Name: in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Hector Quirante for uttrykk og rensing av huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen utmerket kundestøtte og Martin Koldijk for dataanalyse.

1. forberedelse av reagenser
<ol><li>
Reaksjon buffer
	<ol>
<li>Forberede reaksjon buffer: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6,7 av oppløsning TCEP pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock-løsningen pH 7.4. Merk: Det skyldes tilstedeværelse av TCEP under bygge bro aggregering studier med wild type tau protein som inneholder cysteinene. I den gjeldende protokollen, TCEP brukes bare til å justere pH i PBS fra 7,4 til 6,7 og spiller ingen annen rolle i å regulere alle redoksreaksjoner.</li>
		<li>Bland godt og filtrere løsningen gjennom et sterilt 0.22 μm pore størrelse PES membran filter.</li>
		<li>Aliquot og butikk på-80 grader.</li>
		<li>Tine på benken og stabilisere seg på RT før bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Fjern huTau441 (for protein uttrykk og rensing se Apetri et al. 24) fra-80 grader fryseren.</li>
		<li>Tine på benken og equilibrate til romtemperatur (RT).</li>
		<li>Spinne rør med protein lager for 5 min på 12.000 x g ved 20-25 grader å fjerne luftbobler.</li>
		<li>Måle konsentrasjonen av huTau441by absorpsjon på 280 nm bruker en utryddelse koeffisient av 0.31 mL mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thioflavin T
	<ol>
<li>Klargjør 500 μM thioflavin T (ThT) lagerløsning ved oppløsning 10 mg av ThT pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaksjon buffer.</li>
		<li>Bland godt, vortex 3 ganger på 20 sekunder med maksimal hastighet og filtrere løsningen gjennom et sterilt 0.22 μm pore størrelse PES membran filter.</li>
		<li>Bestemme konsentrasjonen av absorpsjon målinger på 411 nm bruker en utryddelse koeffisient 22.000 M-1 cm-1 og justere ThT konsentrasjon til 500 μM. Lagre på RT beskyttet mot lyset. Forberede fersk hver 2 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin
	<ol>
<li>Forberede frisk 55 μM heparin-oppløsningen av oppløsende 1 mg av HMW heparin pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaksjon buffer på RT.</li>
		<li>Rist kraftig og vortex 2 ganger i 5 sekunder.</li>
		<li>Filtrere løsning gjennom et sterilt 0,20 μm pore størrelse PES membran filter (sprøyte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kontinuerlig ThT aggregering analysen på en multi-modus Microplate leser
Merk: ThT fargestoff legges til reaksjonen å overvåke huTau441 aggregering kinetics i en kontinuerlig (automatisk mål). Selv om reaksjonen kan bli etterfulgt av en vanlig fluorometer ved hjelp av konvensjonelle søppel, operasjonenes manuelle natur operasjonen begrenser frekvensen av målinger og kompromisser nøyaktigheten av innspilte kinetic kurvene. Derfor brukes en automatisk Multi-mode microplate leser.
<ol><li>
Instrumentet satt opp
	<ol>
<li>Slå på datamaskinen og multi-modus microplate leseren. La utstyret stabilisere i 10 minutter.</li>
		<li>Start programvaren og forberede en protokoll.<ol>
<li>Velg protokollen: standard-protokollen (Data reduksjon utføres uavhengig for hver plate).</li>
			<li>Still inn temperaturen på 37 grader, og velg preheatment før du fortsetter protokollen.</li>
			<li>Angi kinetic Kjør: kjøretid 50 h / måling intervall: 15 min.</li>
			<li>Angi orbital rister på 425 cpm (3 mm) i kontinuerlig modus.</li>
			<li>Velg metoden Les: fluorescens intensitet endepunktet/Kinetic - Monochromators bølgelengder: eksitasjon 440 nm (20 nm båndbredde) / utslipp 485 nm (20 nm båndbredde) - optikk plasser: topp - Normal lese hastighet - lese høyde: 4.50 mm</li>
			<li>Start Kjør bruker opprettet protokollen. Navnet eksperimentet, Velg målet for den nyopprettede filen og at maskinen skal pre equilibrate til ønsket temperatur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spontan huTau441 konvertering
	<ol>
<li>Forberede reaksjon eksemplet i en 1,5 mL tube. Bruk 200 μL blanding per reaksjon og minst 4 replikat (reaksjon volumet for 4 replikerer = 800 μL).</li>
		<li>Forberede 800 μL reaksjon utvalg (ved 4 gjentak) som inneholder 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved å blande protein med reaksjon bufferen, Legg heparin og ThT og bland godt pipettering opp og ned 5 ganger. Respekter den angitte rekkefølgen for reagens tillegg.</li>
		<li>Spinne eksempler på 12.000 x g og 25 grader i 5 min å fjerne luftbobler.</li>
		<li>Dispensere 200 μL av reaksjon vareprøve per brønn i 96-brønnen microplates (96-brønns svart heldekkende microplate, godt volum 360 μL, flat bunn). Unngå luftbobler.</li>
		<li>Forsegle microplate å unngå fordampning.</li>
		<li>Plasser microplate i Multi-mode microplate leser og starte målinger.</li>
		<li>Etter ferdigstillelse av eksperimentet, Fjern plate fra utstyr og eksportere data til en databehandlingen programvare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvalitetskontroll av konvertering, frø innsamling og lagring.
