Name: in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00
Duration: 9 min 49 s
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Gli autori vorrei ringraziare Hector Quirante per l'espressione e purificazione di huTau441, Hanna Inganäs e Margot van Winsen per supporto tecnico eccellente e Martin Koldijk per l'analisi dei dati.

1. preparazione dei reagenti
<ol><li>
Tampone di reazione
	<ol>
<li>Preparare il tampone di reazione: 0,5 mM TCEP in PBS, pH 6,7 sciogliendo polvere secca TCEP (MW = 286.65 g/mol) in PBSstock soluzione a pH 7,4. Nota: La presenza di TCEP è dovuto colmare gli studi di aggregazione utilizzando il tipo selvaggio proteina di tau che contiene cisteine. Nel protocollo attuale, TCEP è utilizzato solo per regolare il pH della PBS da 7,4 a 6.7 e non svolge alcun ruolo nel regolare eventuali reazioni redox.</li>
		<li>Mescolare bene e filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana sterile 0.22 μm poro formato PES.</li>
		<li>Aliquotare e conservare a-80 ° c.</li>
		<li>Scongelare in panchina e stabilizzare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Rimuovere huTau441 (per vedere espressione e purificazione di proteine Apetri et al. 24) dal congelatore a-80 ° c.</li>
		<li>Scongelare in panchina e stabilizzare a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Girare il tubo con il brodo di proteine per 5 min a 12.000 x g a 20-25 ˚ c per eliminare le bolle d'aria.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di huTau441by assorbimento a 280 nm utilizzando un coefficiente di estinzione di 0,31 mL mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tioflavina T
	<ol>
<li>Preparare 500 μM Tioflavina T (ThT) soluzione sciogliendo 10 mg di polvere secca ThT (MW = 318.86 g/mol) in 35 mL di tampone di reazione.</li>
		<li>Mescolare accuratamente, vortex 3 volte per 20 secondi alla massima velocità e filtrare la soluzione attraverso una sterile 0.22 μm PES membrana filtrante di porosità.</li>
		<li>Determinare la concentrazione mediante misure di assorbimento a 411 nm utilizzando un coefficiente di estinzione di 22.000 M-1 cm-1 e regolare ThT concentrazione a 500 μM. Conservare a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Preparare freschi ogni 2 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eparina
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di eparina fresca 55 μM sciogliendo 1 mg di polvere secca di eparina HMW (MW = 17-19 kDa) in 1 mL di tampone di reazione a TA.</li>
		<li>Agitare vigorosamente e vortex 2 volte per 5 secondi.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso una sterile 0.20 μm PES membrana filtrante di porosità (siringa).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. continuo ThT aggregazione Assay su un lettore di micropiastre Multi-Mode
Nota: ThT colorante viene aggiunto alla reazione per monitorare la cinetica di aggregazione di huTau441 in modo continuo (misurazioni automatiche). Anche se la reazione può essere seguita da un fluorometro regolare utilizzando una provetta convenzionale, la natura manuale dell'operazione limita la frequenza delle misurazioni e compromette la precisione delle curve cinetiche registrate. Per questo motivo, viene utilizzato un lettore di micropiastre a modalità multipla automatica.
<ol><li>
Strumento istituito
	<ol>
<li>Accendere il computer e il lettore di micropiastre a modalità multipla. Lasciate che l'apparecchiatura stabilizzare per 10 minuti.</li>
		<li>Avviare il software e preparare un protocollo.<ol>
<li>Selezionare il tipo di protocollo: protocollo standard (riduzione dei dati viene eseguita in modo indipendente per ogni piatto).</li>
			<li>Impostare la temperatura a 37 ˚ c e selezionare preheatment prima di continuare il protocollo.</li>
			<li>Impostare il funzionamento cinetico: Runtime 50h / intervallo di misurazione: 15 min.</li>
			<li>Impostare orbitale agitazione a 425 cpm (3 mm) in modo continuo.</li>
			<li>Selezionare il metodo di lettura: fluorescenza intensità Endpoint/cinetica - monocromatori lunghezze d'onda: eccitazione 440 nm (larghezza di banda di 20 nm) / emissione 485 nm (ampiezza di banda 20 nm) - ottica posizione: Top - normale legga velocità - lettura altezza: 4,50 mm</li>
			<li>Avviare l'esecuzione utilizzando il protocollo creato. L'esperimento di nome, selezionare la destinazione del file appena creato e consentire lo strumento pre-stabilizzare a temperatura desiderata.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Conversione spontanea huTau441
	<ol>
<li>Preparare il campione di reazione in una provetta da 1,5 mL. Miscela di uso 200 μL a reazione e almeno 4 repliche (replica del volume di reazione per 4 = 800 μL).</li>
		<li>Preparare 800 μL reazione campione (in caso di 4 ripetizioni) contenente 15 μM huTau441, 8 μM eparina e 50 μM ThT. inizio mescolando la proteina con il tampone di reazione, aggiungere eparina e ThT e miscelare bene pipettando su e giù per 5 volte. Rispettare l'ordine indicato per aggiunta dei reagenti.</li>
		<li>Spin di campioni a 12.000 x g e 25 ˚ c per 5 min eliminare le bolle d'aria.</li>
		<li>Dispensare 200 μL di campione di reazione per pozzetto in piastre microtiter da 96 pozzetti (96 pozzetti nero solido micropiastra, volumi ben 360 μL, fondo piatto). Evitare la formazione di bolle d'aria.</li>
		<li>Sigillare la micropiastra per evitare l'evaporazione.</li>
		<li>Posizionare la micropiastra nel lettore di micropiastre a modalità multipla e iniziare la misurazione.</li>
		<li>Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la piastra da attrezzature ed esportare dati in un software di elaborazione dati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controllo di qualità della conversione, raccolta di semi e deposito.
