Name: in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Hector Quirante for den proteinekspression og -oprensning af huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen for fremragende teknisk support og Martin Koldijk til dataanalyse.

1. reagens
<ol><li>
Reaktion buffer
	<ol>
<li>Forberede reaktion buffer: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6.7 ved at opløse TCEP tørt pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock løsning, pH 7,4. Bemærk: Tilstedeværelsen af TCEP skyldes bridging sammenlægning undersøgelser ved hjælp af vildtype tau protein, som indeholder cysteines. I den nuværende protokol, TCEP bruges kun til at justere pH PBS fra 7,4 til 6,7 og spiller ikke nogen rolle i reguleringen af enhver redox reaktioner.</li>
		<li>Bland grundigt og opløsningen filtreres gennem et membranfilter til sterile 0,22 μm pore størrelse PES.</li>
		<li>Alikvot og butik på-80 ˚C.</li>
		<li>Tø på bænken og stabilisere på RT før brug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Fjern huTau441 (for protein proteinekspression og -oprensning Se Apetri et al. 24) fra-80 ˚C fryser.</li>
		<li>Tø på bænken og reagensglasset stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Spin tube med protein bestand i 5 min på 12.000 x g på 20-25 ˚C at fjerne luftbobler.</li>
		<li>Måler koncentrationen af huTau441by absorption på 280 nm med en udslettelse koefficient af 0.31 mL mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thioflavin Thomsen
	<ol>
<li>Forberede 500 μM thioflavin T (ThT) stamopløsning ved at opløse 10 mg ThT tørt pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaktion buffer.</li>
		<li>Blandes grundigt, vortex 3 gange i 20 sekunder ved maksimal hastighed og opløsningen filtreres gennem et sterilt 0,22 μm pore størrelse PES membranfilter.</li>
		<li>Bestemme koncentrationen af absorption målinger på 411 nm med en udslettelse koefficient af 22.000 M-1 cm-1 , og Juster ThT koncentration til 500 μM. Gemme på RT beskyttet mod lys. Forberede frisk hver 2 måned.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin
	<ol>
<li>Forberede frisk 55 μM heparin løsning ved at opløse 1 mg HMW heparin tørt pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaktion buffer på RT.</li>
		<li>Ryst kraftigt og vortex 2 gange for 5 sekunder.</li>
		<li>Filtrer løsning gennem en steril 0,20 μm pore størrelse PES membranfilter (sprøjte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. løbende Mode ThT sammenlægning Assay på en multi-mode mikrotiterplade læser
Bemærk: ThT farvestof føjes til reaktion til at overvåge huTau441 sammenlægning kinetik i en løbende tilstand (automatiske målinger). Selv om reaktionen kan efterfølges af en regelmæssig fluorometer ved hjælp af en konventionel kuvette, manuel arten af operationen begrænser hyppigheden af maalingerne og bringer de optagede kinetic kurvernes nøjagtighed. Af denne grund bruges en automatisk multi-mode mikrotiterplade læser.
<ol><li>
Instrument oprettet
	<ol>
<li>Tænd computeren og multi-mode mikrotiterplade læseren. Lad udstyret, stabilisere i 10 minutter.</li>
		<li>Start programmet og forberede en protokol.<ol>
<li>Marker protokoltypen: standard-protokol (reduktion af Data udføres uafhængigt for hver plade).</li>
			<li>Indstil temperaturen på 37 ˚C og marker preheatment før du fortsætter til protokollen.</li>
			<li>Sætte den kinetisk run: køre tid 50 h / måling interval: 15 min.</li>
			<li>Indstille orbital ryster på 425 cpm (3 mm) i kontinuerlig tilstand.</li>
			<li>Vælg den metode, Læs: fluorescens intensitet slutpunkt/Kinetic - Monochromators bølgelængder: Excitation 440 nm (20 nm båndbredde) / Emission 485 nm (20 nm båndbredde) - optik position: Top - Normal læse hastighed - Læs højde: 4.50 mm</li>
			<li>Start Kør ved hjælp af oprettede protokollen. Navngive eksperimentet, vælge destinationen for den nyoprettede fil og tillade instrument til pre reagensglasset ønskede temperatur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spontan huTau441 konvertering
	<ol>
<li>Forberede reaktion prøven i et 1,5 mL tube. Brug 200 μl mix pr. reaktion og mindst 4 replikater (reaktion bind for 4 replikater = 800 μL).</li>
		<li>Forberede 800 μL reaktion prøve (ved 4 replikater) indeholdende 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved at blande proteinet med reaktion buffer, tilføje heparin og ThT og bland godt ved pipettering op og ned 5 gange. Respektere den angivne rækkefølge for reagens tilsætning.</li>
		<li>Spin prøver på 12.000 x g og 25 ˚C for 5 min at fjerne luftbobler.</li>
		<li>Give afkald på 200 μl af reaktion prøve pr. brønd i 96-brønd mikroplader (96-brønd sort solid mikrotiterplade, godt-volumen 360 μL, flad bund). Undgå dannelsen af luftbobler.</li>
		<li>Forsegle mikrotiterplade at undgå fordampning.</li>
		<li>Placer mikrotiterplade i multi-mode mikrotiterplade læser og starte målinger.</li>
		<li>Efter afslutningen af eksperimentet, fjerne pladen fra udstyr og eksportere data til en edb-software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvalitetstjek af konvertering, frø indsamling og opbevaring.
