Name: in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00
Duration: 9 min 49 s
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저자는 한 나 Inganäs 및 우수한 기술 지원에 대 한 마 반 빈 센 마틴 Koldijk 데이터 분석에 대 한 표현과 huTau441의 정화에 대 한 헥 터 Quirante를 감사 하 고 싶습니다.

1. 시 약 준비
<ol><li>
반응 버퍼
	<ol>
<li>반응 버퍼 준비: 0.5 m m PBS, pH 6.7 TCEP 건조 분말을 용 해 하 여에 한 TCEP (MW = 286.65 g/mol) PBSstock 솔루션, pH 7.4에에서. 참고: TCEP의 존재 때문에 집계 연구 시스테인을 포함 하는 야생 타입 타우 단백질을 사용 하 여 브리지 이다. 현재 프로토콜에서 TCEP 6.7 7.4에서 PBS의 pH 조정에 사용 되 고 어떤 산화 환 원 반응 조절에 역할을 재생 합니다.</li>
		<li>철저 하 게 혼합 하 고 메 마른 0.22 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		<li>약 수 그리고-80 ˚C에 게입니다.</li>
		<li>벤치에 thaw 하 고 사용 하기 전에 RT에서 안정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>(자세한 단백질 표정과 정화 참조 Apetri 그 외 여러분 huTau441 제거 24)-80 ˚C 냉장고에서.</li>
		<li>벤치에 thaw 하 고 실내 온도 (RT) equilibrate.</li>
		<li>12000 x g 20-25 ˚C 공기 방울을 제거에 5 분의 단백질 재고와 튜브를 회전 합니다.</li>
		<li>280에서 huTau441by 흡수의 농도 측정 nm 0.31 mL mg-1c m-1 의 소 광 계수를 사용 하 여
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thioflavin T
	<ol>
<li>10mg ThT 건조 분말을 용 해 하 여 500 μ M thioflavin T (ThT) 재고 솔루션을 준비 (MW = 318.86 g/mol) 35 mL 반응 버퍼에.</li>
		<li>철저 하 게, 소용돌이 3 번 최대 속도에서 20 초 동안 혼합 하 고 메 마른 0.22 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 필터링.</li>
		<li>411에서 흡수 측정 하 여 농도 결정 nm 22000 M-1 c m-1 의 소 광 계수를 사용 하 여 500 μ M ThT 농도 조정 하 고. 빛에서 보호 하는 RT에 저장 합니다. 2 개월 마다 준비 신선한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린
	<ol>
<li>HMW 덤플링 건조 분말의 1 mg를 용 해 하 여 신선한 55 μ M 덤플링을 솔루션 준비 (MW = 17-19 kDa) 1 mL 반응 buffer 실시간</li>
		<li>적극적으로 악수 하 고 소용돌이 2 5 초 동안 시간.</li>
		<li>살 균 0.20 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터 (주사기)를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 연속 모드 ThT 집계 분석 결과 다중 모드 Microplate 리더
참고: ThT 염료 연속 모드 (자동 측정) huTau441 집계 활동 모니터링에 대 한 반응에 추가 됩니다. 비록 반응 일반 fluorometer에 의해 지켜질 수 있다 기존의 cuvette을 사용 하 여 작업의 수동 자연 제한 측정 주파수 및 기록 된 운동 곡선의 정확도 손상. 이러한 이유로 자동 멀티 모드 microplate 리더 사용 됩니다.
<ol><li>
악기 설정
	<ol>
<li>컴퓨터와 다중 모드 microplate 리더를 켭니다. 10 분 동안 안정화 장비 하자.</li>
		<li>소프트웨어를 시작 하 고 준비 하는 프로토콜.<ol>
<li>프로토콜 종류 선택: 표준 프로토콜 (데이터 축소 수행 하지 독립적으로 각 접시).</li>
			<li>37 ˚C에서 온도 설정 하 고 프로토콜을 계속 하기 전에 preheatment를 선택 합니다.</li>
			<li>운동 실행 설정: 실행 시간 50 h / 측정 간격: 15 분.</li>
			<li>연속 모드에서 425 cpm (3mm)에 떨고 궤도 설정 합니다.</li>
			<li>읽기 방법 선택: 형광 강도 끝점/운동-Monochromators 파장: 여기 440 nm (20 nm 대역폭) / 방출 485 nm (20 nm 대역폭)-광학 위치: 탑-정상 읽기 속도-읽기 높이: 4.50 m m</li>
			<li>만든된 프로토콜을 사용 하 여 실행을 시작 합니다. 실험의 이름을 새로 만든된 파일의 대상을 선택 하 고 원하는 온도를 사전 equilibrate 악기를 허용.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자발적인 huTau441 변환
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 반응 샘플을 준비 합니다. 반응 및 4 복제 사용 200 μ 믹스 (4에 대 한 반응 볼륨 복제 800 μ =).</li>
		<li>800 μ 반응 샘플 (4 복제)의 경우 15 μ M huTau441, 8 μ M 헤 파 린 및 50 μ M 준비 ThT. 단백질 반응 버퍼와 혼합 하 여 시작 덤플링을 ThT을 추가 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 혼합. 시 추가 대 한 표시 순서를 존중 합니다.</li>
		<li>12000 x g, 공기 방울을 제거 하기 위해 5 분 동안 25 ˚C에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>200 μ 당 96 잘 microplates에 잘 반응 샘플의 분배 (96-잘 블랙 솔리드 microplate, 잘-볼륨 360 μ, 편평한 바닥). 기포의 형성을 하지 마십시오.</li>
		<li>증발을 피하기 위해 microplate 인감.</li>
		<li>멀티 모드 microplate 리더에 미 판 놓고 측정을 시작 합니다.</li>
		<li>실험의 완료 후 장비에서 플레이트를 제거 하 고 데이터 처리 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환, 씨앗 수집 및 저장의 품질 확인 합니다.
	<ol>
<li>접시에서는 마감재를 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 다른 복제 수영장. 그것을 수집 하기 전에 2 번 아래로 pipetting으로 우물에서 집계 샘플 혼합 잘. 집계 우물의 바닥에 예금 해 경향이 있다.</li>
		<li>믹스 철저 하 게에 1.5 mL 튜브 5 번 위아래로 pipetting으로 분배 (대 한 자세한 내용은 참조 Apetri 외. AFM에 의해 집계를 분석 하기 위한 운 모 표면에 10-20 μ 24)입니다.</li>
		<li>1 시간 동안에 x g와 4 ˚C 20000 1.5 mL 튜브를 회전 하 여 집계를 수확. 집계는 펠 릿을 형성합니다.</li>
		<li>분리 하 고 상쾌한 S-MALS 성공적인 변환 (자세한 내용은 참조 Apetri 그 외 여러분 에 대 한 집계를 나타내는 샘플에서 단위체의 부재를 확인 하 여 분석 24)입니다.</li>
		<li>레이블을 나타내는 초기 huTau441 단백질 농도 및 샘플 볼륨 나머지 집계 (펠 릿)를 포함 하는 1.5 mL 튜브. 스냅 집계를 동결 하 고-80 ˚C에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시드 반응