	<ol>
<li>Rimuovere il sigillante dalla piastra e piscina le diverse repliche in provette da 1,5 mL. Mescolare bene il campione aggregato nei pozzetti pipettando su e giù 2 volte prima di raccogliere esso. Aggregati tendono a depositare sul fondo del pozzo.</li>
		<li>Mix accuratamente in 1,5 mL tubo pipettando su e giù per 5 volte e dispensare 10-20 μL su una superficie di mica per l'analisi degli aggregati di AFM (per ulteriori dettagli vedere Apetri et al. 24).</li>
		<li>Raccogliere gli aggregati facendo girare la provetta da 1,5 mL a 20.000 x g e 4 ˚ c per 1 ora. Aggregati formino una pallina.</li>
		<li>Separare e analizzare surnatante di S-MALS per confermare l'assenza di monomerico tau nel campione che indica una corretta conversione in aggregati (per ulteriori dettagli vedere Apetri et al. 24).</li>
		<li>Etichettare la provetta da 1,5 mL contenente i restanti aggregati (pellet) che indica la concentrazione nella proteina iniziale huTau441 e volume del campione. Snap gli aggregati di congelare e conservare a-80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reazione di teste di serie
	<ol>
<li>Rimuovere huTau441 aggregati dal congelatore a-80 ° c. Aggiungere il volume di tampone di reazione indicato sull'etichetta (volume del campione iniziale) e lascia stabilizzare per RT. Risospendere gli aggregati pipettando su e giù per 5-8 volte.</li>
		<li>Sonicare campione aggregato. Per un campione di 200 μL (15 huTau441 μM), trattare con ultrasuoni sul ghiaccio con un microtip 1/8"(da 100 μL a 10 mL) per un periodo totale di 15 s utilizzando impulsi di 1 s e pause di 2 s a 30% ampiezza (sonicatore 250 watt). Riequilibrare il campione a RT. Nota: Le condizioni di sonicazione impiegati portano a una popolazione omogenea delle fibrille di tau con lunghezze di 20-50 nm24.</li>
		<li>Preparare il campione di reazione in provette da 1,5 mL. Miscela di uso 200 μL a reazione e almeno 4 repliche (replica del volume di reazione per 4 = 800 μL).</li>
		<li>Preparare 800 μL di campione di reazione contenente 15 μM huTau441, 8 μM eparina e 50 μM ThT. inizio mescolando la proteina con il tampone di reazione, aggiungere eparina e ThT e miscelare bene pipettando su e giù per 5 volte. Rispettare l'ordine indicato per aggiunta dei reagenti.</li>
		<li>Spin di campioni a 12.000 x g e 25 ˚ c per 5 min eliminare le bolle d'aria.</li>
		<li>Dispensare 200 μL di campione di reazione per pozzetto a 96 pozzetti (96 pozzetti nero solido micropiastra, volumi ben 360 μL, fondo piatto). Evitare la formazione di bolle d'aria.</li>
		<li>Omogeneizzare accuratamente il campione di fibrille preformate da ripetitivi su e giù pipettaggio (5 volte) e aggiungere a ciascun pozzetto l'importo corrispondente alla percentuale desiderata di semi. Per un volume ben totale di 200 μL, 2 μL di aggiunta preformato semi è un 1% (v/v). Mix pipettando su e giù 3 volte quando si aggiunge al pozzo ed evitare la formazione di bolle d'aria.</li>
		<li>Sigillare la micropiastra per evitare l'evaporazione.</li>
		<li>Posizionare la micropiastra nel lettore di micropiastre a modalità multipla e iniziare la misurazione.</li>
		<li>Rimuovere la piastra da attrezzature ed esportare i dati in un foglio di calcolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+tauopathies.">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li><li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease:+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau.">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li><li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains.">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li><li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer's+disease.">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li><li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A68:+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau.">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li><li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer's+disease.">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li><li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies.">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li><li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro.">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li><li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation.">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li><li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231.">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li><li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation.">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).