	<ol>
<li>Fjerne sealer fra pladen og samle de forskellige replikater i 1,5 mL rør. Bland godt aggregerede prøven i brøndene af pipettering op og ned 2 gange før indsamling det. Aggregater har tendens til at deponere i bunden af brønden.</li>
		<li>Blandes grundigt i 1,5 mL tube af pipettering op og ned 5 gange og give afkald på 10-20 μL på en glimmer overflade til at analysere aggregater af AFM (for yderligere oplysninger se Apetri et al. 24).</li>
		<li>Høste aggregater af spinning 1,5 mL tube på 20.000 x g og 4 ˚C i 1 time. Aggregater danne en pellet.</li>
		<li>Adskille og analysere supernatanten ved S-MALS at bekræfte fravær af monomere tau i eksemplet med angivelse af en vellykket konvertering i aggregater (for yderligere oplysninger se Apetri et al. 24).</li>
		<li>Etiket 1,5 mL tube indeholder de resterende aggregater (pellet) med angivelse af indledende huTau441 proteinkoncentration og sample volumen. Snap fryse aggregater og opbevar ved-80 ˚C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seedede reaktion
	<ol>
<li>Fjerne huTau441 aggregater fra-80 ˚C fryser. Tilføje volumen af reaktion buffer på etiketten (oprindelige stikprøve volumen) og lad røret stabilisere til RT. Resuspend aggregater af pipettering op og ned 5 til 8 gange.</li>
		<li>Der sonikeres aggregerede prøven. For en 200 μl prøve (15 μM huTau441), der sonikeres på is ved hjælp af en 1/8" microtip (fra 100 μL op til 10 mL) til en samlet periode på 15 s ved hjælp af pulser af 1 s og pauser af 2 s på 30% amplitude (sonikator 250 watt). Re reagensglasset prøven til RT. Bemærk: De erhvervsdrivende sonikering betingelser fører til en homogen population af tau fibriller med længder på 20-50 nm24.</li>
		<li>Forberede reaktion prøven i 1,5 mL rør. Brug 200 μl mix pr. reaktion og mindst 4 replikater (reaktion bind for 4 replikater = 800 μL).</li>
		<li>Forberede 800 μL reaktion prøve indeholdende 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved at blande proteinet med reaktion buffer, tilføje heparin og ThT og bland godt ved pipettering op og ned 5 gange. Respektere den angivne rækkefølge for reagens tilsætning.</li>
		<li>Spin prøver på 12.000 x g og 25 ˚C for 5 min at fjerne luftbobler.</li>
		<li>Give afkald på 200 μl af reaktion prøve pr. brønd i 96-brønd (96-brønd sort solid mikrotiterplade, godt-volumen 360 μL, flad bund). Undgå dannelsen af luftbobler.</li>
		<li>Omrystes grundigt præfabrikerede fibril prøven ved gentagne op og ned pipettering (5 gange) og tilføje til hver godt et beløb svarende til den ønskede procentdel af frø. For en 200 μl godt samlede volumen er 2 μl af præfabrikerede frø tilføjelse en 1% (v/v). Mix af pipettering op og ned 3 gange når du tilføjer til brønden og undgå dannelsen af luftbobler.</li>
		<li>Forsegle mikrotiterplade at undgå fordampning.</li>
		<li>Placer mikrotiterplade i multi-mode mikrotiterplade læser og starte målinger.</li>
		<li>Fjerne pladen fra udstyr og eksportere data til et regneark.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+tauopathies.">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li><li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease:+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau.">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li><li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains.">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li><li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer's+disease.">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li><li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A68:+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau.">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li><li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer's+disease.">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li><li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies.">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li><li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro.">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li><li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation.">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li><li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231.">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li><li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation.">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).