	<ol>
<li>HuTau441 집계-80 ˚C 냉동 고에서 제거 합니다. 반응 버퍼의 볼륨 레이블 (초기 샘플 볼륨)에 표시 된 고 8 번 5 위아래로 pipetting으로 집계 실시간 Resuspend을 안정화 하는 튜브를 추가 합니다.</li>
		<li>집계 샘플 sonicate 200 μ 샘플 (15 μ M huTau441), 1/8"microtip을 사용 하 여 얼음에 sonicate (100 μ에서 최대 10 mL) 15의 전체 기간에 대 한 s 1의 펄스와 2의 일시 중지를 사용 하 여 s 30% 진폭 (sonicator 250 와트)에서. 다시 실시간 샘플 equilibrate 참고: 고용된 쥡니다 조건 20-50 nm24의 길이와 타우 소의 균질 인구 이어질.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 반응 샘플을 준비 합니다. 반응 및 4 복제 사용 200 μ 믹스 (4에 대 한 반응 볼륨 복제 800 μ =).</li>
		<li>15 μ M huTau441, 8 μ M 헤 파 린 및 50 μ M를 포함 800 μ 반응 샘플 준비 ThT. 단백질 반응 버퍼와 혼합 하 여 시작 덤플링을 ThT을 추가 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 혼합. 시 추가 대 한 표시 순서를 존중 합니다.</li>
		<li>12000 x g, 공기 방울을 제거 하기 위해 5 분 동안 25 ˚C에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>200 μ 당 96 잘 (96-잘 블랙 솔리드 microplate, 잘-볼륨 360 μ, 편평한 바닥)에 잘 반응 샘플의 분배. 기포의 형성을 하지 마십시오.</li>
		<li>균질 철저 하 게 미리 형성한 fibril 샘플 반복 의해 위아래로 pipetting (5 회) 고 각 잘 금액 씨앗의 원하는 비율에 추가 합니다. 200 μ 잘 총 볼륨에 대 한 미리 형성한 씨앗 추가의 2 μ 1% (v/v)입니다. 믹스를 위아래로 pipetting으로 3 우물에 추가할 때 시간 및 기포의 형성을 방지.</li>
		<li>증발을 피하기 위해 microplate 인감.</li>
		<li>멀티 모드 microplate 리더에 미 판 놓고 측정을 시작 합니다.</li>
		<li>장비에서 플레이트를 제거 하 고 데이터를 스프레드시트로 내보내기.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+tauopathies.">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li><li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease:+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau.">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li><li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains.">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li><li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer's+disease.">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li><li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A68:+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau.">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li><li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer's+disease.">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li><li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies.">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li><li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro.">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li><li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation.">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li><li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231.">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li><li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation.">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).</li><li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers:+Insight+from+studies+in+vitro.">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li><li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li><li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans.">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li><li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li><li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li><li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments.">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li><li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution.">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer's+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein.">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li><li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer's+disease+and+the+tauopathies.">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li><li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein:+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation.">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li><li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy,+corticobasal+degeneration,+FTDP-17+and+Pick's+disease.">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li></ol>