	<ol>
<li>Fjern sealer fra platen og basseng i forskjellige replikat i 1,5 mL rør. Bland godt aggregert prøven i brønnene av pipettering opp og ned 2 ganger før å samle. Aggregater tendens til å sette på bunnen av brønnen.</li>
		<li>Mix grundig i 1,5 mL tube av pipettering opp og ned 5 ganger og dispensere 10-20 μL på glimmer underlag for å analysere aggregater av AFM (for mer informasjon se Apetri et al. 24).</li>
		<li>Høste aggregatene ved å spinne 1,5 mL røret i 20.000 x g og 4 grader i 1 time. Aggregater danner pellets.</li>
		<li>Separate og analysere nedbryting av S-MALS å bekrefte fravær av monomerisk tau i utvalget som indikerer en vellykket konvertering i aggregat (for ytterligere detaljer se Apetri et al. 24).</li>
		<li>Etiketten 1,5 mL røret som inneholder de resterende aggregatene (pellet) første huTau441 protein konsentrasjon og prøve volum. Fest fryse Aggregatene og lagre på-80 grader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seeded reaksjon
	<ol>
<li>Fjern huTau441 aggregater fra-80 grader fryser. Legg volumet av reaksjon buffer angitt på etiketten (første eksempel volum) og la røret stabilisere til RT. Resuspend aggregatene av pipettering opp og ned 5 til 8 ganger.</li>
		<li>Sonicate samlede utvalget. For en 200 μL prøve (15 μM huTau441), sonicate på isen ved hjelp av en 1/8â€ microtip (fra 100 μL opptil 10 mL) for en perioden 15 s med pulser av 1 s og pauser av 2 s på 30% amplituden (sonicator 250 watt). Nytt equilibrate prøve å RT. Merk: De næringsdrivende sonication forholdene føre til en homogen befolkning på tau fibrils med lengder av 20-50 nm24.</li>
		<li>Forberede reaksjon prøven i 1,5 mL rør. Bruk 200 μL blanding per reaksjon og minst 4 replikat (reaksjon volumet for 4 replikerer = 800 μL).</li>
		<li>Forberede 800 μL reaksjon utvalg som inneholder 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved å blande protein med reaksjon bufferen, Legg heparin og ThT og bland godt pipettering opp og ned 5 ganger. Respekter den angitte rekkefølgen for reagens tillegg.</li>
		<li>Spinne eksempler på 12.000 x g og 25 grader i 5 min å fjerne luftbobler.</li>
		<li>Dispensere 200 μL av reaksjon vareprøve per brønn i 96-brønnen (96-brønns svart heldekkende microplate, godt volum 360 μL, flat bunn). Unngå luftbobler.</li>
		<li>Homogenize grundig preformed fibril prøven ved repeterende opp og ned pipettering (5 ganger) og legge til hvert godt beløpet tilsvarer ønsket prosentverdi av frø. For en 200 μL godt totalt volum er 2 μL preformed frø tillegg en 1% (v/v). Blanding av pipettering opp og ned 3 ganger når du legger til brønnen og unngå luftbobler.</li>
		<li>Forsegle microplate å unngå fordampning.</li>
		<li>Plasser microplate i Multi-mode microplate leser og starte målinger.</li>
		<li>Fjern plate fra utstyr og eksportere data til et regneark.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+tauopathies.">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li><li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease:+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau.">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li><li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains.">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li><li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer's+disease.">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li><li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A68:+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau.">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li><li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer's+disease.">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li><li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies.">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li><li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro.">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li><li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation.">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li><li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231.">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li><li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation.">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).