</li><li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers:+Insight+from+studies+in+vitro.">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li><li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li><li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans.">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li><li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li><li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li><li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments.">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li><li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution.">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer's+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein.">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li><li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer's+disease+and+the+tauopathies.">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li><li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein:+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation.">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li><li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy,+corticobasal+degeneration,+FTDP-17+and+Pick's+disease.">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nonostante i numerosi sforzi, la cinetica di aggregazione tau segnalati nella letteratura per mancanza di data, il livello desiderato di riproducibilità e/o alcune delle caratteristiche di una nucleazione dipendenti polimerizzazione19,20,21 , 22 , 23 , 25. questo è spesso sottolineato dalla mancanza di una fase di ritardo, semina inefficiente e non fibrillare natura degli aggregati di tau. La ragione per queste lacune può variare e comprende la qualità di proteina tau sub-ottimale (frammentazione, presenza di aggregati, bassa purezza, ecc.), scelta di proteina e di indurre i reagenti e/o condizioni sperimentali. Un altro fattore di complicazione sono i due residui di cisteina situati dietro l'interfaccia di aggregazione tau che possono formare intra - o inter - molecolare bisolfuro ponti a seconda dell'ambiente redox e influenzano l'efficienza di aggregazione tau. Nella maggior parte degli approcci riducendo reagenti come DTT o TCEP sono stati utilizzati per mantenere i residui di cisteina in forme ridotte e quindi aumentare i livelli di riproducibilità25. Inoltre, il coefficiente di estinzione di tau è molto bassa, che porta a difficoltà di misure accurate di concentrazione nella proteina.
Ci siamo concentrati soprattutto su alcuni parametri e attributi di qualità che abbiamo considerato cruciale per un profilo di aggregazione affidabile, riproducibile e rappresentative per proteina tau: eliminando la possibilità di intra - e inter-formazione di disolfuro molecolare, generazione di un monomero di tau altamente puro e migliorando la precisione della determinazione di concentrazione. Tutti questi reagenti relative domande sono potenziali punti di attenzione che abbiamo considerato critici per lo sviluppo di dosaggio ottimale. Per risolvere questi problemi, huTau441 integrale è stata espressa con due mutazioni, C291A e C322A e con i tag N - e C-terminale. Mutazione dei residui della cisteina ha un impatto minimo sulla proteina tau, eliminando l'altrimenti molto difficile controllare gettare un ponte disolfuro. Esprimenti la proteina con tag relativamente breve N - e C-terminale ci ha permesso di perseguire un protocollo di purificazione di affinità in due fasi che hanno portato a elevata purezza, integrità e contenuto di monomero. Inoltre, abbiamo introdotto una mutazione F8W che aumentato il coefficiente di estinzione della proteina e permesso più accurate misure di concentrazione24.
Oltre a utilizzare i reagenti di proteine di alta qualità, altri parametri di analisi inoltre sono state ottimizzate. Il tau Ottimo: rapporto di eparina è stato identificato per essere intorno a 0,5 (M/M) che è in linea con gli studi precedentemente pubblicati26. Ottiche e meccaniche strumentale impostazioni sono inoltre fondamentale garantire riproducibilità e i parametri ottimali possono differire in qualche misura a seconda del produttore.