저자는 공개 없다.

수많은 노력에도 불구 하 고 타우 집계 활동 날짜 부족 재현성의 원하는 수준 및/또는 nucleation 종속 합19,,2021 의 기능 중 일부를 문학에서 보고 , 22 , 23 , 25. 이것은 종종 지연 위상, 비효율적인 시드 및 타우의 원 비 자연의 부족에 의해 강조. 이러한 단점에 대 한 이유 다를 수 있습니다 고 최적의 타우 단백질 품질 (조각화, 집계, 낮은 순도, 등등의 존재.), 단백질 및 시 약 및 실험 조건 또는 유도 포함 한다. 또 다른 있느냐는 2 시스테인 잔류물 타우 집계 인터페이스 주위에 형성 내부-수 있는 인테르-산화 환 원 환경 및 영향 타우 집계의 효율성에 따라 분자 이황화 다리. 대부분의 방식에서 DTT 또는 TCEP 시스테인 잔류물 감소 형태로 유지 하 고 따라서 증가 재현성25레벨에 사용 된 시 약을 줄이고. 또한, 타우의 소멸 계수는 매우 낮은 단백질 농도의 정확한 측정에 어려움에 이르게.
우리는 몇 가지 매개 변수 및 타우 단백질에 대 한 강력 하 고, 재현 고 대표 집계 프로필에 대 한 중요 한 고려 하는 품질 특성에 특히 집중: 내부-의 가능성을 제거 하 고 간-분자 이황화 형성, 매우 순수한 타우 모노 머를 생성 하 고 농도 결정의 정확도 향상. 이러한 모든 시이 약 관련 된 질문은 최적의 분석 결과 개발에 대 한 중요 한 고려 하는 잠재적인 관심 포인트. 이러한 문제를 해결 하려면 두 개의 돌연변이, C291A 및 C322A, 그리고 N-C 터미널 태그 전체 길이 huTau441 표현 했다. 시스테인 잔류물의 돌연변이 달리 매우 통제 하기 어려운 이황화 다리 제거 하는 동안 타우 단백질에 최소한의 영향을 있다. 상대적으로 짧은 N와 C 맨끝 태그와 단백질을 표현 하 여 매우 높은 순도, 무결성 및 단위체 콘텐츠 주도 단계 선호도 정화 프로토콜을 추구 수 있었습니다. 또한, 우리는 단백질의 소멸 계수를 증가 하 고 훨씬 더 정확한 농도 측정24를 허용 하는 F8W 돌연변이 소개 했다.
높은-품질 단백질 시 약을 사용 하 여 다른 분석 결과 매개 변수 또한 최적화 했다. 최적의 타우: 헤 파 린 비율 이전 출판된 연구26은 0.5 (M/M) 주위에 확인 되었다. 또한, 기계 및 광학 경 음악 설정은 재현성 및 최적의 매개 변수를 제조 업체에 따라 어느 정도 달라질 수 있습니다 위해 중요 합니다.
이 분석 결과에서 설명의 집계 타우 pathogenesis 연관 광고에 및 tauopathies 관련 특성을 보여 줍니다. 프로세스는 해당 고 에너지 핵의 형성 하는 초기 지연 위상 시작 하 고에 해당 하는 급속 한 성장 단계 fibril 성장. 지연 시간은 충분히 긴 시드 프로세스 씨앗 농도 (그림 5) 동안 여전히 너무 오래 그래서 단백질 저하 및 일반적인 집계를 피할 수의 광범위 한 범위 (그림 자세히 공부 넓은 창을 열려면 2). 이러한 2 차 이벤트 huTau441 등 본질적으로 무질서 단백질 생리 적 조건에 시간의 오랜 기간 동안 노출 되 면 일이 특히 수. PHFs의 형태 광고 환자의 두뇌에서 격리 되며 모집 단위체 타우를 드 노 보 에서 매우 효율적인 획득된 타우 집계 표시 집계, 시드 라고 하는 프로세스를 생성. 분석 결과 사실상 우물, 실험 실행 및 단백질 일괄 처리 사이 구별 되 고 운동 곡선 높은 재현성. 현재 분석 결과 긴 타우 isoform, huTau441에 초점을 맞추고 있지만 응용 프로그램을 적용할 수 있습니다 또한, 다른 형태의 타우 (Ameijde 그 외 여러분, Acta Neuropathologica 통신, 언론에서)의 변환 연구 그것은 수 기계 연구 tau isoforms의 상호 작용에 초점을 맞춘 고 가능성이 있는 3R, 4R isoforms는 PHFs 및 선택의 질병 또는 치 매 Frontotemporal에 타우 병리학 주로 포함 되어 있는 광고에 타우 pathogenesis의 차이점에 빛을 발산 3R, 4R tau isoforms, 각각27.
분석 결과의 매우 높은 재현성 상대적으로 쉽게 그들의 특정 랩 설정에서 그것을 구현 하는 독자를 허용 해야 합니다. 분석 결과 믿어지는 무슨이 vivo에서 misfolding과 타우의 모방, 타우 pathogenesis 및 그것에 빛을 발산 하게된다 기계 연구 약물 후보를 심사 하기 위한 유용한 도구를 구성 및 그들의 간섭 평가 와 병 인 과정의 다른 단계.

