı doku kullanımı dilimler veya uyuşturucu tedavi örnekleri güvenilir deneysel verilerin yorumu etkileyebilir ve bu nedenle yakından bitişik dilimler denetimleri ve test örnekleri kullanılmalıdır anlamına gelir. Biz daha fazla gösterdi ki yayılması sırasında veya taze kesilmiş kültürsüz 0 h dilimleri ifadede oncogenic Fosoprotein in situ tümör için benzer kültürlü dilimleri değişmiş oncogenic Fosoprotein ifade, özel olarak değiştirilmiş p4EBP1 gösterdi ve pSRC yanı sıra değişmiş yayılması Ki67 IHC tarafından analiz. Değiştirilmiş p4EBP1 ifade benzer şekilde 24 h içinde algılandığı insan NSCLC ve prostat kanseri dilim kültürler (Narhi ve ark., tamamlayıcı şekil S3B-S3C, S5 ve S7)26. Bu bulgular kültürlü dilimleri onların en yakın 0 h kültürsüz dilim ile karşılaştırılması in situ tümör işlevleri kültürlü dilimleri içinde korunması değerlendirmek önemlidir onaylamaz.
Organotypic dilimleri25canlılık geliştirmek rağmen teknik açısından rotator sistemiyle sınırlamalar vardır. Dokusu dilimlerin titanyum ızgaralar üzerine yerleştirilmesi ekler filtre kıyasla daha zor ve dönen bir kuluçka birimi mevcut olmayabilir olduğunu. Alternatif olarak, durgun filtre destekler kullanılabilir ancak hava filtresi degradeler canlılık ve HIF1α ifade tarafından ölçülen hipoksi hızla filtre-taraftar dilim oluşur gibi o zaman dilimleri kullanımını yalnızca hava maruz tarafından analiz edilmelidir kültürler (Davies ve ark., Şekil 5 ve şekil 7A-7B)25. Biz daha fazla tümör dilim kültürler değişmiş yayılması ve onların yerli tümörler26, muhtemelen yara iyileşmesi yanıt veya dilim ex vivo metabolik adaptasyon nedeniyle karşılaştırıldığında oncogenic sinyal faaliyetleri sergilemek göstermiştir kültür32. Brüt morfolojik özellikleri fare NSCLC tümörlerin 72 h ekimi sırasında tutulan rağmen proliferatif değişiklikler kültür kaynaklı doğru ekili dilim sınıflandırma etkileyebilir. Böylece, dokusu dilimlerin yalnızca kısa süreli fonksiyonel çalışmaları için yararlı.
Dönen bir kuluçka birimi kullanımı, en azından kısmen içi dilimli canlılığı veya biyomarker ifade degradeler, özellikle ilk 24 saat sırasında kültür kurtarır. Bütünlük ve işlevi için doğrulanmış olduktan sonra bu ilaç tedavisi araştırmaları gibi fonksiyonel çalışmalar için doku malzeme sağlar. Uyuşturucu yanıt profil oluşturma ek olarak, uyuşturucu tedavi aşağıdaki değiştirilmiş hedef ifadesi de antikor doğrulama yararlanabilirsiniz. Bunlar yüksek boyama arka plan eğilimi olarak bu özellikle fare monoklonal antikorlar ile fare epitopları tespiti için önemlidir. Buna ek olarak, iyi doğrulanmış antikorlar güvenilir ve tekrarlanabilir veri tanı ve klinik ayarları elde etmek için gereklidir. Böylece, modülasyon bereket veya ilgili epitopları dokusu dilimlerin uyuşturucu tedavi aşağıdaki fosforilasyon antikor doğrulama kullanışlı pratik uygulamada sağlar. Tümör dilim kültürleri önemli bir avantajı bir çekici ex vivo model yapar modeli dağınık şekilde dağıtılmış görev oncogenic sinyal faaliyetleri veya uyuşturucu yanıt tümör veya stromal hücreler, dahil, yeteneği var. Ancak, işleme sırasında dilimlerini döndürme ve yetiştirme süreci daha da özellikle kenarlarında doku zarar verebilir. O bu nedenle kesin yerleşimi için 0 h dilimleri biyomarker lekeli IHC görüntüleri kültürlü dilimler halinde tespit nekrotik bölgeler ile hangi tam olarak uyuşturucu yanıt-e doğru kayma biyomarker faaliyetleri bağlantı yeteneği ödün vermez meydan okuyor. Buna ek olarak, tümör içsel, kültür kaynaklı ve uyuşturucu kaynaklı nekrotik yanıt en az kayma uyuşturucu tepkilerin doğru Nefelometri ödün fare NSCLC doku dilimler halinde, ayırt edilemez. Son olarak, tümör dilim kültürler kullanımı bir araştırmacı test etmek için birden çok bileşikleri aynı tümör, hayvanlar, böylece rafine, azaltılması ve Laboratuvar hayvanları üzerinde deneyler değiştirme tedavisi için ihtiyaç olmadan izin verir.