</li><li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers:+Insight+from+studies+in+vitro.">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li><li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li><li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans.">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li><li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li><li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li><li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments.">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li><li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution.">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer's+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein.">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li><li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer's+disease+and+the+tauopathies.">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li><li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein:+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation.">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li><li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy,+corticobasal+degeneration,+FTDP-17+and+Pick's+disease.">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Trods talrige bestræbelser, tau sammenlægning kinetik rapporteret i litteraturen til dato mangler det ønskede niveau af reproducerbarhed og/eller nogle af funktionerne i en Nukleering afhængige polymerisering19,20,21 , 22 , 23 , 25. det understreges ofte af manglen på en mellemliggende fase, ineffektive såning og ikke-fibrillar natur af tau aggregater. Årsagen til disse mangler kan variere og omfatter sub-optimale tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelsen af aggregater, lav renhed, osv.), valg af protein og overtalelse reagenser og eller forsøgsbetingelser. En anden komplicerende faktor er de to cystein restkoncentrationer placeret omkring tau sammenlægning interface, der kan danne intra - eller inter - Molekylær disulfid broer afhængigt af redox miljø og påvirke effektiviteten af tau sammenlægning. I de fleste tilgange reducerer reagenser som DTT eller TCEP har været brugt til at opretholde cystein restkoncentrationer i reducerede former og dermed øge niveauet af reproducerbarhed25. Desuden er extinction koefficient af tau meget lav, som fører til vanskeligheder med nøjagtige målinger af proteinkoncentration.
Vi fokuserede især på et par parametre og kvalitetsegenskaber, som vi anses for afgørende for en robust, reproducerbare og repræsentative sammenlægning profil for tau protein: at eliminere muligheden for intra - og inter-Molekylær disulfid dannelse, generere en meget ren tau monomer og forbedre nøjagtigheden af koncentration bestemmelse. Alle disse reagens-relaterede spørgsmål er potentielle opmærksomhed punkter, som vi anses for afgørende for optimal assay udvikling. For at løse disse problemer, blev fuld længde huTau441 udtrykt med to mutationer, C291A og C322A, og N - og C-terminale tags. Mutation af cystein restprodukter har minimal indvirkning på tau protein samtidig fjerne den ellers meget vanskeligt at kontrollere disulfid broer. Udtrykker proteinet med relativt korte N - og C-terminale tags tillod os at forfølge en to-trins affinitet rensning protokol, hvilket førte til meget høj renhed, integritet og monomer indhold. Desuden indførte vi en F8W mutation, der steg extinction koefficient af protein og tilladt langt mere nøjagtige koncentration målinger24.
Ud over at bruge høj kvalitet protein reagenser, var andre assay parametre også optimeret. Den optimale tau: heparin forholdet var identificeret til at være omkring 0,5 (M/M), som er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser26. Desuden, mekanisk og optisk instrumental indstillinger er afgørende for at sikre, at reproducerbarhed og de optimale parametre kan varierer til en vis grad afhængigt af producenten.