</li><li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers:+Insight+from+studies+in+vitro.">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li><li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li><li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans.">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li><li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li><li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li><li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments.">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li><li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution.">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer's+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein.">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li><li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer's+disease+and+the+tauopathies.">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li><li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein:+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation.">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li><li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy,+corticobasal+degeneration,+FTDP-17+and+Pick's+disease.">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Til tross for utallige forsøk, tau aggregering kinetics rapportert i litteraturen dato mangel ønsket nivået av reproduserbarhet og/eller noen av funksjonene i nucleation avhengige polymerisasjon19,20,21 , 22 , 23 , 25. Dette er ofte understreket av mangel på et lag fase, ineffektiv såing og ikke-fibrillar natur tau aggregat. Årsaken til disse manglene kan variere og inkluderer sub-optimal tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelse av aggregater, lav renhet, osv.), valg av protein og inducing reagenser og eksperimentelle forhold. En kompliserende faktor er to cystein rester ligger rundt tau aggregering grensesnittet som kan danne intra - eller inter - molekylær disulfide broer avhengig av redoks miljø og påvirke effektiviteten av tau aggregering. I de fleste tilnærminger redusere reagenser som DTT eller TCEP har blitt brukt til å opprettholde cystein rester i redusert former og dermed øke nivåer av reproduserbarhet25. Videre er utryddelse koeffisient tau svært lav som fører til problemer i nøyaktige målinger av protein konsentrasjon.
Vi fokuserer spesielt på noen parametere og kvalitet attributter som vi anses avgjørende for en robust, reproduserbare og representant aggregering profil for tau protein: eliminerer muligheten for intra - og inter-molekylær disulfide formasjon, generere en svært ren tau monomer og forbedre nøyaktigheten av konsentrasjon besluttsomhet. Alle disse reagens knyttet spørsmål oppmerksomhet steder som vi som kritisk for optimal analysen utvikling. For å løse disse problemene, ble full lengde huTau441 uttrykt med to mutasjoner, C291A og C322A, og med N - og C-terminalen koder. Mutasjon av cystein rester har minimal innvirkning på tau protein mens de eliminerer den ellers veldig vanskelig å kontrollere disulfide broer. Uttrykke protein med relativt kort N - og C-terminalen koder tillot oss å forfølge en totrinns affinitet rensing protokoll som førte til høy renhet, integritet og monomer innhold. Videre har innført vi en F8W mutasjon som økt utryddelse koeffisient av protein og tillot mye mer nøyaktig konsentrasjon målinger24.
I tillegg til høy-kvalitet protein reagenser, var uteffekt analysen også optimalisert. Den optimale tau: heparin forholdet ble identifisert for å være rundt 0,5 (M/M) som er i tråd med tidligere publiserte undersøkelser26. Videre er mekanisk og optisk instrumental innstillinger avgjørende å sikre reproduserbarhet og optimale parametere avvike i noen grad avhengig av produsenten.