Alzheimer의 질병은 histopathologically 집계 된 아 밀 로이드 베타1 의 세포 외 치 플 라크의 축적에 의해 정의 된 치명적인 신경 퇴행 성 장애 및 포함 하는 세포내 neurofibrillary tangles 집계 hyperphosphorylated 타우 단백질2. 생리 타우 단위체 이며 6 독특한 isoforms를 포함 하는 0-2로 제시 N 터미널 삽입 및 3 또는 4 microtubule 바인딩 도메인3,4 평균 2-3 phosphorylations의 양자 택일 접합에서 발생. Hyperphosphorylation, misfolding 및 fibrillary 구조로 자체 집계 미친된 개인5,6병 적 평가로 타우 pathogenesis의 핵심 요소를 구성 하는 믿 었 다.
광고 뿐만 아니라 frontotemporal lobar 변성 (FTLD), 선택의 질병, 진보적인 supranuclear 마비 (PSP), fronto 일시적인 치 매 (FTD) 및 주를 포함 하 여 다른 tauopathies 집계 neurofibrillary 타우 tangles 특징은 나이 관련 된 tauopathy (부)2. 생 화 확 적인 관점에서 광고와 관련 된 병 적인 과정에 빛을 발산 수 타우 misfolding 및 집계의 메커니즘을 이해 하 고 다른 tauopathies. 과학적 측면 뿐만 아니라 강력한 생체 외에서 집계 분석 실험 약물 후보7,8,,910의 심사에 대 한 귀중 한 도구입니다. 타우의 aggregation nucleation 의존 중 합 프로세스 (NDP)11,12,,1314다음 믿어진다. 신 민 당 활동 자형 이며 빠른 정력적으로 내리막 집계 과정 뒤에 정력적으로 형편이 나쁜 nucleation 단계 시작.
다른 amyloidogenic 단백질, 프리온 단백질, 녹말 체 beta와 α-synuclein를 포함 하 여 달리 타우 자발적으로 생리 적인 조건 하에서 집계 되지 않습니다 그리고 심지어 극단적인 pHs 또는 높은 온도 비 집계15에 대 한 대조. 이것은 대부분의 아마 타우 집계 인터페이스에 hydrophylic 상호 작용입니다. 그러나, 타우 집계 효율적으로 생리 적인 농도에서 헤 파 린16 등 다른 polyanions17,18 inducers를 사용 하는 경우.
타우 집계 분석 생체 외에서 설정 하는 이전 노력 타우 misfolding 및 집계, 세부 사항에 도움이 되 거 있다 하지만 그들은 무슨 vivo에서 타우 집계 활동 여겨진다 흉내 낸의 짧은. 대부분의 경우, 타우 집계 활동 타우 nucleation와 관련 된 초기 지연 위상을 부족 했다. 이 결과 매우 높은 타우 단백질 농도 사용 하 여 집계 시작 타우 단백질 준비에서의 존재 및/또는 더 많은 생리 적 전체 길이 타우 보다 훨씬 더 높은 집계 성향으로 타우 조각의 사용 되었을 수 있습니다. 단백질19,20,21,,2223. 또한, 이전 연구는 재현성 및 타우 집계 활동의 견고성 측면을 해결 하지 않았다.
여기, 우리는 강력한 생체 외에서 타우 집계 분석 결과 해당 하는 지 수 성장 단계 다음 타우 nucleation 초기 지연 위상 nucleation 종속 합의 주요 특성을 모방을 설명 합니다. 또한, 생성 된 재조합 타우 집계 자연에서 원 고 매우 높은 시드 힘. 분석 결과 또한 타우 배치 사이 높은 재현성 이며 집계 억제제에 대 한 화면에 유용한 도구를 나타냅니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1240px;" width="1239">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:353px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">T3516-5G</td>
			<td style="width:308px;">dry powder (Mw = 318.86 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td>dry powder (Mw = 17-19 kDa)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259-1G</td>
			<td>dry powder (MW= 286.65 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Sterile, pH 7.4 (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.20 &#956;m sterile serynge filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431229</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-well microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9502867</td>
			<td>Black, flat botton</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microplate sealers&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>Adhesive strips&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td>Hybrid Technology, Gen5 Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>1,5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonics-Branson SFX250</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-966R</td>
			<td>1/2&#34; Solid Horn and 1/8&#34; microtip&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening

타우 단백질의 집계와 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 형성은 Alzheimer의 질병 그리고 다른 tauopathies의 특징. 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 다른 단백질에 비해, 타우 단백질에 대 한 보고 체 외에서 집계 속도 덜 일관 된 상대적으로 높은 가변성을 제시. 여기는 생체 외에서 집계 분석 결과 타우 misfolding 및 집계 비보와 관련 된 예상된 단계 개발에 설명 합니다. 분석 결과 N 맨끝 산 성 삽입 뿐만 아니라 4 개의 microtubule 바인딩 도메인 (MBD)는 긴 타우 isoform (huTau441)를 사용 합니다. 생체 외에서 집계는 덤플링의 추가 의해 트리거되는 96 잘 microplate 형식에서 thioflavin T 형광 지속적으로 선행 하 고. 타우 집계 분석 결과 매우 다른 우물, 실험 실행 및 단백질의 일괄 처리 사이 재현 이다. 집계 리드 타우 PHF 같은 형태학 시드 드 노 보 원 구조의 형성에 매우 효율적입니다. 타우 misfolding 및 집계의 기계 장치를 공부 하 고 응용 프로그램 뿐만 아니라 현재 분석 결과 심사 약물의 병 인을 방해할 수 있는 강력한 도구입니다.

재조합 huTau44124설명 포함 하는 C291A 및 C322A 돌연변이 그의 C-터미널 C-태그 표현 되었고 이전 정화의 N 맨끝. HuTau441 배치는 SDS 페이지와 거의 100 %S-MALS (그림 1)에 의해 평가 단위체에 시각으로 매우 순수. 15 µ M huTau441의 집계 8 µ M HMW 덤플링의 추가 의해 유도 되었다 고 반응 계속 ThT 형광 다중 모드 microplate 리더를 사용 하 여 뒤를 이었다. 여기 파장은 440 nm (대역폭 20 nm) 방출 485에서 측정 했다 반면 nm (대역폭 20 nm). 분석 결과 거의 구별할 (그림 2A) 되 고 10 개인 우물에서 결과 함께 매우 재현. ThT 긍정적인 huTau441 집계의 형태학은 50 시간 후 AFM에 의해 평가 됐다. 집계 hutau441 보고 비보 전 형태학 (그림 2B)와 비슷한 다른 길이의 원 구조의 균질 혼합물 이다. 또한, 최종 반응 혼합물 S MALS 측정 (그림 2C)에서 같이 집계에 전체 변환을 제안 하는 모노 머를 포함 하지 않습니다. HuTau441 집계에서 독립적인 실험 실행의 활동 유사한 자형 커브와 분간 지연 및 성장 단계 (그림 3)에 의해 강조 매우 비슷합니다. 단백질의 다른 배치를 사용 하는 경우 재현성의 높은 수준 유지 됩니다 (그림 4). 또한, 미리 형성한 huTau441 집계는 타우 단위체를 보충 하 고 유도 하는 데 노 보 타우의 형성에 매우 효율적. 미리 형성한 타우 집계 0.0025% (v/v)의 낮은 양의 nucleation 및 트리거 드 노 보 소 (그림 5)의 생성을 무시할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> 그림 1: 재조합 huTau441는 단위체와 매우 순수. 분자량 표준 단백질 사다리 (kDA)를 포함 하 여 4-12 %SDS 페이지 젤에 조건을 변성 시키기 아래 A) 순수성 평가 (레인 1); 마지막 C 태그 선호도 정화 단계 (레인 2);에서 통과 열 세척 분수 (3 차선), huTau441 단백질 피크 (4 차선) 전에 eluted 고 버퍼 후 교환 (5 레인), 각각). B) S-MALS는 huTau441의 분석. 단백질 > 99.9% 단위체 51 kDa의 분자량으로 표시 하 고 집계 또는 조각을 포함 하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> 그림 2: 재조합 huTau441의 높은 재현성 이며 원 구조를 양적 리드. A) 헤 파 린의 활동 유도 huTau441 집계 ThT 형광에 의해 96 잘 microplate 형태로 지속적으로 모니터링 한다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 10 개별 곡선 같은 microplate의 10 우물에서 동일한 단백질 배치의 변환에 해당 하며 14.2의 평균 (SD)와 지연 단계를 특징으로하는 ± 0.38 h와 t50 18.8 ± 0.40 h. 운동 데이터의 5 매개 변수 logisti를 장착 했다 위 점근 선형 감소와 c 곡선입니다. 지연 위상 및 t50 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이 보간을 계산 했다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. 