Yönelik bir uygulama açıklanan protokol klinik solid tümör örnekleri için kabul edilebilir. Daha fazla doku türe bağımlı değişiklikleri veya en iyi duruma getirmeleri Bunlar tümör doku veya sertlik için optimize etmek için dilim kalınlığı ve titreşim hızı da dahil olmak üzere vibratome ayarlarına ayarlamalar ile başlayan büyük olasılıkla zorunludur. Ayrıca, besin ve büyüme faktörü gereksinimi farklı tümör doku için farklı olabilir. Örnek olarak, meme kanseri dilimleri içinde orta13,18takıma insülin ile kültürlü. Verilen bu sınırlı doku malzeme cerrahi veya biyopsi sırasında elde edilir, hasta kaynaklı tümör dilim kültürler duruma getirilmesi yeterli sayıda çoğaltma örnek alma zorlukları nedeniyle zor olabilir. Ayrıca, veri tekrarlanabilirlik aynı zamanda tarafından hastaya örnek heterojenite, özellikle tümör hücreleri fibrotik bölgeler veya stromal infiltratlar gibi nekrotik doku bileşenleri karşı yüzdesi olarak telaffuz meydan. Son olarak, tümör dilimler halinde tanı ayarlarını uygulanması için hangi ilaç dilim explants ön arıtma biyopsileri, yanıtlarında eşleşen tedavi sonrası vivo içinde yanıt-e doğru ölçüde incelenmesi gerekir.

Solid tümör doku, akciğer kanseri, dahil olmak üzere fenotipik ve genetik heterojenite sergi ve karmaşık microenvironments1,2liman. Tümör hücreleri ve çevresindeki microenvironment etkilerinin ilaç duyarlılığı ve direnç mekanizmaları3arasındaki etkileşimi. Bu doğru bir şekilde biyolojik karmaşıklığı ve yerel tümörler hareket işlevleri modelleyebilirsiniz preklinik modelleri ihtiyacını vurgular. Vivo biyoloji, en az zaman dağınık şekilde bireysel bir tümör dağıtılmış fenotipleri dahil olmak üzere, kısa bir pencere için temsil etmek için asıl kapasitesi sahip oldukları gibi hassas kesim dilimleri hemen taze tümörler türetilmiş benzersiz bir kaynak sağlar. Rezeke klinik tümörler kanser hastası elde edilebilir birkaç kişiselleştirilmiş numuneler biridir ve tanılama kullanımları İnceleme hak ediyor.
Ne zaman insan intrakraniyal tümörler el doku parçalar halinde kesilmiş ve kültürlü sözde kullanarak geri erken 19 yy, organotypic kültürlerin tarihleri geçmiş bırak yöntemini asılı. Doku parçaları bağlı bir coverslip ve sonra coverslips ters, mühürlü ve birkaç hafta4için kültürlü heparinized insan plazma içine daldırma için izin. El ile adet plazma pıhtıları5, sıvı ortam6, gibi diğer yöntemler kullanarak kültürlü beri veya boyut filtreleri60,45 µm gözenek tümör kesti. "Organotypic" terimi ilk 1954, Retina civciv embriyo göz7farklılaşma üzerine bir çalışma içinde kullanıldı. Bu civciv embriyo8ve beyin explants yetişkin fareler9türetilmiş akciğer ve kalp doku explants kullanılan çalışmalar izledi.
Çeşitli Dilimleme yöntemleri tarif, yani manuel helikopterler10,11, Krumdieck doku dilimleyici12,13ve vibratomes11,14,15olmuştur, 16. Krumdieck doku dilimleyici sonra bir microtome kullanarak dairesel doku dilimler halinde dilimlenmiş silindirik doku çekirdek oluşturur. Bir vibratome öte yandan, titreşimli blade microtome kullanır. Karaciğer dilimleri üzerinde bir çalışmada, bu Leica vibratome Krumdieck dilimleyici15ile karşılaştırıldığında daha fazla tekrarlanabilir ve tutarlı dilimler oluşturur gösterilmiştir. Dilim kalınlığı 250 500 µm arasında kullanılan ve çalışmalar canlılığı ve morfolojik özellikleri bakım bile 16 gün14kadar,10,17,18rapor etmektedir. Ancak, tümör besin gereksinimleri etkileyebilir değişken metabolik profilleri var ve doku sertlik ve matris kompozisyon gibi parametreleri havalandırma ve besin akışı etkileyebilir. Bu nedenle doku türlerinin en iyi duruma getirme Dilimleme ve kültür koşullardan gerektirir yüksektir.