Aggregering av tau beskrevet i denne analysen viser egenskapene som er knyttet til tau patogenesen i AD og relaterte tauopathies. Prosessen starter med en første lag fase tilsvarer dannelsen av høy energi kjerner og etterfølges av en rask vekstfase som svarer til fibril vekst. Forsinkelse er tilstrekkelig lang til å åpne en bred vindu for å studere i detalj seeding prosessen som dekker et bredt spekter av frø konsentrasjoner (figur 5) mens fortsatt ikke for lenge så protein fornedrelse og/eller ikke-spesifikk aggregering unngås (figur 2). Disse sekundære hendelsene kan spesielt skje når en bunn uordnede protein som huTau441 blir utsatt for lange perioder fysiologiske forhold. Innhentet tau aggregater skjermen morfologi av PHFs isolert fra hjernen til AD pasienter og er svært effektiv i å rekruttere monomerisk tau og konvertere den til de novo generert aggregat, en prosess som frø. Analysen er svært reproduserbare, kinetisk kurvene blir nesten utvisket mellom brønner, eksperimentelle kjører og protein bunker. Selv om gjeldende analysen fokuserer bare på den lengste tau isoformen, huTau441, programmet kan tilpasses for å studere konvertering av andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikasjon, i trykk) videre kan mekanistisk studier fokuserte på samspillet mellom tau isoformene og muligens kaste lys over forskjellene mellom tau patogenesen i AD hvor både 3R og 4R isoformene er i PHFs og PICK sykdom eller Frontotemporal demens der tau patologi inneholder hovedsakelig 3r og 4R tau isoformene, henholdsvis27.
Den svært høy reproduserbarhet til analysen bør tillate leserne å iverksette den med relativ letthet i bestemte lab innstillingene. Analysen etterligner det som antas å være i vivo misfolding og aggregering av tau, aktivere mekanistisk studier som vil kaste lys over tau patogenesen og det er et verdifullt verktøy for screening narkotika kandidater og vurdere deres forstyrrelser med de ulike trinnene i patogenesen prosessen.

Alzheimers sykdom er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse histopathologically definert av akkumulering av ekstracellulære senil plaketter av aggregert Amyloid beta1 og intracellulær neurofibrillary ledninger som inneholder samlet hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomerisk og presentert som seks unike isoformene som inneholder 0-2 N terminal INSERT og 3 eller 4 microtubule binding domener3,4 som følge av alternativ skjøting og et gjennomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det antas at hyperphosphorylation, misfolding og selv samling i fibrillary strukturer utgjør de viktigste elementene i tau patogenesen, som pathologically vurdert i demente enkeltpersoner5,6.
De aggregerte neurofibrillary tau floker er et kjennetegn ikke bare for Annonsen, men også for andre tauopathies, inkludert frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD), Pick sykdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporal demens (FTD) og primær Age-relaterte tauopathy (del)2. Fra en biokjemiske synspunkt, forstå mekanismen av tau misfolding og aggregering kunne kaste lys over patologisk prosesser knyttet til Annonsen og andre tauopathies. Det vitenskapelige aspektet er robust i vitro aggregering analyser verdifulle verktøy for screening av narkotika kandidater7,8,9,10. Det antas at aggregering av tau følger en nucleation avhengige polymerisasjon prosessen (NDP)11,12,13,14. NDP kinetics er sigmoidal og starter med en energisk ugunstige nucleation trinn etterfulgt av en rask energisk nedoverbakke aggregering prosess.
I motsetning til andre amyloidogenic proteiner, inkludert prion protein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og selv ekstreme pHs eller høye temperaturer er ikke-bidro samling15. Dette skyldes sannsynligvis hydrophylic vekselsvirkningene i tau aggregering grensesnittet. Imidlertid samler tau effektivt i fysiologiske konsentrasjoner Når indusere som heparin16 eller17,18 andre polyanions brukes.
Tidligere innsats å sette opp i vitro tau aggregering analyser har kaste lys på detaljene i tau misfolding og aggregering, men de kom kort av etterligne hva antas å være i vivo tau aggregering kinetics. I de fleste tilfeller manglet tau aggregering kinetics den første lag fasen knyttet tau nucleation. Dette kan ha vært konsekvensen av å bruke svært høy tau protein konsentrasjoner, tilstedeværelse av aggregater i Start tau protein forberedelsene og/eller bruk av tau med mye høyere aggregering tilbøyelighet enn den mer fysiologiske full lengde tau protein19,20,21,22,23. Videre opp tidligere studier ikke reproduserbarhet og robusthet del av tau aggregering kinetics.