L'aggregazione di tau descritto in questo saggio mostra caratteristiche che sono associati con la patogenesi di tau in annuncio e relativi Taupatie. Il processo inizia con una fase di ritardo iniziale corrispondente alla formazione dei nuclei ad alta energia ed è seguito da una fase di rapida crescita che corrisponde alla crescita della fibrilla. Il tempo di ritardo è sufficientemente lungo per aprire una finestra ampia per studiare in dettaglio il processo di seeding che coprono una vasta gamma di concentrazioni di seme (Figura 5) mentre ancora non troppo lungo, così evita di degradazione proteica e/o aggregazione aspecifica (Figura 2). questi eventi secondari potrebbero accadere soprattutto quando una proteina intrinsecamente disordinata come huTau441 è esposto per lunghi periodi di tempo a condizioni fisiologiche. Il display di aggregati ottenuti tau la morfologia di app isolato dai cervelli dei pazienti dell'annuncio e sono molto efficienti nel reclutamento tau monomerico e convertendolo in de novo generato aggregati, un processo citato come semina. Il dosaggio è altamente riproducibile, le curve cinetiche essendo praticamente indistinguibili tra pozzi, funzionamenti sperimentali e lotti di proteina. Anche se il dosaggio attuale si concentra solo sull'isoforma più lunga di tau, huTau441, l'applicazione può essere adattata per studiare la conversione di altre forme di tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica Communications, in corso di stampa), inoltre, permette gli studi meccanicistici focalizzata sull'interazione dei isoforms di tau e possibilmente mettere in luce le differenze tra patogenesi di tau in annuncio dove sia 3R e 4R isoforme sono presenti in app e di PICK malattia o demenza frontotemporale dove taupatia contiene principalmente 3R e 4R isoforms di tau, rispettivamente27.
L'altissima riproducibilità del dosaggio dovrebbe permettere ai lettori di implementarlo con relativa facilità nelle loro impostazioni di laboratorio specifico. Il test simula ciò che si crede di essere il in vivo misfolding e aggregazione di tau, abilitazione studi meccanicistici che farà luce sulla patogenesi di tau e costituisce un prezioso strumento per lo screening di farmaci candidati e valutare la loro interferenza con le diverse fasi del processo di patogenesi.

Morbo di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa devastante che histopathologically è definita dall'accumulo di placche senili extracellulare di aggregati amiloide beta1 e grovigli neurofibrillari intracellulari contenenti aggregati hyperphosphorylated tau protein2. Tau fisiologico è monomerico e presentato come sei isoforme unici che contiene 0-2 inserti terminale N e 3 o 4 microtubule leganti domini3,4 derivanti da splicing alternativo e una media di 2-3 fosforilazioni. Si ritiene che la iperfosforilazione, misfolding e aggregazione in strutture fibrillari costituiscono gli elementi chiave nella patogenesi di tau, come patologico valutato gli individui pazzi5,6.
I grovigli di aggregati neurofibrillari tau sono un segno distintivo, non solo per l'annuncio, ma anche per altre taupatie, compreso degenerazione lobare frontotemporale (FTLD), malattia di Pick, paralisi sopranucleare progressiva (PSP), la demenza fronto-temporale (FTD) e primaria tauopathy senile (parte)2. Da un punto di vista biochimico, la comprensione del meccanismo di tau misfolding e aggregazione potrebbe far luce sui processi patologici associati con l'annuncio e altre Taupatie. Oltre all'aspetto scientifico, robusto in vitro aggregazione saggi sono strumenti preziosi per lo screening di farmaci candidati7,8,9,10. Si ritiene che l'aggregazione di tau segue una nucleazione dipendenti polimerizzazione processo (NDP)11,12,13,14. La cinetica NDP è sigmoidale e inizia con un passo di nucleazione energico sfavorevole seguito da un processo di aggregazione veloce energicamente in discesa.
A differenza di altre proteine amiloidogeniche, tra cui la proteina prionica, beta amiloide e α-synuclein, tau non aggregano spontaneamente in condizioni fisiologiche e pHs anche estreme o ad alte temperature sono non favorevole per aggregazione15. Ciò è probabilmente dovuto le interazioni idrofili presenti nell'interfaccia di aggregazione tau. Tuttavia, tau aggrega in modo efficiente alle concentrazioni fisiologiche quando vengono utilizzati induttori quali eparina16 o altri polianioni17,18 .
I precedenti tentativi di impostare in vitro tau aggregazione saggi hanno fatto qualche luce sui dettagli di tau misfolding e aggregazione, ma sono venuti a corto di che imita quello che si crede di essere la cinetica di aggregazione del tau in vivo . Nella maggior parte dei casi, la cinetica di aggregazione tau mancava la fase di ritardo iniziale associata nucleazione di tau. Questo avrebbe potuto essere la conseguenza di utilizzando le concentrazioni di proteina tau molto elevata, presenza di aggregati nelle preparazioni di proteina tau partenza e/o utilizzo di frammenti di tau con molta maggiore propensione di aggregazione rispetto il più fisiologico tau integrale proteine19,20,21,22,23. Inoltre, gli studi precedenti non hanno affrontato la riproducibilità e l'aspetto di robustezza delle cinetiche di aggregazione tau.