Dilim kültürler desteklemek için kullanılan farklı yetiştirme yöntemleri: Ben) sabit Interphase kültür, durgun destek kültür içinde dilimleri kültür ortamında dalmış bir yarı geçirgen membran eklemek üzerine yerleştirilir, olarak da bilinir. Alt besin yolu ile gözenekli Ekle14,19ile takıma iken, hava için üst dilimleri maruz kalmaktadır; II) orijinal kültür bütün organları veya embriyonik dokusu dilimlerin gelişmiş mala yöntemi. Bu, dilimleri bir pamuk yaprak ya da metal bir kılavuz tarafından desteklenen filtre üstüne yerleştirilir ve filtre kültür ortamda batırılmış. Dokuları nemli tutmak için orta ince bir tabaka üzerine dilimler20,21,22eklenir. Bu ilk iki hava-sıvı Interphase kültürler sözde; III) silindir tüp kültürler, dilim orta içeren bir plastik tüp düz tarafı yerleştirilir ve doku ile orta döngüsünün ilk bölümünde sırasında kapalı veya sırasında ikinci23gazlı olduğunu yavaş tüp dönüş sağlar; IV) dönen kuluçka birimler, hangi dilimleri zaman zaman orta besin ve havalandırma ile sunulur. Farklı roller tüpler, bu yöntemde dilimleri ile kültür orta246-şey plakalar yerleştirilen gözenekli titanyum ızgaralar üzerine yerleştirilir.
Dokusu dilimlerin olarak onlar canlılık değerlendirilmesi izni rezeke solid tümör mantıksal olarak mevcut hangi anti-kanser ajanı, tedaviye yanıt test etmek için bir çekici ex vivo modelinde türetilmiş, hedef yolu etkinliği ve moleküler profilleri onun yerli tümör microenvironment huzurunda belirli bir tümörü. Ancak, tümör dilimler halinde ölçülen uyuşturucu yanıt situ yanıt akıllı olup olmadığını değerlendirmek için ne ölçüde dokusu dilimlerin hücre çoğalması gibi tümör özgü Biyolojik işlevleri korumak için değerlendirmek önemlidir, histopatoloji özel hücre farklılaşma ve oncogenic sinyal etkinlikleri. Mekanik stresin dilim hazırlık, dilim işleme veya kültür kaynaklı adaptasyonlar hem kalite hem de dokusu dilimlerin biyolojik fonksiyonları sırasında elde edildi temel soru, sıkıca bağlı tümör kaynaklı uygulamak için yeteneği vardır fonksiyonel tanı için dilimleri.
Bizim Konsorsiyumu ımı tarafından finanse edilen proje PREDECT (http://www.predect.eu) adresine sistematik olarak bu temel soru, dilim explants çeşitli kaynaklardan gelen inceleyerek ortaya koyuyor. Meme, prostat ve akciğer kanseri modellerden türetilmiş dilimleri kullanarak, bu ortak çaba nitel okuma gibi nicel Hematoksilen ve atmosferik oksijen ve durgun filtre için bir gereklilik göstermek için esaslı eozin (H & E) - çıktıları kullanılmaktadır kültürlü dilimleri canlılığı 72 h kadar sürdürmek için destekler. Ayrıca, immünhistokimya (IHC) analizleri kültürlü dilimleri üzerinde içi dilimli canlılığı degradeler, nekroz gradyanlar içinde fare küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC), östrojen reseptör (ER), HIF1α türetilmiş dilimler olarak kanıtlandığı ortaya koydu ve γH2AX meme kanseri dilimleri içinde geçişlerini veya androjen reseptör (AR) ifade degradeler prostat kanseri dilimleri25. İlginçtir, içi dilimli canlılığı degradeler fare NSCLC kültürleri 24 h içinde yetiştirme dönen bir kuluçka birimi tarafından kurtarıldı ve canlılığı 72 h26için genişletildi bizim yeni çalışma gösterdi. Özellikle kameranın üst kısmı en uygun26uyuşturucu yanıt analizlere dilimleri en iyi bu doku tarafında yapılmaktadır onaylamadan, kaldı.