Her beskriver vi en robust i vitro tau aggregering analysen som etterligner hovedegenskapene for en nucleation avhengige polymerisasjon med en første lag fase tilsvarer tau nucleation etterfulgt av en eksponentiell vekstfase. Videre genererte rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høy seeding styrke. Analysen er svært reproduserbar mellom tau grupper og representerer et verdifullt verktøy til skjermen for aggregering hemmere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1240px;" width="1239">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:353px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">T3516-5G</td>
			<td style="width:308px;">dry powder (Mw = 318.86 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td>dry powder (Mw = 17-19 kDa)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259-1G</td>
			<td>dry powder (MW= 286.65 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Sterile, pH 7.4 (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.20 &#956;m sterile serynge filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431229</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-well microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9502867</td>
			<td>Black, flat botton</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microplate sealers&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>Adhesive strips&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td>Hybrid Technology, Gen5 Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>1,5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonics-Branson SFX250</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-966R</td>
			<td>1/2&#34; Solid Horn and 1/8&#34; microtip&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening

Samling av tau protein og dannelse av sammenkoblede spiralformede filamenter er et kjennetegn på Alzheimers sykdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner tilknyttet nevrodegenerative sykdommer, aggregering rapportert i vitro kinetics for tau protein er mindre konsekvente presenterer en relativt høy variasjon. Her beskrive vi utviklingen av i vitro aggregering analysen som etterligner forventet trinnene knyttet tau misfolding og aggregering i vivo. Analysen bruker de lengste tau isoformen (huTau441) som inneholder både N-terminal surt setter samt fire microtubule binding domener (MBD). I vitro aggregasjonen er utløst av tillegg av heparin og kontinuerlig etterfulgt av thioflavin T fluorescens i 96 godt microplate format. Tau aggregering analysen er svært reproduserbar mellom forskjellige brønner, eksperimentelle kjører og grupper av protein. Aggregering fører til tau PHF-lignende morfologi som er svært effektiv i seeding dannelsen av de novo fibrillar strukturer. I tillegg til sin søknad i å studere mekanismen av tau misfolding og aggregering, er gjeldende analysen et kraftig verktøy for screening legemidler som kan forstyrre patogenesen av tau.

Rekombinant huTau441 som inneholder C291A og C322A mutasjoner og N-terminal hans og C-terminalen C-koder ble uttrykt og renset som tidligere beskrevet24. Kladdene som huTau441 er svært ren som visualisert på SDS-side og nesten 100% monomerisk som vurdert av S-MALS (figur 1). Aggregering av 15 µM huTau441 ble indusert ved tilsetning av 8 µM HMW heparin og reaksjonen var kontinuerlig etterfulgt i ThT fluorescens likner en multimode microplate. Eksitasjon bølgelengden var 440 nm (båndbredden 20 nm) mens utslipp ble målt på 485 nm (båndbredden 20 nm). Analysen er svært reproduserbare, med resultater fra 10 individuelle brønner er nesten utvisket (figur 2A). Morphologies av ThT positiv huTau441 aggregater ble vurdert etter 50 h av AFM. Aggregert hutau441 er en homogen blanding av fibrillar strukturer i ulike lengder ligner rapporterte ex vivo morphologies (figur 2B). Videre inneholder ikke endelige reaksjonsblandingen monomer, foreslå en full konvertering i aggregat som vist av S-MALS målinger (figur 2C). The kinetics av huTau441 samling i uavhengige eksperimentelle kjører er svært lik som understreket av lignende sigmoidal kurver og skille lag og vekst faser (Figur 3). Høy reproduserbarhet opprettholdes når forskjellige bunker protein brukes (Figur 4). Videre er preformed huTau441 aggregater svært effektiv i å rekruttere tau monomer og indusere dannelsen av de novo tau aggregat. Beløpene så lavt som 0.0025% (v/v) av preformed tau aggregater er i stand til å omkjøringsvei nucleation og utløser generasjon av de novo fibrils (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figur 1: rekombinant huTau441 