Qui, descriviamo un robusta in vitro tau aggregazione saggio che imita le caratteristiche principali di una polimerizzazione di nucleazione dipendenti con una fase di ritardo iniziale corrispondente per la nucleazione di tau seguita da una fase di crescita esponenziale. Inoltre, gli aggregati generato tau ricombinante sono fibrillari in natura e hanno una potenza estremamente elevata di semina. Il dosaggio è altamente riproducibile anche tra i lotti di tau e rappresenta un prezioso strumento per lo screening inibitori dell'aggregazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1240px;" width="1239">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:353px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">T3516-5G</td>
			<td style="width:308px;">dry powder (Mw = 318.86 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td>dry powder (Mw = 17-19 kDa)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259-1G</td>
			<td>dry powder (MW= 286.65 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Sterile, pH 7.4 (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.20 &#956;m sterile serynge filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431229</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-well microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9502867</td>
			<td>Black, flat botton</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microplate sealers&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>Adhesive strips&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td>Hybrid Technology, Gen5 Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>1,5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonics-Branson SFX250</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-966R</td>
			<td>1/2&#34; Solid Horn and 1/8&#34; microtip&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening

Aggregazione della proteina tau e la formazione di filamenti elicoidali accoppiati è un marchio di garanzia del morbo di Alzheimer e altre Taupatie. Rispetto ad altre proteine associate a malattie neurodegenerative, la cinetica di aggregazione segnalati in vitro per la proteina tau sono meno coerenti che presenta una variabilità relativamente alta. Qui descriviamo lo sviluppo di un in vitro aggregazione test che simula i passi previsti associati tau misfolding e aggregazione in vivo. L'analisi utilizza l'isoforma più lunga di tau (huTau441) che contiene sia inserti acidi N-terminale, nonché quattro domini di legame dei microtubuli (MBD). L'aggregazione in vitro viene attivato tramite l'aggiunta di eparina e seguita costantemente da Tioflavina T fluorescenza in un formato ben 96 micropiastra. Il dosaggio di aggregazione tau è altamente riproducibile tra diversi pozzi, funzionamenti sperimentali e lotti della proteina. L'aggregazione conduce a tau PHF-come la morfologia che è molto efficiente nella semina la formazione di strutture fibrillari de novo . Oltre alla sua applicazione nello studio del meccanismo di tau misfolding e aggregazione, il dosaggio attuale è un robusto strumento per lo screening di farmaci che potrebbero interferire con la patogenesi di tau.

HuTau441 ricombinante contenente le mutazioni C291A e C322A e N-terminale suo e C-terminale di C-tag è stato espresso e purificato come precedentemente descritto24. I batch di huTau441 sono altamente puri come visualizzati su SDS-PAGE e virtualmente 100% monomerico come valutato da S-MALS (Figura 1). L'aggregazione di 15 µM huTau441 è stata indotta tramite l'aggiunta di eparina HMW 8 µM e la reazione è stata seguita costantemente da ThT fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre multimodale. La lunghezza d'onda di eccitazione era 440 nm (larghezza di banda 20 nm) considerando che l'emissione è stata misurata a 485 nm (larghezza di banda 20 nm). Il dosaggio è altamente riproducibile, con risultati da 10 singoli pozzetti essendo praticamente indistinguibili (Figura 2A). Le morfologie degli aggregati huTau441 positivo ThT sono state valutate dopo 50 h di AFM. Aggregati hutau441 è una miscela omogenea di strutture fibrillari di diverse lunghezze simili a morfologie segnalati ex vivo (Figura 2B). Inoltre, la miscela di reazione finale non contiene monomero, suggerendo una conversione completa in aggregati come indicato tramite le misure S-MALS (Figura 2). La cinetica di aggregazione huTau441 nei funzionamenti sperimentali indipendenti sono molto simili, come sottolineato da simili curve sigmoidale e indistinguibili lag e crescita fasi (Figura 3). L'alto livello di riproducibilità viene mantenuta quando vengono utilizzati diversi lotti di proteina (Figura 4). Inoltre, huTau441 preformati aggregati sono molto efficienti nel reclutamento