Sammenlægning af tau beskrevet i denne analyse viser karakteristika, der er forbundet med tau patogenese i annonce og relaterede tauopathies. Processen starter med en indledende forsinkelse fase svarende til dannelsen af høj energi kerner og er efterfulgt af en hurtig vækstfase, der svarer til fibril vækst. Den mellemliggende tid er tilstrækkelig lang til at åbne en bred vindue for at studere i detaljer seeding processen, der dækker en bred vifte af frø koncentrationer (figur 5) mens stadig ikke alt for længe så protein nedbrydning og/eller ikke-specifikke sammenlægning undgås (figur 2). disse sekundære begivenheder kan især ske, når et uløseligt uordnede protein som huTau441 er udsat for lange perioder til fysiologiske tilstande. Opnåede tau aggregater display morfologi af PHFs isoleret fra hjernen hos AD patienter og er meget effektiv i at rekruttere monomere tau og konvertere den til de novo genereret aggregater, en proces kaldet såning. Analysen er yderst reproducerbar, kinetic kurver er stort set umulig at skelne mellem brønde, eksperimentelle løber og protein partier. Selv om den aktuelle analyse fokuserer kun på de længste tau isoform, huTau441, anvendelsen kan tilpasses til at studere konvertering af andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Desuden, det giver Mekanistiske undersøgelser fokuseret på samspillet mellem tau isoformer og eventuelt kaste lys over forskellene mellem tau patogenese i annonce hvor både 3R og 4R isoformer er til stede i PHFs og picks sygdom eller Frontotemporal demens hvor tau patologi indeholder primært 3R og 4R tau isoformer, henholdsvis27.
Meget høj reproducerbarhed af analysen bør tillade læsere til at gennemføre det med relativ lethed i deres specifikke lab indstillinger. Analysen efterligner Hvad menes at være i vivo misfoldning og sammenlægning af tau, at aktivere Mekanistiske undersøgelser, som vil kaste lys over tau patogenese, og det udgør et værdifuldt redskab til screening af lægemiddelkandidater og evaluere deres indblanding med de forskellige trin i patogenesen proces.

Alzheimers sygdom er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der er histopathologically defineret af ophobning af ekstracellulære senile plaques aggregerede Amyloid beta1 og intracellulære neurofibrillary tangles der indeholder aggregerede hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomere og præsenteres som seks unikke isoformer indeholdende 0-2 N terminal skær og 3 eller 4 mikrotubulus bindende domæner3,4 fra alternativ splicing og et gennemsnit på 2-3 phosphorylations. Det menes, at hyperphosphorylation, misfoldning og selvstændig sammenlægning i fibrillære strukturer udgør de centrale elementer i tau patogenese, som patologisk vurderet i demente personer5,6.
De aggregerede neurofibrillary tau tangles er kendetegnende for Annoncen, men også for andre tauopathies, herunder frontotemporal lobar degeneration (FTLD), picks sygdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporale demens (FTD) og primære aldersrelaterede tauopathy (del)2. Fra biokemiske forstå mekanisme af tau misfoldning og sammenlægning kunne kaste lys over de patologiske processer forbundet med annonce og andre tauopathies. Ud over det videnskabelige aspekt er robust in vitro- sammenlægning assays værdifulde værktøjer til screening af drug kandidater7,8,9,10. Det menes, at en sammenlægning af tau følger en Nukleering afhængige polymerisering proces (NUP)11,12,13,14. NDP kinetik er sigmoide og starter med en energisk ugunstige Nukleering skridt efterfulgt af et hurtigt energisk downhill sammenlægning proces.
I modsætning til andre amyloidogenic proteiner, herunder prionprotein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og endda ekstreme pHs eller høje temperaturer er ikke befordrende for sammenlægning15. Dette er sandsynligvis på grund af hydrophylic interaktioner i grænsefladen tau sammenlægning. Men aggregater tau effektivt på fysiologiske koncentrationer ved anvendelsen af induktorer såsom heparin16 eller andre polyanions17,18 .
Tidligere bestræbelser på at oprette in vitro- tau sammenlægning assays har kaste lys ind på detaljerne i tau misfoldning og sammenlægning, men de kom kort af efterligne, hvad der menes at være i vivo tau sammenlægning kinetik. I de fleste tilfælde manglede tau sammenlægning kinetik den indledende forsinkelse fase tilknyttet tau Nukleering. Dette kunne have været en følge af ved hjælp af meget høj tau protein fusioner, tilstedeværelsen af aggregater i udgangspunktet tau protein præparater og/eller brug af tau fragmenter med meget højere sammenlægning tilbøjelighed end de mere fysiologiske fuld længde tau protein19,20,21,22,23. Desuden adresse tidligere undersøgelser ikke reproducerbarhed og robusthed aspekt af tau sammenlægning kinetik.