er monomerisk og svært ren. A) renhet vurdering under denaturing betingelser på en 4-12% SDS side gel inkludert molekylvekt standard protein stigen (i kDA) (Lane 1); strømme gjennom fra siste C-tag affinitet rensing trinn (Lane 2); kolonnen vask brøkdel (Lane 3), elut huTau441 protein topp, før (Lane 4), og etter buffer utveksling (Lane 5), henholdsvis). B) S-MALS analyse av huTau441. Protein viser til > 99,9% monomerisk med molar masse 51 kDa og inneholder ikke mengder eller fragmenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figur 2: samling av rekombinant huTau441 svært reproduserbare og fører kvantitativt fibrillar strukturer. A) kinetics av heparin indusert huTau441 aggregering overvåkes kontinuerlig i 96 godt microplate format av ThT fluorescens. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. 10 personlige kurvene tilsvarer konvertering av samme protein batch i ti brønner i den samme microplate og er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase av 14.2 ± 0.38 h og t50 18.8 ± 0.40 h. Kinetic data var utstyrt med en 5-parameteren logisti c kurven med lineær nedgang i den øvre asymptoten. Lag fase og t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. Kurven passer og Sammendrag er oppnådd ved hjelp av IBM SPSS statistikk versjon 20.0.0.2. B). Tau aggregater Vis PHF-lignende morphologies som angitt av AFM bildebehandling på 50 h; C). S-MALS analyse av monomerisk huTau441 (t = 0 h) og nedbryting reaksjonsblandingen reaksjonen er ferdig (t = 50 h). På 50 h tidspunktet var reaksjonsblandingen sentrifugeres 1t på 20.000 X g og 4 grader og resulterte nedbryting injisert på S-MALS. Forsvinningen av monomer toppen bekrefter komplett aggregering av tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figur 3: tau aggregering analysen viser høy reproduserbarhet mellom uavhengige eksperimentelle kjøres. De to panelene viser fire individuelle kinetics spor på spontan huTau441 aggregering samlet i to uavhengige eksperimenter ved hjelp av samme gruppe av huTau441 protein. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Kinetics er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase 12.2 ± 0,18 h og t50 gjennomsnitt 17,8 ± 0,8 h (kjøre 1) og 11,6 ± 0,52 h og t50 i gjennomsnitt 17,8 ± 0,23 h (kjøre 2), henholdsvis. Kinetisk data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. T50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figur 4: tau aggregering analysen viser høy reproduserbarhet mellom forskjellige bunker huTau441 protein. Hvert panel viser fire replikerer tilsvarer en bestemt huTau441 gruppe. Aggregering av hver gruppe ble etterfulgt i uavhengige eksperimenter. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Aggregering kinetics tilsvarer de fire individuelle tau grupper er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase av 15.3 ± 0.38 h og t50 21,1 + 0,46 h (Batch 1); Lag fase av 12.5 ± 0,07 h og t50 av 19,8 ± 0.34 h (Batch 2); Lag fase av 15,1 ± 0.34 h og t50 21.9 + 0,86 h (Batch 3) og lag phase 11,5 + 0.29 h og t50 i gjennomsnitt 17,8 ± 0.29 h (Batch 4), henholdsvis. Kinetisk data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. Lag fase og t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figur 5: Preformed hutau441 aggregater har høy seeding aktivitet. For å starte frø, ble sonicated tau aggregater lagt til monomer hutau441. Fra rød til blå, hver farge av ulike kinetic kurver representerer ulike mengden ekstra frø: 1,25%, 0,63%, 0.31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0.02%, 0,01%, 0.005% og 0.0025% (v/v), henholdsvis. Spontan konvertering av hutau441 er representert i svart. Alle ble testet i quadruplicate. De fire kinetic gjentak forbundet med en viss konsentrasjon av frø er svært reproduserbare og i de fleste tilfeller utvisket. Konsentrasjoner av hutau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Tillegg av små mengder av pre-formet sonicated fibrillar strukturer eliminerer den første lag fasen i spontan konvertering og effekten er proporsjonal med antall frø. Fra rød til blå, er forskjellen i t50 observert (t50 spont.conv-t50 såing) 18,9, 18.40, gjennomsnitt 17,8, 17.3, 16,6, 16,1, 15,4, 14,7, 14,2 og 13,7 timer, henholdsvis. Spontan konvertering av hutau441 er preget av en gjennomsnittlig t-50 (med SD) av 19.85 ± 0.54 h. Kinetic data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analysen for å studere aggregering av Tau Protein og narkotikarelaterte Screening

Tau aggregering analysen beskrevet i dette manuskriptet etterligner etterlengtede funksjonene i vivo tau misfolding og aggregering.