di monomero di tau e inducendo la formazione di aggregati di tau de novo . Importi à partir 0,0025% (v/v) di aggregati di tau preformati sono in grado di bypassare la nucleazione e generazione di innesco delle fibrille de novo (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figura 1: huTau441 ricombinante è monomerico e altamente puro. A) valutazione purezza sotto denaturare condizioni su un gel di SDS-PAGE 4-12% tra cui scaletta di standard della proteina di peso molecolare (in kDA) (Lane 1); scorrono da passaggio finale della purificazione di affinità variabile in C (Lane 2); frazione di colonna lavaggio (corsia 3), eluiti picco della proteina di huTau441, prima (Lane 4) e dopo buffer di scambio (Lane 5), rispettivamente). B) analisi S-Malles Venosta della huTau441. Proteina Mostra > 99,9% monomerico con una massa molare di 51 kDa e non contiene aggregazioni o frammenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figura 2: aggregazione di huTau441 ricombinante è altamente riproducibile e quantitativamente conduce a strutture fibrillari. A) la cinetica dell'eparina aggregazione di huTau441 monitorato continuamente in 96 micropiastra ben formato da ThT fluorescenza indotta. Concentrazioni di huTau441 e l'eparina sono 15 µM e 8 µM, rispettivamente. Le 10 curve individuali corrispondono alla conversione dello stesso lotto di proteina in dieci pozzetti della micropiastra stesso e sono caratterizzate da una fase di ritardo medio (con SD) di 14,2 ± 0,38 h e t50 di 18,8 dati cinetici di ± 0,40 h. era dotato di un 5-parametro logisti curva c con un declino lineare nell'asintoto superiore. Ritardo di fase e t50 sono stati calcolati per interpolazione tra i valori stimati da regressione lineare. Fase di ritardo viene calcolato l'aumento del 3% del segnale di fluorescenza ThT. Curva di raccordo e di riepilogo statistiche sono ottenute utilizzando IBM SPSS versione Statistiche 20.0.0.2. B). aggregati Tau Visualizza PHF-come morfologie come indicato da formazione immagine AFM a 50 h; C). analisi S-MALS huTau441 monomerico (t = 0 h) e il surnatante della miscela di reazione al completamento della reazione (t = 50 h). Presso il punto di tempo di 50 h la miscela di reazione è stata centrifugata per 1h a 20.000 X g e 4 ˚ c e il surnatante provocato iniettato su S-MALS. La scomparsa del picco monomero conferma la completa aggregazione di tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figura 3: il dosaggio di aggregazione tau Mostra alta riproducibilità tra le esecuzioni sperimentali indipendenti. I due pannelli visualizzano quattro tracce individuali cinetica per aggregazione spontanea huTau441 raccolti in due esperimenti indipendenti, utilizzando lo stesso batch della proteina di huTau441. Concentrazioni di huTau441 e l'eparina sono 15 µM e 8 µM, rispettivamente. Cinetica sono caratterizzati da una fase di ritardo medio (con SD) di 12,2 ± 0,18 h e t50 di 17,8 ± 0,8 h (Run 1) e 11,6 ± 0,52 h e t50 di 17,8 ± 0,23 h (Run 2), rispettivamente. Dati cinetici era dotati di una curva logistica a 5 parametri con un declino lineare nell'asintoto superiore. T50 sono stati calcolati per interpolazione tra i valori stimati da regressione lineare. Fase di ritardo viene calcolato l'aumento del 3% del segnale di fluorescenza ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figura 4: il dosaggio di aggregazione tau Mostra alta riproducibilità fra i gruppi differenti della proteina di huTau441. Ogni pannello mostra che quattro replica corrispondente a un batch di huTau441 specifici. L'aggregazione di ogni lotto è stato seguito in esperimenti indipendenti. Concentrazioni di huTau441 e l'eparina sono 15 µM e 8 µM, rispettivamente. Cinetica di aggregazione corrispondente a quattro tau singoli lotti sono caratterizzati da una fase di ritardo medio (con SD) di 15,3 ± 0,38 h e t50 di 21,1 ± 0,46 h (lotto 1); fase di ritardo di 12,5 ± 0,07 h e t50 di 19,8 ± h 0,34 (lotto 2); ritardo di fase di 15,1 ± 0,34 h e t50 di 21,9 ± 0,86 h (Batch 3) e ritardo di fase di 11,5 ± 0,29 h e t50 di 17,8 ± 0,29 h (lotto 4), rispettivamente. Dati cinetici era dotati di una curva logistica a 5 parametri con un declino lineare nell'asintoto superiore. Ritardo di fase e t50 sono stati calcolati per interpolazione tra i valori stimati da regressione lineare. Fase di ritardo viene calcolato l'aumento del 3% del segnale di fluorescenza ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figura 5: preformato hutau441 aggregati hanno alto semina attività. Per avviare la semina, lisati mediante tau aggregati sono stati aggiunti hutau441 di monomero. Dal rosso al blu, ogni colore delle curve cinetiche diverse rappresenta la quantità differente di semi aggiunto: 1,25%, 