Her, beskriver vi en robust in vitro- tau sammenlægning assay som efterligner de vigtigste karakteristika ved en Nukleering afhængigt af polymerisering med en indledende forsinkelse fase svarende til tau Nukleering efterfulgt af en eksponentiel vækstfase. Desuden, de genererede rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høj seeding potens. Analysen er yderst reproducerbare også mellem tau partier og repræsenterer et værdifuldt redskab til at screene for sammenlægning hæmmere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1240px;" width="1239">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:353px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">T3516-5G</td>
			<td style="width:308px;">dry powder (Mw = 318.86 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td>dry powder (Mw = 17-19 kDa)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259-1G</td>
			<td>dry powder (MW= 286.65 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Sterile, pH 7.4 (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.20 &#956;m sterile serynge filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431229</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-well microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9502867</td>
			<td>Black, flat botton</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microplate sealers&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>Adhesive strips&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td>Hybrid Technology, Gen5 Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>1,5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonics-Branson SFX250</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-966R</td>
			<td>1/2&#34; Solid Horn and 1/8&#34; microtip&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening

Sammenlægning af tau protein og dannelsen af parret spiralformet filamenter er kendetegnende for Alzheimers sygdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, rapporterede i vitro sammenlægning kinetik for tau protein er mindre konsekvent præsenterer en relativt høj variabilitet. Her beskriver vi udviklingen af et in vitro- sammenlægning forsøg, der efterligner den forventede foranstaltninger forbundet med tau misfoldning og sammenlægning in vivo. Analysen benytter den længste tau isoform (huTau441), som indeholder både N-terminale sure skær samt fire mikrotubulus bindende domæner (MBD). In vitro- sammenlægning er udløst af tilsætning af heparin og følges løbende af thioflavin T fluorescens i en 96 godt mikrotiterplade format. Tau sammenlægning assay er yderst reproducerbare mellem forskellige brønde, eksperimentelle løber og partier af proteinet. Sammenlægning fører til tau PHF-lignende morfologi, som er meget effektiv i såning dannelsen af de novo fibrillar strukturer. Ud over dets anvendelse i at studere mekanismen af tau misfoldning og sammenlægning, er den nuværende assay en robust værktøj til screening af lægemidler, der kan forstyrre patogenesen af tau.

Rekombinante huTau441 indeholdende C291A og C322A mutationer og N-terminal hans og C-terminal C-tags blev udtrykt og renset som tidligere beskrevet24. HuTau441 partier er meget ren som visualiseret på SDS-PAGE og næsten 100% monomere som vurderet af S-MALS (figur 1). Sammenlægning af 15 µM huTau441 blev fremkaldt ved tilsætning af 8 µM HMW heparin og reaktion blev fulgt løbende af ThT fluorescens ved hjælp af en multimode mikrotiterplade læser. Excitation bølgelængde var 440 nm (båndbredde 20 nm) mens emissionerne blev målt til 485 nm (båndbredde 20 nm). Analysen er yderst reproducerbar, med resultater fra 10 individuelle brønde er stort set umulig at skelne (figur 2A). Morfologier ThT positive huTau441 aggregater blev vurderet efter 50 h af AFM. Aggregerede hutau441 er en homogen blanding af fibrillar strukturer af forskellige længder svarende til rapporterede ex vivo morfologier (figur 2B). Desuden indeholder den endelige reaktionsblandingen ikke monomer, tyder på en fuldstændig omlægning i aggregater, som det fremgår af S-MALS målinger (figur 2 c). Kinetik af huTau441 sammenlægning i uafhængige eksperimentelle løber er meget ens, som understreges af lignende sigmoide kurver og umulig at skelne lag og vækst faser (figur 3). Den høje grad af reproducerbarhed bevares, når forskellige batches af protein anvendes (figur 4). Derudover er præfabrikerede huTau441 aggregater meget effektiv i at rekruttere tau monomere og inducere dannelse af de novo tau aggregater. Beløb, der er så lavt som 0,0025% (v/v) af præfabrikerede tau aggregater er i stand til at omgå Nukleering og udløser generation af de novo fibriller (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figur 1: rekombinante huTau441 er monomere og meget ren. A) renhed vurdering under denatureringen betingelser på en 4-12% SDS-PAGE gel herunder molekylvægt standard protein stigen (i kDA) (Lane 1); gennemstrømning fra den endelige C-tag affinitet rensning trin (Lane 2); kolonne vask fraktion (Lane 3), elueres huTau441 protein peak, før (Lane 4) og efter buffer udveksle (Lane 5), henholdsvis). B) S-MALS analyse af huTau441. Protein viser > 99,9% monomere med en kindtand masse 51 kDa og indeholder ikke aggregater eller fragmenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figur 2: sammenlægning af rekombinante huTau441 er yderst reproducerbare og fører kvantitativt til fibrillar strukturer. A) kinetik af heparin induceret huTau441 sammenlægning overvåges kontinuerligt i 96 godt mikrotiterplade format af ThT fluorescens. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. 10 individuelle kurverne svarer til konvertering af samme protein parti i 10 brønde af den samme mikrotiterplade og er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase af 14.2 ± 0.38 h og t50 18,8 ± 0.40 h. kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logisti c kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. Mellemliggende fase og t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. Kurven montering og sammenfattende statistikker er opnået ved hjælp af IBM SPSS statistik version 20.0.0.2. B). Tau aggregater Vis PHF-lignende morfologier som angivet af AFM imaging på 50 h; C). S-MALS analyse af monomere huTau441 (t = 0 h) og supernatanten af reaktionsblandingen ved afslutningen af reaktionen (t = 50 h). For 50 h tidspunkt var reaktionsmiljøet centrifugeres i 1 time på 20.000 X g og 4 ˚C og resulterede supernatanten injiceres på S-MALS. Forsvinden af monomere peak bekræfter den fuldstændig sammenlægning af tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figur 3: tau sammenlægning analysen viser høj reproducerbarhed mellem uafhængige eksperimentelle kører. De to paneler vise fire individuelle kinetik spor til spontane huTau441 sammenlægning indsamlet i to uafhængige forsøg med den samme batch huTau441 protein. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Kinetik er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase 12,2 ± 0.18 h og t50 17,8 ± 0,8 h (Run 1) og 11,6 ± 0,52 h og t50 på 17,8 ± 0,23 h (køre 2), henholdsvis. Kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. T50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figur 4: tau sammenlægning analysen viser høj reproducerbarhed mellem forskellige batches af huTau441 protein. Hvert panel viser fire replikater, svarende til en specifik huTau441 parti. Sammenlægning af hvert enkelt parti blev fulgt op i uafhængige forsøg. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Sammenlægning kinetik svarende til de fire individuelle tau partier er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase af 15,3 ± 0.38 h og t50 på 21,1 ± 0.46 h (serie 1); mellemliggende fase 12,5 ± 0,07 h og t50 på 19,8 ± 0,34 h (serie 2); mellemliggende fase af 15,1 ± 0,34 h og t50 21.9 ± 0,86 h (serie 3) og en mellemliggende fase af 11,5 ± 0,29 h og t50 på 17,8 ± 0,29 h (serie 4), henholdsvis. Kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. Mellemliggende fase og t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figur 5: præfabrikerede hutau441 aggregater har høj såning aktivitet. For at starte såning, blev sonicated tau aggregater føjet til monomere hutau441. Fra rød til blå, hver farve af de forskellige kinetic kurver repræsenterer forskellige mængden af tilsat frø: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% og 0,0025% (v/v), henholdsvis. Spontan omdannelse af hutau441 er repræsenteret i sort. Alle betingelser, der blev testet i fire eksemplarer. De fire kinetic replikater forbundet med en vis koncentration af frø er meget reproducerbare og i de fleste tilfælde ikke kan skelnes. Koncentrationer af hutau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Tilsætning af små mængder af præformerede sonicated fibrillar strukturer eliminerer den indledende forsinkelse fase observeret i spontan omdannelse og effekten er proportional med mængden af frø. Fra rød til blå, er forskellen i t50 observeret (t50 spont.conv-t50 såning) 18,9, 18.40, 17,8, 17.3, 16.6, 16,1, 15,4, 14,7, 14.2 og 13,7 timer, henholdsvis. Spontan omdannelse af hutau441 er kendetegnet ved en gennemsnitlig t50 (med SD) af 19.85 ± 0,54 h. kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analysen til at studere en sammenlægning af Tau Protein og stof Screening

Tau sammenlægning analysen beskrives i dette manuskript efterligner de forventede funktioner i vivo tau misfoldning og sammenlægning.