커브 피팅 및 요약 통계 IBM SPSS 통계 버전 20.0.0.2 사용 하 여 얻을 수 있습니다. B). 타우 집계 표시 PHF 같은 형태학 50 h;에서 AFM 이미지에 표시 된 대로 C). 단위체 huTau441의 S MALS 분석 (t = 0 h)과 반응의 완료에서 반응 혼합물의 상쾌한 (t = 50 h). 50 h 시간 지점에서 반응 혼합물 1 h g와 4 ˚C와 S MALS에 주입 결과 상쾌한 X 20000에 대 한 centrifuged 이었다. 모노 머의 실종의 완전 한 집합을 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> 그림 3: 타우 집계 분석 결과 독립 실험 실행 사이 높은 재현성을 보여줍니다. 두 개의 패널 huTau441 단백질의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 두 개의 독립적인 실험에서 수집 하는 자발적인 huTau441 집계에 대 한 4 개의 개별 활동 추적을 표시 합니다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 속도 론 12.2 ± 0.18 h와 17.8 ± 0.8 h (실행 1)와 11.6 ± 0,52 h t50 의 (SD)와 평균 지연 위상과 t50 17.8 ± 0.23 h (실행 2)의 각각 특징입니다. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. T50 은 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이의 보간에 의해 계산 되었다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> 그림 4: 타우 집계 분석 결과 huTau441 단백질의 다른 배치 사이 높은 재현성을 보여줍니다. 각 패널 4에 해당 하는 특정 huTau441 일괄 복제 보여줍니다. 각 일괄 처리의 집계는 독립적인 실험에 선행 되었다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 일괄 처리 15.3 ± 0.38 h (SD)와 평균 지연 위상과 t50 21.1 ± 0.46 h (배치 1);의 특징은 4 개의 개별 타우 해당 집계 속도 론 래그 단계 12.5 ± 0.07 h와 t50 19.8 ± 0.34 h (배치 2); 15.1 ± 0.34 h의 단계와 t50 21.9 ± 0.86 h (일괄 3)의 지연 및 지연 11.5 ± 0.29 h의 단계와 t50 17.8 ± 0.29 h (일괄 4)의 각각. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. 지연 위상 및 t50 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이 보간을 계산 했다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> 그림 5: 미리 형성한 hutau441 집계는 높은 활동 시드. 뿌리기 시작, sonicated 타우 집계 단위체 hutau441에 추가 되었습니다. 빨강에서 파랑, 다른 운동 곡선의 각 색상 추가 된 씨앗의 다른 금액을 나타냅니다: 1.25%, 0.63%, 0.31%, 0.16%, 0.08%, 0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005%와 0.0025% (v/v), 각각. Hutau441의 자발적인 변환 검정으로 표시 됩니다. 모든 조건 quadruplicate에서 테스트 되었습니다. 씨앗의 특정 농도와 관련 된 4 개의 운동 복제 높은 재현성 및 대부분 구별할 수 있습니다. Hutau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 미리 형성 된 sonicated 원 구조의 작은 금액의 추가 초기 지연 위상 자발적인 변환에서 관찰 하 고 효과 씨앗의 양에 비례 합니다. 빨강에서 파랑, t50 관찰 (t50 spont.conv-t50 시드) 점은 18.9, 18.40, 17.8, 17.3, 16.6, 16.1, 15.4, 14.7, 14.2 13.7 시간, 각각. Hutau441의 자발적인 변환은 평균 t50 (SD) 19.85의 특징은 ± 0.54 h. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. t50 은 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이의 보간에 의해 계산 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