0.63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% e 0,0025% (v/v), rispettivamente. La conversione spontanea di hutau441 è rappresentata in nero. Tutte le condizioni sono state testate in quadruplice copia. La replica di cinetica quattro associata con una certa concentrazione di semi è altamente riproducibili e nella maggior parte dei casi indistinguibili. Concentrazioni di hutau441 e l'eparina sono 15 µM e 8 µM, rispettivamente. L'aggiunta di piccole quantità di pre-formate lisati mediante strutture fibrillari Elimina la fase di ritardo iniziale osservata nella conversione spontanea e l'effetto è proporzionale con la quantità di semi. Dal rosso al blu, la differenza di t50 (t50 spont.conv-t50 semina) osservato è 18,9, 18.40, 17,8, 17.3, 16,6, 16,1, 15,4, 14,7, 14,2 e 13,7 ore, rispettivamente. La conversione spontanea di hutau441 è caratterizzata da un medio t50 (con la deviazione standard) di 19,85 ± 0,54 h. dati cinetici era dotato di una curva logistica a 5 parametri con un declino lineare nell'asintoto superiore. t50 sono stati calcolati per interpolazione tra i valori stimati da regressione lineare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Test per studiare l'aggregazione della proteina Tau e lo Screening di stupefacenti

Il dosaggio di aggregazione tau descritto in questo manoscritto imita le funzionalità attese di in vivo tau misfolding e aggregazione.

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Il misfolding della proteina Tau nel suo auto-assemblaggio in filamenti elicoidici accoppiati è un segno patologico del morbo di Alzheimer e di altre Tauopatie. Qui presentiamo un robusto saggio di aggregazione Tau che potrebbe aiutare a chiarire il processo di patogenesi tau. La conversione segue tutte le fasi di un processo di polimerizzazione dipendente dalla nucleazione ed è altamente riproducibile, consentendo lo screening dei farmaci in un formato più rigoroso che ha soddisfatto il livello OBSI fino ad oggi.La qualità dei reagenti è fondamentale. Il ricombinante Tau deve essere altamente puro e privo di aggregati e di frammenti. Prima accendere il computer e il lettore di micropiatte multimodale.Dopo aver permesso all'apparecchiatura di stabilizzarsi, avviare il software e selezionare Protocollo standard come tipo di protocollo. Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e selezionare Preriscaldamento prima di continuare il protocollo. Impostare quindi il tempo di esecuzione cinetico su 50 ore e l'intervallo di misurazione su 15 minuti.Impostare lo scuotimento orbitale su 425 cicli al minuto in modalità continua. In seguito, selezionare il metodo di lettura come momocromatori cinetici dell'intensità di fluorescenza. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 440 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 485 nanometri, la posizione ottica verso l'alto e il guadagno a 80.Selezionare la velocità di lettura normale e impostare l'altezza di lettura su 4,50 millimetri. Quindi convalidare e salvare il protocollo. Avviare l'esecuzione utilizzando il protocollo creato.Denominare l'esperimento, selezionare la destinazione del file appena creato e consentire allo strumento di pre-equilibrare alla temperatura desiderata. Per un esperimento spontaneo di conversione tau ricombinante, preparare un campione di reazione di 1.000 microlitri con 800 microlitri per la fluorescenza tioflavina-T e 130 microlitri per l'analisi SEC-MALS mescolando prima la proteina con il tampone di reazione in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere eparina e tioflavina-T e mescolare bene pipettando su e giù cinque volte.È importante eseguire il protocollo con precisione per garantire un'elevata riproducibilità, mescolare i reagenti nello stesso ordine e mantenerli entro i tempi previsti. Ruotare il campione a 12.000 x g e 25 gradi Celsius per cinque minuti per eliminare le bolle d'aria. Dopo la centrifugazione erogare 200 microlitri di campione di reazione per pozzo in una micropiatta da 96 po', evitando la formazione di bolle d'aria.Quindi sigillare la micropiatta per evitare l'evaporazione. Posizionare la micropiatta in un lettore di micropiatte multimodale. Selezionare la piastra completa o, se la piastra non è piena, selezionare i pozzi da leggere e avviare la misurazione.Esportare i dati nel software di elaborazione dati. Quindi rimuovere la micropiatta dall'apparecchiatura. Quindi, rimuovere il sigillare dalla micropiatta.Mescolare il campione aggregato nei pozzetti pipettando su e giù due volte e mettere in comune le diverse repliche in tubi da 1,5 millilitri. Mescolare accuratamente ogni campione tubazione su e giù cinque volte e distribuire da 10 a 20 microlitri su una superficie di mica per