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Feilfolding av Tau protein i sin selvmontering i sammenkobling spiralformede filamenter er et patologisk kjennetegn på Alzheimers sykdom og andre Tauopatier. Her presenterer vi en robust Tau aggregeringsanalyse som kan bidra til å belyse Tau patogeneseprosessen. Konverteringen følger alle trinnene i en kjerneavhengig polymeriseringsprosess og er svært reproduserbar, slik at narkotikascreening i et strengere format som oppfylte OBSI-nivå til dags dato.Kvaliteten på reagenser er avgjørende. Den rekombinante Tau må være svært ren og blottet for aggregater og fragmenter. Slå først på datamaskinen og multimodemikroplateleseren.Når utstyret er tillatt å stabilisere seg, starter du programvaren og velger Standardprotokoll som protokolltype. Sett temperaturen til 37 grader Celsius og velg Forvarm før du fortsetter protokollen. Deretter angir du kinetisk kjøretid til 50 timer og måleintervallet til 15 minutter.Sett orbital risting til 425 sykluser per minutt i kontinuerlig modus. Etter dette velger du lesemetoden som fluorescensintensitets endepunkt kinetiske momochromators. Sett eksitasjonsbølgelengden til 440 nanometer og utslippsbølgelengden til 485 nanometer, optikkposisjonen til toppen, og gevinsten til 80.Velg normal lesehastighet og sett lesehøyden til 4,50 millimeter. Deretter validerer og lagrer protokollen. Start kjøringen ved hjelp av den opprettede protokollen.Gi eksperimentet et navn, velg destinasjonen for den nyopprettede filen, og la instrumentet forhåndslikevekt til ønsket temperatur. For et spontant rekombinant Tau konverteringseksperiment, lag en 1000 mikroliter reaksjonsprøve med 800 mikroliter for tioflavin-T fluorescens og 130 mikroliter for SEC-MALS-analyse ved først å blande proteinet med reaksjonsbufferen i et 1,5 milliliter rør. Tilsett deretter heparin og thioflavin-T og bland godt ved å pipering opp og ned fem ganger.Det er viktig å utføre protokollen nøyaktig for å sikre høy reproduserbarhet, blande reagenser i samme rekkefølge og holde seg innenfor tidsrammer. Spinn prøven på 12, 000 x g og 25 grader Celsius i fem minutter for å eliminere luftbobler. Etter sentrifugering dispenserer 200 mikroliter reaksjonsprøve per brønn i en 96-brønns mikroplate, og unngår dannelse av luftbobler.Tet deretter mikroplaten for å unngå fordampning. Plasser mikroplaten i en mikroplateleser med flere moduser. Velg full plate, eller hvis platen ikke er full, velg brønnene som skal leses, og start målingen.Eksporter dataene til databehandlingsprogramvare. Fjern deretter mikroplaten fra utstyret. Deretter fjerner du tetningsforseglingen fra mikroplaten.Bland den aggregerte prøven i brønnene ved å pipe opp og ned to ganger, og samle de forskjellige replikere i 1,5 milliliter rør. Bland hver prøve grundig ved å pipetter opp og ned fem ganger, og dispenser 10 til 20 mikroliter på en glimmeroverflate for å analysere aggregatene ved atomkraftmikroskopi. Etter dette høster aggregatene ved å spinne hver enkelt 1,5 milliliter rør ved 20, 000 x g og 4 grader Celsius i en time.Analyser det overnaturlige av SEC-MALS for å bekrefte fraværet av monomerisk Tau i prøven, noe som indikerer en vellykket konvertering til aggregater. Deretter fjerner du alle gjenværende supernatante og merker 1,5 milliliter røret som inneholder de resterende aggregatene med den første rekombinante Tau-proteinkonsentrasjonen og prøvevolumet. Snap fryse aggregatene og lagre på 80 grader Celsius.For et seeded eksperiment, fjern rekombinante Tau-aggregater fra fryseren, legg til volumet av reaksjonsbuffer som er angitt på etiketten, og la røret stabilisere seg til romtemperatur. Deretter gjenbruker aggregatene ved å pipettere opp og ned fem til åtte ganger. Sonicate 200 mikroliter aggregert prøve på is ved hjelp av en 1/8 tommers mikrotupp for en total periode på 15 sekunder med pulser på ett sekund på og to sekunder av ved 30 prosent amplitude.Deretter forbereder du en reaksjonsprøve på 800 mikroliter ved først å blande proteinet med reaksjonsbufferen i et 1,5 milliliter rør. Tilsett deretter heparin og thioflavin-T og bland godt ved å pipering opp