Olsa bile bu kadar nasıl gibi bir soru kalır dokusu dilimlerin in situ tümör işlevleri özetlemek, bunlar kapsamlı anti-kanser ajanı, hedeflenen uyuşturucu, monoklonal antikor ve kemoterapi ajanlar gibi yanıt test etmek için kullanılmıştır 10,11,13,14,18,27. Biz son zamanlarda fare NSCLC dilimleri içinde yayılması dinamik değişiklikleri göster ve taze 0 h kesmek için karşılaştırıldığında ekimi takip oncogenic sinyal faaliyetleri dilimler26gösterdi. Bu hedeflenen in situ biyolojik fonksiyonları ekimi, önce pertürbasyon çalışmaları sırasında uygun şekilde korunur olup olmadığını araştırmak önemli olduğunu gösterir. Bu bulgular rağmen biz tümör dilimleri kayma yanıt-e doğru ilaç tedavileri kalır ortasında hedefli tedaviler model olabilir gösterdi (24 saat) kısa ve26kültürü çalışmalarının başlangıcı başlatılır. Aşağıdaki protokol önemli doğrulama açıları ilgili kuruluş ve analiz farmakolojik uyuşturucu testi içinde onların uygulamadan önce tümör dilim kültürlerin anlatır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1089">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:486px;">Hank&#8217;s Balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">H6648</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21765-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Glutamine 200mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Cyanoacrylate adhesive (GLUture)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>32046-90-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Leica VT1200 S vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slicing blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PERS60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Titanium grids</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Slice incubation unit</td>
			<td>Albamma Research and Development</td>
			<td>MD2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">10 cm tissue culture plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Neolus Hypodermic Needles</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td>NN2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">50 mL falcon tube</td>
			<td>Greiner&#160;</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F/1501/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Trifold histo cassette paper</td>
			<td>Cancer Diagnostics</td>
			<td>DX26280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Histo cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KOS The microwave multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone SRL</td>
			<td>CAT307EN-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Microtome</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HM355S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Superfrost Ultra plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NGS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">PT-Module</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A80400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for H&#38;E staining</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Hematoxylin for counter staining</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">NKX2-1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133638</td>
			<td>Lot Number: GR98031-12</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">pERK 1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 4370</td>
			<td>Lot Number: 17</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">p4EBP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>CST 2855</td>
			<td>Lot Number: 20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKDPVR-110HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Mounting medicum pertex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MEDT41-4021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">DAB&#160;</td>
			<td>ImmunoLogic</td>
			<td>VWRKBSO4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Dactolisib (NVP BEZ-235)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Selumetinib (AZD2644)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Pannoramic 250 slide scaner</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&#160;</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Adobe Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&#38;mv=search&#38;s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&#38;ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CellProfiler</td>
			<td>CellProfiler cell image analysis software</td>
			<td></td>
			<td>http://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing

Hassas kesilmiş dilimleri dahil, Organotypic birincil doku explant kültürler, üç boyutlu (3-b) doku mimarisi hem de yerel doku çok hücreli etkileşimleri temsil eder. Hemen taze rezeke tümörler kesmek dokusu dilimlerin intratumor heterojenlik, böylece onları içinde vivo biyoloji yararlı vekilleri hale kayma yönleri korumak. Dikkatli doku dilim hazırlık ve yetiştirme koşulları duruma getirilmesi esastır akıllı tanılama potansiyelini tümör için dilim explants. Bu bağlamda, fare modelleri bu tümör malzeme çoğaltılır ve tekrarlanabilir deneyler gerçekleştirmek için tutarlı bir akış sağlamak değerli, şunlardır. Bu iletişim kuralı bir dönen kuluçka birimi, dokuların aralıklı maruz oksijen ve besin sağlayan bir sistemi kullanarak fare akciğer dokusu tümör kaynaklı dilimleri kültür açıklar. Önceki çalışmalarımız kuluçka birimleri dönen kullanımı özellikle dilimleri yüzen diğer kültür yöntemlerine göre doku canlılığı artırır ve durgun süzgeci destekler gösterdi. Burada, biz daha fazla dilim kalınlığı canlılığı etkiler gösterir kültürlü dilim dilim kalınlığı bu duruma getirilmesi düşündüren farklı doku türleri için yapılmalıdır. ITH etkinlikler, stromal hücre infiltrasyonu ya da ayırt etme belirteçleri, ifade sinyal gibi ilgili oncogenic işlevleri gerektirir bitişik doku dilimleri işaretleri ilaç tedavisi tarafından değiştirilmiş bir ifade için değerlendirilmesi telaffuz ya da ekimi kendisi. Özetle, bu iletişim kuralı fare akciğer tümörü dilimleri nesil ve onların kültür üzerinde dönen bir kuluçka birimi tanımlar ve nasıl dilimleri sistematik türdeş olmayan doku işaretlerini, ifade bir önkoşul olarak analiz edilmelidir gösterir önce ilaç yanıt araştırmaları.