생체 외에서 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과

이 원고에 설명 된 타우 집계 분석 결과 vivo에서 타우 misfolding 및 집계의 예상된 기능을 모방 합니다.

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

타우 단백질을 자기 조립에서 쌍이 있는 망막 필라멘트로 잘못 접는 것은 알츠하이머 병 및 기타 타우오병증의 병리학적 특징입니다. 여기서 우리는 타우 병발생 과정을 해명하는 데 도움이 될 수 있는 강력한 타우 응집 분석서를 제시합니다. 변환은 핵 의존성 중합 공정의 모든 단계를 따르며 매우 재현 가능하여 현재까지 OBSI 수준을 충족한 보다 엄격한 형식으로 약물 스크리닝을 허용합니다.시약의 품질은 매우 중요합니다. 재조합 타우는 매우 순수하고 골재와 조각이 없어야합니다. 먼저 컴퓨터와 멀티 모드 마이크로 플레이트 판독기를 켭니다.장비가 안정화될 수 있도록 허용한 후 소프트웨어를 시작하고 표준 프로토콜을 프로토콜 유형으로 선택합니다. 온도를 섭씨 37도로 설정하고 프로토콜을 계속하기 전에 예열을 선택합니다. 다음으로 운동 런타임을 50시간으로 설정하고 측정 간격을 15분으로 설정합니다.연속 모드에서 분당 425 사이클로 궤도 흔들림을 설정합니다. 이에 따라, 형광 강도 의 종점 운동 모모크로미터로 읽기 방법을 선택합니다. 내분 파장을 440 나노미터로 설정하고 방출 파장을 485 나노미터로 설정하고, 광학 위치는 상부로, 80으로 게인한다.일반 읽기 속도를 선택하고 읽기 높이를 4.50밀리미터로 설정합니다. 그런 다음 프로토콜의 유효성을 검사하고 저장합니다. 생성된 프로토콜을 사용하여 실행을 시작합니다.실험의 이름을 지정하고 새로 만든 파일의 대상을 선택하고 계측기를 원하는 온도에 미리 평가할 수 있도록 합니다. 자발적인 재조합 타우 변환 실험을 위해, 1,000 마이크로리터 반응 샘플을 티오플라빈-T 형광을 위한 800 마이크로리터, 1.5 밀리리터 튜브에서 반응 버퍼와 단백질을 먼저 혼합하여 SEC-MALS 분석을 위한 130 마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 헤파린과 티오플라빈-T를 넣고 5번 위아래로 피펫을 하여 잘 섞습니다.높은 재현성을 보장하고 시약을 동일한 순서로 혼합하고 기간 내에 유지하려면 프로토콜을 정확하게 실행하는 것이 중요합니다. 시료를 12, 000 x g 및 섭씨 25도에서 5분간 회전하여 기포를 제거합니다. 원심분리에 따라 96웰 마이크로플레이트에서 잘 반응 시료 200마이크로리터를 분배하여 기포형성을 피한다.그런 다음 증발을 피하기 위해 마이크로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로 플레이트를 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기에 배치합니다. 전체 플레이트를 선택하거나 플레이트가 가득 차 있지 않은 경우 읽을 우물을 선택하고 측정을 시작합니다.데이터를 데이터 처리 소프트웨어로 내보냅니다. 그런 다음 장비에서 마이크로 플레이트를 제거합니다. 다음으로 마이크로 플레이트에서 실러를 제거합니다.응집된 샘플을 두 번 위아래로 파이프팅하여 우물에 혼합하고 1.5 밀리리터 튜브에 서로 다른 복제를 풀로 넣습니다. 각 샘플을 5회 위아래로 파이프팅하여 철저히 섞고, 원자력 현미경으로 골재를 분석하기 위해 공수 표면에 10~20마이크로리터를 분배합니다. 이에 따라 1시간 동안 1.5밀리리터 튜브를 20, 000 x g, 섭씨 4도에서 회전하여 골재를 수확합니다.SEC-MALS의 상체를 분석하여 샘플에 단백조 타우가 없는지 확인하여 골재로 성공적으로 변환되었음을 나타냅니다. 다음으로, 남은 모든 상체를 제거하고 초기 재조합 타우 단백질 농도 및 시료 부피와 함께 나머지 골체를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 라벨을 부착한다. 스냅은 골재를 동결하고 섭씨 80도에서 보관합니다.