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Misfolding af Tau protein i sin selv-samling i parret spiralformede filamenter er et patologisk kendetegn for Alzheimers sygdom og andre tauopatier. Her præsenterer vi en robust Tau sammenlægning assay, der kunne hjælpe med at belyse Tau patogenese proces. Konverteringen følger alle trinene i en nucleation afhængig polymerisering proces og er meget reproducerbar, så narkotika screening i et strengere format, der opfyldte OBSI niveau til dato.Kvaliteten af reagenser er afgørende. Rekombinant Tau skal være meget ren og blottet for aggregater og fragmenter. Tænd først for computeren og multimode-mikropladelæseren.Når du har ladet udstyret stabilisere sig, skal du starte softwaren og vælge Standardprotokol som protokoltype. Indstil temperaturen til 37 grader Celsius, og vælg Forvarmning, før du fortsætter protokollen. Derefter indstilles den kinetiske køretid til 50 timer og måleintervallet til 15 minutter.Indstil orbitalrysten til 425 cyklusser i minuttet i kontinuerlig tilstand. Derefter skal du vælge læsemetoden som fluorescensintensitetsslutpunktskinætiske momochromatorer. Indstil excitation bølgelængde til 440 nanometer og emission bølgelængde til 485 nanometer, optik position til toppen, og gevinsten til 80.Vælg normal læsehastighed, og indstil læsehøjden til 4,50 millimeter. Derefter validere og gemme protokollen. Start kørslen ved hjælp af den oprettede protokol.Navngræng eksperimentet, vælg destinationen for den nyoprettede fil, og lad instrumentet for at præekjætre til den ønskede temperatur. For et spontant rekombinant Tau-konverteringseksperiment skal der forberedes en 1.000 mikrolitreaktionsprøve med 800 mikroliter til thioflavin-T-fluorescens og 130 mikroliter til SEC-MALS-analyse ved først at blande proteinet med reaktionsbufferen i et 1,5 milliliterrør. Derefter tilsættes heparin og thioflavin-T og bland godt ved pipettering op og ned fem gange.Det er vigtigt at udføre protokollen præcist for at sikre høj reproducerbarhed, blande reagenser i samme rækkefølge og holde sig inden for tidsrammer. Drej prøven ved 12, 000 x g og 25 grader Celsius i fem minutter for at eliminere luftbobler. Efter centrifugering dispensere 200 mikroliter af reaktion prøve pr brønd i en 96-brønd mikroplade, undgå dannelsen af luftbobler.Derefter forsegle mikropladen for at undgå fordampning. Anlæste mikropladen i en mikropladelæser med flere æder. Vælg fuld plade, eller hvis pladen ikke er fuld, skal du vælge de brønde, der skal læses, og start målingen.Eksporter dataene til databehandlingssoftware. Fjern derefter mikropladen fra udstyret. Fjern derefter forseglingen fra mikropladen.Bland den aggregerede prøve i brøndene ved at pipettere op og ned to gange, og pool de forskellige replikater i 1,5 milliliterrør. Bland hver prøve grundigt ved pipettering op og ned fem gange, og dispensere 10 til 20 mikroliter på en glimmer overflade til analyse af aggregater ved atomare kraft mikroskopi. Herefter høstes aggregaterne ved at dreje hvert 1,5 milliliterrør ved 20, 000 x g og 4 grader Celsius i en time.Analysér supernatanten efter SEC-MALS for at bekræfte fraværet af monomerisk Tau i prøven, hvilket indikerer en vellykket konvertering til aggregater. Dernæst fjernes al resterende supernatant og mærke det 1,5 milliliterrør, der indeholder de resterende aggregater med den oprindelige rekombinant Tau proteinkoncentration og prøvevolumen. Snap fryse aggregater og gemme ved 80 grader Celsius.For et seedet eksperiment fjernes rekombinanten Tau-aggregater fra fryseren, reaktionsbufferen, der er angivet på etiketten, tilsættes, og røret stabiliseres til stuetemperatur. Derefter resuspendgres aggregaterne ved pipettering op og ned fem til otte gange. Sonikere den 200 mikroliter aggregerede prøve på is ved hjælp af en 1/8 tommer mikrotip i en samlet periode på 15 sekunder med impulser på et sekund på og to sekunder ud på 30 procent amplitude.Dernæst forberedes en 800 mikroliterreaktionsprøve ved først at blande proteinet med reaktionsbufferen i et 1,5 milliliterrør. Derefter tilsættes heparin og thioflavin-T og bland godt ved pipettering op og ned fem gange. Drej prøverne