Şekil 1 üretimi, yetiştirme ve hassas kesim doku dilimleri fare NSCLC tümörler türetilmiş analizi için iş akışını temsil eder. Bu gösteri için tümörleri bundan sonra denilen koşullu aktivasyonu KrasG12D ile birlikte Lkb1 (olarak da bilinen serin/treonin kinaz 11), kaybı barındıran bir genetiği fare modeli (et) kullanılan KL. Fare ıslahı ve akciğer tümörü başlatma26,28içinde açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Şekil 2A dilimleri 24 saat dönen bir kuluçka birimi kullanarak kültürlü canlılığı doku dilim kalınlığı etkisini gösterir. 160 µm ince dilim dilim büyük nekrotik alanlar içeren sonuçlar gösterir. Buna ek olarak, 250 µm ince dilimler bir nekroz dilimin 200 µm ince dilimlere göre degrade gösterir. Bu teknik işleme sırasında ızgaralar üzerine dilimler konumlandırma bu kırılgan ve curl eğilimi gibi en ince 160 µm zavallı genel canlılığı kaynaklanır olasıdır. Zaman dilimleri çok kalın, onlar-ebilmek var olmak oksijen veya besin difüzyon eksiklikleri eğilimli dilimleri arasında olan, öte yandan, hangi fare NSCLC explants nekrotik ölüm degrade25olduğunu göstermiştir. Ancak, dilimleri değişken kalınlıkları ile aynı vibratome ayarları kullanımı rağmen bir tümörün kaynaklandığı unutulmamalıdır. Bu nedenle farklı tümör örneklerinden birden çok çoğaltır analiz etmek için önerilir. Önemlisi, sertlik ve doku doku oksijen ve besin akışı etkileyebilir gibi doku türlerinin en büyük canlılık, elde etmek için dilim kalınlığı optimizasyonu gerektirir. Şekil 2B -2C NKX2-1 ifade nicel IHC analizleri gösterir, iyi farklılaşmış akciğer adenokarsinom (AC) örneklerinde bir işaretleyici en fazla 72 saat ekili ve 0 h dilimleri eşleştirdi. NKX2-1 ifade önemli ölçüde kültürlü dilimleri ile karşılaştırıldığında yetiştirme süreci açıktan açığa AC tümör doku farklılaşması durumunu etkilemez düşündüren 0 s kültürsüz dilimleri içinde değiştirilmemesini sonuçları göster. Şekil 2B tümör dokusu dilimlerin hedeflenen ilaçların etkinliğini değerlendirmek için yarar gösterir. Biz son zamanlarda o Kras mutant fare ACs sergi yüksek ifade fosforile ERK1/2 (artan MAPK yolu etkinliği işaretleme) gösterdi (işaretleme mTOR etkinliği ifade fosforile 4EBP1 ise adenosquamous (ASC) tümör karşılaştırıldığında ) benzer şekilde AC ve ASC tümörler ifade edilir. Eğer bu yolları etkili doku dilimleri hedeflenebilir sınamak için KL AC dokusu dilimlerin DMSO ile tedavi edildi veya titre bileşikleri, yani 0.1-1 miktarda hedef mTOR yolu veya 0,05 – 0,5 µM dactolisib MAPK yolu hedeflemek için µM selumetinib. Sonuçlar 1 µM dactolisib veya selumetinib 0.5 µM sırasıyla 4EBP1 veya ERK1/2, fosforilasyon inhibe etkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hedeflenen phosphoproteins inhibisyonu doz bağımlı dokusu dilimlerin Ayrıca fosforilasyon özel antikorlar doğrulamak için yararlı olabilir gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg"> Şekil 1: kuruluş ve fare NSCLC tümör kaynaklı dilim explants analizi için iş akışının şematik Gösterim. (A)şeması koleksiyonu ve dilimleme hazırlığı tümörü taşıyan akciğer açıklayan. Akciğer lobları bir fareden hasat ve tümör dokusu normal doku uzak disseke. Yaklaşık 4 mm ve 1 mm tümörler, sırasıyla siyah