analizzare gli aggregati mediante microscopia a forza atomica. In seguito, raccogliere gli aggregati ruotando ciascuno un tubo da 1,5 millilitri a 20.000 x g e 4 gradi Celsius per un'ora.Analizzare il supernatante da SEC-MALS per confermare l'assenza di Tau monomerico nel campione, indicando una conversione riuscita in aggregati. Successivamente, rimuovere tutti i supernatanti rimanenti ed etichettare il tubo da 1,5 millilitri contenente gli aggregati rimanenti con la concentrazione iniziale della proteina Tau ricombinante e il volume del campione. Snap blocca gli aggregati e archivia a 80 gradi Celsius.Per un esperimento seminato, rimuovere gli aggregati Tau ricombinanti dal congelatore, aggiungere il volume del buffer di reazione indicato sull'etichetta e lasciare che il tubo si stabilizzi a temperatura ambiente. Quindi rimospendare gli aggregati con pipettando su e giù da cinque a otto volte. Sonicare il campione aggregato da 200 microliter sul ghiaccio utilizzando una microtip da 1/8 di pollice per un periodo totale di 15 secondi con impulsi di un secondo e due secondi di disaggregazione al 30% di ampiezza.Successivamente, preparare un campione di reazione di 800 microlitri mescolando prima la proteina con il tampone di reazione in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere eparina e tioflavina-T e mescolare bene pipettando su e giù cinque volte. Ruotare i campioni a 12.000 x g e 25 gradi Celsius per cinque minuti per eliminare le bolle d'aria.Dopo la centrifugazione, erogare 198 microlitri di campione di reazione per pozzo in una micropiatta da 96 porri, evitando la formazione di bolle d'aria. Omogeneizzare il campione fibrale pre-formato con pipettando su e giù tre volte. Aggiungere la quantità corrispondente alla percentuale desiderata di semi ad ogni pozzo e mescolare pipettando su e giù tre volte.Quindi sigillare la micropiatta per evitare l'evaporazione. Posizionare la micropiatta nel lettore di micropiatte multimodale e avviare la misurazione. Al termine dell'esperimento, rimuovere la micropiatta dall'apparecchiatura.Quindi esportare i dati in un foglio di calcolo. I Tau ricombinanti contenenti le mutazioni C291A e C322A e n terminali i suoi e c c-tag terminali sono altamente puri come visualizzato sulla pagina SDS e praticamente monomerici al 100% come valutato da SEC-MALS. L'aggregazione tau ricombinante indotta dall'eparina è stata seguita dalla fluorescenza tioflavina-T usando una lunghezza d'onda di eccitazione di 440 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 485 nanometri.Il saggio è altamente riproducibile con risultati di 10 singoli pozzi praticamente indistinguibili. Gli aggregati tau ricombinanti sono una miscela omogenea di strutture fibulari di diverse lunghezze, simile alle morfologie ex-vivo riportate. La miscela di reazione finale non contiene monomero, suggerendo una conversione completa in aggregati, come mostrato dalle misurazioni SEC-MALS.La cinetica dell'aggregazione tau ricombinante in serie sperimentali indipendenti è simile, come sottolineato da curve sigmoidali simili e fasi di ritardo e crescita indistinguibili. L'alto livello di riproducibilità viene mantenuto quando vengono utilizzati diversi lotti di proteine. Gli aggregati tau ricombinanti pre-formati sono efficienti nel reclutare monomero Tau e nell'indurre la formazione di aggregati de novo Tau, e l'efficienza del processo è direttamente proporzionale con la percentuale di semi.Quantità fino a 0,0025% degli aggregati Tau pre-formati espressi in volume sono in grado di bypassare la nucleazione Tau ricombinante e innescare la generazione di fibrali de novo. L'attuale saggio imita quello che si ritiene essere l'in vivo misfolding e aggregazione di Tau e consente studi meccanicistici che potrebbero far luce sul processo di patogenesi e costituisce uno strumento prezioso per lo screening dei farmaci e lo studio dell'interferenza dei candidati ai farmaci con diverse fasi del processo. L'elevata riproducibilità del saggio consentirà agli scienziati di implementarlo con relativa facilità in laboratorio.Sebbene il saggio attuale si concentri solo sull'isoforma Tau più lunga, il Tau-441 umano, l'applicazione può essere adattata per studiare diverse varianti tau. E non dimenticate che la selezione dei giusti reagenti proteici e la loro produzione ad elevati standard qualitativi sono essenziali per creare un saggio robusto e altamente riproducibile.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

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La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-based test per studiare la Clearance di Tau anticorpo-mediato da Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...