ved 12, 000 x g og 25 grader Celsius i fem minutter for at eliminere luftbobler.Efter centrifugering, dispensere 198 mikroliter af reaktion prøve pr godt i en 96-brønd mikroplade, undgå dannelsen af luftbobler. Homogeniser den forformede fibralprøve ved at pipettere op og ned tre gange. Tilsæt det beløb, der svarer til den ønskede procentdel af frø til hver brønd og bland ved pipettering op og ned tre gange.Derefter forsegle mikropladen for at undgå fordampning. Anlæste mikropladen i mikropladelæseren med flere moder, og start målingen. Når forsøget er afsluttet, skal du fjerne mikropladen fra udstyret.Eksporter derefter dataene til et regneark. Rekombinant Tau indeholder C291A og C322A mutationer og n terminal hans og c terminal c-tags er meget ren som visualiseret på SDS side og næsten 100 procent monomeriske som vurderet af SEC-MALS. Den heparin induceret rekombinant Tau sammenlægning blev efterfulgt af thioflavin-T fluorescens ved hjælp af en excitation bølgelængde på 440 nanometer og en emission bølgelængde på 485 nanometer.Analysen er meget reproducerbar med resultater fra 10 individuelle brønde er næsten umulig at skelne. De rekombinante Tau-aggregater er en homogen blanding af fibularstrukturer af forskellig længde, svarende til rapporterede ex vivo morfologier. Den endelige reaktionsblanding indeholder ikke monomer, hvilket tyder på en fuldstændig konvertering til aggregater, som det fremgår af SEC-MALS-målinger.Kinetik af rekombinant Tau sammenlægning i uafhængige eksperimentelle kørsler er ens, som understreget af lignende sigmoidal kurver og umulig at skelne mellem lag og vækstfaser. Den høje reproducerbarhed opretholdes, når der anvendes forskellige batcher af protein. Præfabrikerede rekombinant Tau aggregater er effektive til at rekruttere Tau monomer og fremkalde dannelsen af de novo Tau aggregater, og effektiviteten af processen er direkte proportional med procentdelen af frø.Beløb så lavt som 0,0025 procent af præ-dannede Tau aggregater udtrykt i volumen er i stand til at omgå rekombinant Tau nukleation og udløse de novo fibral generation. Den nuværende analyse efterligner, hvad der menes at være in vivo misfolding og sammenlægning af Tau og muliggør mekanistiske undersøgelser, der kunne kaste lys over patogenese processen og udgør et værdifuldt redskab til narkotika screening og studere interferens af narkotika kandidater med forskellige stadier af processen. Den høje reproducerbarhed af analysen vil gøre det muligt for forskerne at gennemføre det med relativ lethed i laboratoriet.Selv om den nuværende analyse fokuserer kun på den længste Tau isoform, menneskelige Tau-441, ansøgningen kan tilpasses til at studere forskellige Tau varianter. Og glem ikke, at vælge de rigtige protein reagenser og producere dem på høje kvalitetsstandarder er afgørende for at oprette en robust og meget reproducerbar analyse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure til implantering Organized Arrays af Microwires for Single-unit optagelser i Vågn op, fungerende dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhindens Micropocket assay: En model af angiogenese i mus Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Voksen Mouse Muskel-nerve Forberedelse til at studere affyringen Egenskaber af Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyt cokultur assay: En<em&gt; In vitro</em&gt; Opsætning for detaljeret undersøgelse af Neuron-glia Interaktioner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescens Billeddannelse af Neuroinflammation i transgene mus efter perifer Inokulering af alfa-synuclein Fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levende billeder af GLUT4 Protein handel med musen primære hypothalamus neuroner ved hjælp af Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Et Microbiomechanical System for at studere Varicosity dannelse og opsving i centrale Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ Autoradiografisk metode til bestemmelse af de regionale rater for cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Celle-baserede analyse at studere antistof-medieret Tau Clearance af mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...