시드 실험의 경우, 냉동실에서 재조합 타우 응집체를 제거하고 라벨에 표시된 반응 버퍼의 부피를 추가하고 튜브가 실온으로 안정화되도록 합니다. 그런 다음 5~8회 위아래로 피펫팅하여 응집체를 다시 일시 중지합니다. 총 1/8 인치 마이크로 팁을 사용하여 얼음에 200 마이크로리터 골거된 샘플을 초음파 처리하여 1초 의 펄스를 30% 진폭으로 2초 가량 제거합니다.다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에서 단백질과 반응 버퍼를 먼저 혼합하여 800 마이크로리터 반응 샘플을 준비한다. 그런 다음 헤파린과 티오플라빈-T를 넣고 5번 위아래로 피펫을 하여 잘 섞습니다. 시료를 12, 000 x g 및 섭씨 25도에서 5분간 회전하여 기포를 제거합니다.원심분리에 따라, 기포의 형성을 피하고, 96웰 마이크로 플레이트에서 잘 당 반응 샘플의 198 마이크로리터를 분배. 미리 형성된 피브랄 샘플을 세 번 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다. 각 우물에 원하는 씨앗 비율에 해당하는 양을 추가하고 세 번 위아래로 파이펫을 하여 혼합합니다.그런 다음 증발을 피하기 위해 마이크로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로 플레이트를 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기에 놓고 측정을 시작합니다. 실험이 완료되면 장비에서 마이크로 플레이트를 제거합니다.그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. C291A 및 C322A 돌연변이및 n 단자 c 단자가 함유하는 재조합 타우는 SDS 페이지에 시각화된 바와 같이 매우 순수하며 SEC-MALS가 평가한 거의 100% 단백성입니다. 헤파린 유도 재조합 타우 응집은 440 나노미터의 내분 파장 과 485 나노미터의 방출 파장을 사용하여 티오플라빈-T 형광을 따랐다.분석은 10 개의 개별 우물에서 나온 결과와 거의 구별 할 수없는 것으로 매우 재현 할 수 있습니다. 재조합 타우 골재는 보고된 전 생체 내 형태와 유사한 서로 다른 길이의 피질적 구조의 균일한 혼합물이다. 최종 반응 혼합물은 단조를 포함하지 않으며 SEC-MALS 측정에 의해 표시된 바와 같이 골재로의 전체 변환을 제안합니다.독립적 인 실험 실행에서 재조합 타우 응집의 운동은 유사한 시그모이드 곡선과 구별 할 수없는 지연 및 성장 단계에 의해 강조와 유사합니다. 단백질의 다른 배치가 사용될 때 재현성의 높은 수준은 유지됩니다. 사전 형성된 재조합 타우 골재는 타우 단량체 를 모집하고 드 노보 타우 골재의 형성을 유도하는 데 효율적이며, 공정의 효율성은 종자의 비율과 직접적으로 비례한다.부피로 발현된 타우 응집체의 0.0025%의 양은 재조합 타우 핵을 우회하고 드 노보 피브랄 생성을 유발할 수 있다. 현재 분석은 타우의 생체 내 잘못된 접기 및 집계로 여겨지는 것을 모방하고 병인 과정에 빛을 비추고 약물의 다른 단계를 가진 약물 후보의 간섭을 연구하기위한 귀중한 도구를 구성 할 수있는 기계론적 연구를 가능하게합니다. 분석의 높은 재현성은 과학자들이 실험실에서 상대적으로 쉽게 구현 할 수 있습니다.현재 분석은 가장 긴 타우 동소형태인 인간 타우-441에만 초점을 맞추고 있지만, 응용 프로그램은 다른 타우 변종을 연구하도록 조정할 수 있다. 그리고 잊지 마세요, 올바른 단백질 시약을 선택하고 높은 품질의 표준에서 생산하는 것은 강력하고 매우 재현 가능한 분석체를 설정하는 데 필수적이다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

연구

신경과학

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

공부 Varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 Microbiomechanical 시스템

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...