ok ucu ve yıldız işareti gösterir. Beyaz ok ucu numune tutucu yüzeye yapıştırılmış akciğer doku gösterir. Normal akciğer destek doku dik tümör korumak için ek bir parça kırmızı ok noktalarda. (B) Vibratome Dilimleme ve dokusu dilimlerin toplanması. Beyaz ok Dilimleme yönünü gösterir. Sıralı dilim koleksiyonuna içeren soğuk HBSS + P/S. 24-şey plaka Dilimleri ya da farklı zaman noktaları (burada, 24 – 72 h) ekimi (üst satırı) sırasında tümör özgü marker ifade değerlendirmek için için kültürlü olabilir veya ilaç tedavileri gerçekleştirmek için kullanılabilir. C: araç kontrolü, T: ilaç tedavisi. (C) dönen kuluçka birimleri kullanarak ekimi için doku dilim yerleştirerek. Böylece bazı orta üst kılavuz kapsayan 6-şey plaka yatırmayı, doku dilim kılavuzunun üstünde dururlar orta ortasında yer ve forseps kullanma dilim yayıldı. 6-iyi plakaları ağırlık düz döndürme döngüsü için dengeli olduğundan emin olun. X: gösterir yanlış, ve <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg"> </img>: doğru dilim konumlandırma gösterir. (D) bir tümör dilim FFPE bloğunu fotoğrafı. Parafin gömülü doku dilim siyah oku noktalarda hematoksilen ile lekeli. (E) şemaları; dilimler parça sipariş FFPE bloklar halinde gösterilen Bu bölümler doku canlılığı ve tümör özgü biyomarker ifade değerlendirmek için işlenebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg"> Şekil 2: değerlendirme canlılık ve histotype özgü marker ifade ve hedeflenen uyuşturucu tedavi NSCLC dokusu dilimlerin. 24 h 200 µm ince dilimler için kültürlü belirtilen kalınlıkları dilim AC NSCLC(a)temsilcisi H & E görüntülerini korumak daha iyi canlılığı 160 µm ya da 250 µm ince dilimler ile karşılaştırıldığında. H & E uygun doku lekeli koyu mavi temsil eder ve pembe pseudocolored nekrotik bölgeler gösterir. Açık mavi analizi, zavallı doku kalitesi veya fibröz stroma varlığı nedeniyle dışında bölgeleri gösterir. T1 ve T2 biyolojik çoğaltır iki farklı tümörler türetilmiş temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 µm. (B) temsilcisi IHC resimleri NKX2-1 ifade için belirtilen süre puan kültürlü AC dilimleri içinde. Ok daha yüksek büyütme gösterilen alanı gösterir. NKX2-1 ifade 0 h dilimlere karşılaştırmak kültürlü dilimleri içinde değiştirilmez sonuçları göster. Ölçek çubuğu = 500 µm ve 50 µm için düşük ve yüksek büyütme, anılan sıraya göre. (C) miktar (B) gösterildiği veri. (D) temsilcisi IHC görüntüleri fosforile 4EBP1 veya 0 h ifadede pERK1/2 dilim veya dilimlerin DMSO ile tedavi veya titre dactolisib (dact, üst satır) tutarların veya 0 h dilim veya dilimlerin DMSO ile tedavi pERK1/2 ifadesinde fosforile veya selumetinib (sel, alt satır). Siyah kare şeklinde kutular içinde daha yüksek büyütme gösterilen alanları belirtir. Ölçek çubuğu = 1 mm veya 50 µm için düşük veya yüksek büyütme, anılan sıraya göre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing at JoVE.com

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Biz üretimi, yetiştirme ve fare akciğer tümörleri türetilmiş organotypic dilimleri sistematik analizi için bir yöntem sağlar. Biz de dilim kalınlığı için en iyi duruma getirme ve tümör dilimleri tedavisi için ilaç konsantrasyonları seçin anlatan.

Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Bu yöntem, tümör dilimi eksperlerinde ilaç yanıt çalışmalarının tanısal amaçlara hizmet edebileceği klinik öncesi araştırmalarda anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, dilim eksbitkilerinin kısa bir süre için mekansal olarak dağılmış fonksiyonlar da dahil olmak üzere yerli dokuların karmaşık biyolojisini modelleyebiliyor olmasıdır. Bu yöntem, rürin akciğer tümörlerinden alınan dilimlerin kullanımına ışık tokus edebilse de, insan dokuları da dahil olmak üzere diğer doku tiplerine de uygulanabilir.Başlamak için vibratome hazırlayın ve kılavuzda belirtilen talimatlara göre bir VibraCheck gerçekleştirin. Daha sonra 24 kuyulu plakanın her kuyuyu penisilin ve streptomisin ile desteklenen hank'in dengeli tuz çözeltisinin bir mililitresi ile doldurun ve plakayı buzda tutun. Göğsün açığa çıkıp hayvanın gerilmesini sağlayacak şekilde strafor kapağına yerleştirilen ötenazili farenin dört patisine de 25 kalibrelik iğneler yerleştirin.Sprey açıkta kalan cilt yüzeyine% 70 alkol. Karından göğsüne ve boyun bölgesine kadar açık deri kesmek için açılı bir pozisyonda yerleştirilen makas kullanın. Forceps kullanarak her iki tarafta cilt germek ve 25-gauge iğneler ekleyin.Karın bölgesini kesin. Sonra akciğer ve kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi ve diyafram açık kesin. Çevre doku keserek nefes borusu ortaya çıkar.Akciğerleri inceleyin, kalple birlikte. Donmaya yerleştirilen Pen-Strep ile takviye buz gibi hbss 30 mililitre lik içeren 50 mililitrelik bir tüp içine dokuları yerleştirin ve mümkün olduğunca çabuk bir sonraki adıma geçin. Şimdi tümör taşıyan akciğerleri 10 santimetrelik doku kültür plakasına aktarın.Akciğer loblarını ayırmak için steril makas ve forseps kullanın ve dilimlemek için yüzeyde tümörolan lobları seçin. Düz bir doku parçası yüzeyi oluşturmak için steril bir neşter kullanarak tümör çevreleyen normal akciğer veya ek tümör dokusunun bir kısmını kayma önlemek ve kesmek için filtre kağıt bir parça üzerinde bir tümör dokusu ile bir akciğer lob yerleştirin. Düz tarafı siyanoakrilat yapıştırıcıdamlabatırın ve vibratom numune tutucuya yerleştirin, böylece tümör bıçağı dik bir pozisyonda karşılar ve 2-3 dakika kurumasını bekleyin.Vibratom numune tutucuyu metal tampon tepsisine yerleştirin. Doku tampona batırılınceye kadar tepsiyi Pen-Strep ile takviye edilmiş soğuk HBSS ile doldurun. Tampon tepsiyi, aletle birlikte verilen Pleksiglas kapakla kaplayın ve tepsiyi beyaz bir buz banyosuna yerleştirin ve dilimleme sırasında dokuyu serin tutmak için buz ekleyin.Beyaz buz banyosunu vibratome takın. Sonra uygun dilimleme ayarlarını seçin ve dilimlemeye başlayın. Vibratome bıçağı dilimleme konumuna getirin ve dilimleme penceresini ayarlayın.24 kuyulu bir tabakta dilimleri toplamak için steril çalgıları kullanın ve kalem-Strep ile birlikte bir mililitre hbss ile birlikte iyi ve buz üzerinde tutun. Dilimleme sırasını takip ederken, 24 kuyulu plakanın her kuyuyu deney planına göre işaretleyin. Sıfır saat veya kültürsüz referans olarak kültürlü dilimler bitişik bir doku dilimi toplayın.Dokunun üst, orta ve alt temsil etmek için en az üç referans dilimleri toplayın. Dilimleme tamamlandıktan sonra sabitleme ve işlemeye devam edin. Bundan sonra, titanyum ızgaraları yerleştirerek kuyu başına kültür orta 2,5 mililitre içeren altı kuyulu bir plaka hazırlayın.Titanyum ızgara ve orta arasında hiçbir hava kabarcıkları oluşan emin olun. Bir dilimi ızgaraya yüklemek için altı kuyulu plakayı açılı bir konumda tutun, böylece ortamın bir kısmı ızgarayı kaplayın. Daha sonra ızgara üzerinde orta dilim yerleştirin ve yaymak için forseps kullanın.Dilimleri yerleştirdikten sonra, altı kuyulu plakaları 37 derece lik nemli bir kuluçka makinesinin içine yerleştirilen döner kuluçka ünitesine %95 02 ve %5 CO2 ile yükleyin. Döndürme döngüsünü başlatın. Uzun süreli ekim için doku dilimleri içeren ızgara kaldırmak ve altı kuyu plaka boş bir kuyuya yerleştirmek için steril forseps kullanarak her gün kültür ortamı doldurmak.Ortamın %70'ini taze kültür ortamıyla değiştirin ve