og ned fem ganger. Spinn prøvene på 12, 000 x g og 25 grader Celsius i fem minutter for å eliminere luftbobler.Etter sentrifugering dispenserer du 198 mikroliter reaksjonsprøve per brønn i en 96-brønns mikroplate, og unngår dannelse av luftbobler. Homogeniser den forhåndsformede fibralprøven ved å pipering opp og ned tre ganger. Tilsett mengden som tilsvarer ønsket prosentandel av frø til hver brønn og bland ved å pipetter opp og ned tre ganger.Tet deretter mikroplaten for å unngå fordampning. Plasser mikroplaten i mikroplateleseren med flere moduser og start målingen. Når eksperimentet er fullført, fjerner du mikroplaten fra utstyret.Deretter eksporterer du dataene til et regneark. Rekombinant Tau som inneholder C291A- og C322A-mutasjonene og n-terminalen hans og c terminal c-kodene er svært rene som visualisert på SDS-siden og nesten 100 prosent monomeric som vurdert av SEC-MALS. Heparinindusert rekombinant Tau aggregering ble etterfulgt av thioflavin-T fluorescens ved hjelp av en eksitasjon bølgelengde på 440 nanometer og en utslipp bølgelengde på 485 nanometer.Analysen er svært reproduserbar med resultater fra 10 individuelle brønner som er praktisk talt umulig å skille. De rekombinante Tau aggregater er en homogen blanding av fibular strukturer av forskjellige lengder, ligner på rapporterte ex-vivo morfologier. Den endelige reaksjonsblandingen inneholder ikke monomer, noe som tyder på en full konvertering til aggregater, som vist ved SEC-MALS-målinger.Kinetikken til rekombinant Tau aggregering i uavhengige eksperimentelle løp er lik, som understreket av lignende sigmoidale kurver og umulig å skille lag og vekstfaser. Det høye nivået av reproduserbarhet opprettholdes når forskjellige porter protein brukes. Forhåndsdannede rekombinante Tau aggregater er effektive i å rekruttere Tau monomer og indusere dannelse av de novo Tau aggregater, og effektiviteten av prosessen er direkte proporsjonal med prosentandelen av frø.Mengder så lave som 0,0025 prosent av forhåndsdannede Tau-aggregater uttrykt i volum er i stand til å omgå rekombinant Tau-kjerner og utløse de novo fibralgenerasjon. Den nåværende analysen etterligner det som antas å være in vivo-feilfolding og aggregering av Tau og muliggjør mekanistiske studier som kan kaste lys over patogeneseprosessen og utgjør et verdifullt verktøy for narkotikascreening og studier av interferens av narkotikakandidater med ulike stadier av prosessen. Den høye reproduserbarheten av analysen vil tillate forskere å implementere det med relativ letthet i laboratoriet.Selv om den nåværende analysen fokuserer bare på den lengste Tau isoform, menneskelig Tau-441, kan søknaden tilpasses for å studere forskjellige Tau-varianter. Og ikke glem, velge de riktige protein reagenser og produsere dem på høye kvalitetsstandarder er avgjørende for å sette opp en robust og svært reproduserbar analyse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

En prosedyre for Implanting Organiserte Arrays av Microwires for Single-unit Recordings i Awake, Oppfører Dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhinnen Micropocket analysen: En modell av Angiogenese i Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerve Forberedelse til Studerer avfyring egenskaper Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyte coculture analyse: En<em&gt; In Vitro</em&gt; Oppsett for detaljert undersøkelse av Neuron-gliaceller interaksjoner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live bilder av GLUT4 Protein menneskehandel musen primære hypothalamus nevroner bruker Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Analysen utvikling for høy innhold kvantifisering av Sod1 Mutant Protein samlet formasjon i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Et Microbiomechanical System for å studere Varicosity formasjon og utvinning i sentrale Nevron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ Autoradiographic metode for fastsettelse av regionale priser på cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cellebasert analysen å studere antistoff-mediert Tau godkjennes av Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...