ızgarayı geri yerleştirin. Döndürme döngüsünü daha önce olduğu gibi devam edin. Tümör dilimleri üzerinde ilaç tedavisi için altı kuyu plaka içine seyreltilmiş ilaç veya araç kontrolü ile medya 2.5 mililitre ekleyin.Titanyum ızgaraları kuyulara yerleştirin ve dilimleri daha önce olduğu gibi ızgaraların üzerine yerleştirin. Tedavileri 24 saat yaptıktan sonra sabitleme ve işleme ye devam edin. İstenilen dilimi sabitlemeye başlamak için, 2-3 mililitre PBS ile doldurulmuş ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren 10 santimetrelik bir plakaya forceps kullanarak dikkatlice aktarın ve yüzdürün.Daha sonra filtre kağıdını bir çift forsepsle çıkarın ve bir histo kasetine yerleştirin. Filtre kağıdını histo kasetine aktarın. Sonraki adımlar için dilimkonumunu işaretlemek için doku diliminin üstüne seyreltilmiş hematoksilin bir damla ekleyin.Kaseti kapatın ve %4 nötr tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört derece santigrat derecede bırakın. Protokolün açıklandığı şekilde kasetin yıkanması ve işlenmesinden sonra histo kasetini açın ve sabit dilimi filtre kağıdından dikkatlice kaldırmak için neşter kullanın. Filtre kağıdını atın ve dilimi sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.Eşit bölümleme sağlamak için katıştırma kalıbının altına doku basmak için düz bir ağırlık kullanın. Histo kasetinin alt kısmını kalıbın üstüne yerleştirin. Üzerine sıvı parafin ekleyin.Ve kalıp 30 dakika soğuk bir tabakta soğumasını bekleyin. Bundan sonra parafin bloğundan soğutulmuş kalıp ayırın. FFPE doku dilimi bloklarının dört mikrometre ince bölümlerini hazırlamak için bir mikrotom kullanın.Dokuyu çevreleyen parafin fazlalığından kurtulun. Doku boyunca eşit bölümler elde etmek için bloğun açısını ayarlayın, böylece blok yüzeyinin bıçak ile ilgili olarak yatay olarak yönlendirilir. İnce bir fırça kullanarak cam slaytların üst kısmından başlayarak parafin gömülü doku diliminin sıralı doku bölümlerini toplayın.Ortasına derin doku katmanları bölümleri toplamaya devam edin, cam slaytlar alt kısmı takip. Her doku diliminin farklı katmanlarından nesne slaytlarına bölümlerin toplanması, canlılık, hücre göçü veya biyomarker ifadesinde kültürkaynaklı degradelerin yakalanmasını sağlamak için yapılır. Bölümleri topladıktan sonra protokolde açıklandığı gibi işleme ve ileri analizile devam edilir.Doku dilimi kalınlığı kültürlü dilimlerin canlılığını etkileyebilir. Bu durumda, 250 mikrometre kalınlığında dilimler, kalın dilimlerin dilimler boyunca oksijen veya besin difüzyonundaki eksikliklere yatkın hale gelmesi nedeniyle 200 mikrometre kalınlığındaki dilimlere göre artmış nekroz degradelerini göstermektedir. Ancak, 160 mikrometrelik ince dilimler büyük nekrotik alanlar muhtemelen bu kırılgan ve kıvrılma eğilimindedir olarak dilimlerin konumlandırılması sırasında teknik işleme neden içerir.NKX2-1 analizi, iyi diferansiye akciğer adenokarsinomu bir belirteç, ifade önemli ölçüde sıfır saat kültürsüz dilimleri ile karşılaştırıldığında kültürlü dilimler içinde değiştirilmiş olmadığını göstermektedir. NKX2-1 ekspresyonunun kantitatif analizi, ekstre işleminin adenokarsinom dokusunun farklılaşma durumunu gözle görülür şekilde etkilemediğini düşündürerek, ifadenin kültürlü ve kültürsüz dilimlerde önemli ölçüde değiştirilmediğini doğruladı. Tümör doku dilimleri hedefli ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir olup olmadığını test etmek için, onlar DMSO veya bileşiklerin titrated miktarları ile tedavi edildi.4EBP1 mTOR yolu fosforilasyon hedefleyen bir mikromolar daktolisib ile tedavi edildiğinde inhibe edildi. MAP kiziaz yolunu hedefleyen 0.5 mikromolar selumetinib ERK1/2 fosforilasyonunun inhibe edilmesinde etkili oldu. Bu videoyu izledikten sonra nasıl çalışmak ve eleştirel değerli tümör dokularından taze kesilmiş dilimleri analiz etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.Bizim eski postdoc, Katja Narhi, önemli ölçüde IMI Predect Konsorsiyumu Doku Dilimi Platformu meslektaşları ile işbirliği içinde bu yöntemin kurulmasına katkıda bulunmuştur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...