Name: in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

Författarna vill tacka Hector Quirante för uttryck och rening av huTau441, Hanna Inganäs och Margot van Winsen för utmärkt teknisk support och Martin Koldijk för dataanalys.

1. REAGENSBEREDNING
<ol><li>
Reaktion buffert
	<ol>
<li>Förbereda reaktion buffert: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6,7 genom upplösning TCEP torrt pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock lösning, pH 7,4. Obs: Förekomsten av TCEP är på grund av överbrygga aggregering studier med vildtyp tau-protein som innehåller cysteines. I det nuvarande protokollet, TCEP endast används för att justera pH PBS från 7,4 till 6,7 och spelar ingen roll i regleringen någon redoxreaktioner.</li>
		<li>Blanda och filtrera lösningen genom ett membranfilter för sterila 0,22 μm porstorlek storlek PES.</li>
		<li>Delprov och store vid-80 ˚C.</li>
		<li>Tina på bänken och stabilisera på RT före användning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Ta bort huTau441 (för protein uttryck och rening se Apetri o.a. 24) från-80 ° c frys.</li>
		<li>Tina på bänken och temperera vid rumstemperatur (RT).</li>
		<li>Snurra röret med protein lager för 5 min vid 12 000 x g vid 20-25 ˚C att eliminera luftbubblor.</li>
		<li>Mätning av koncentrationen av huTau441by absorption vid 280 nm med en extinktionskoefficient 0,31 mL mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tioflavin T
	<ol>
<li>Förbereda 500 μM Tioflavin T (ThT) stamlösning av upplösning 10 mg av ThT torrt pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaktion buffert.</li>
		<li>Blanda omsorgsfullt, vortex 3 gånger i 20 sekunder vid maximal hastighet och filtrera lösningen genom ett sterilt 0,22 μm porstorlek storlek PES membranfilter.</li>
		<li>Bestämma koncentrationen av absorption mätningar på 411 nm med en extinktionskoefficient 22.000 M-1 cm-1 och justera ThT koncentration till 500 μm. Butik på RT skyddas från ljus. Förbereda färska varannan månad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparin
	<ol>
<li>Förbereda färska 55 μM heparin lösning genom upplösning 1 mg av HMW heparin torrt pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaktion buffert på RT.</li>
		<li>Skaka kraftigt och vortex 2 gånger i 5 sekunder.</li>
		<li>Filtrera lösningen genom ett sterilt 0,20 μm porstorlek storlek PES membranfilter (spruta).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kontinuerligt läge ThT Aggregation test på en multi-mode Microplate Reader
Obs: ThT färgämne tillsätts reaktionen att övervaka huTau441 aggregation kinetics i ett kontinuerligt läge (automatiska mätningar). Även om reaktionen kan följas av en regelbunden fluorometer med en konventionell kyvetten, operationen manuell karaktär begränsar frekvensen av mätningar och äventyrar riktigheten av inspelade kinetiska kurvorna. Av den anledningen används en automatisk multi-mode microplate reader.
<ol><li>
Instrumentet ställer in
	<ol>
<li>Slå på datorn och multi-mode mikroplattan läsaren. Låt utrustningen stabilisera i 10 minuter.</li>
		<li>Starta programvaran och förbereda ett protokoll.<ol>
<li>Välj protokolltyp: standardprotokoll (Data minskning utförs självständigt för varje platta).</li>
			<li>Ställa in temperaturen vid 37 ˚C och välj preheatment innan du fortsätter protokollet.</li>
			<li>Ange den kinetiska kör: kör tid 50 h / Mätintervallet: 15 min.</li>
			<li>Ställ in orbital skakar på 425 cpm (3 mm) i kontinuerligt läge.</li>
			<li>Välj metoden Läs: fluorescens intensitet Endpoint/Kinetic - Monochromators våglängder: Excitation 440 nm (20 nm bandbredd) / utsläpp 485 nm (20 nm bandbredd) - optik position: Top - Normal läshastighet - Läs höjd: 4.50 mm</li>
			<li>Börja kör använda protokollet skapade. Namnge experimentet, välja destination för den nya filen och låta instrumentet före temperera vid önskad temperatur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spontana huTau441 konvertering
	<ol>
<li>Förbereda reaktion provet i en 1,5 mL tub. Använd 200 μL mix per reaktion och minst 4 replikat (reaktionsvolym för 4 replikerar = 800 μL).</li>
		<li>Förbereda 800 μL reaktion provet (vid 4 replikat) som innehåller 15 μM huTau441, 8 μM heparin och 50 μM ThT. Start genom att blanda proteinet med reaktion bufferten, Lägg till heparin och ThT och blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger. Respektera den angivna ordningen för reagens tillägg.</li>
		<li>Spinna prover på 12 000 x g och 25 ° c i 5 min att eliminera luftbubblor.</li>
		<li>Fördela 200 μL av reaktion prov per brunn i 96 brunnar mikroplattor (96 brunnar svart solid mikroplattan, väl-volym 360 μL, platt botten). Undvika att luftbubblor bildas.</li>
		<li>Försegla mikroplattan att undvika avdunstning.</li>
		<li>Placera mikroplattan i multi-mode microplate reader och starta mätningar.</li>
		<li>Efter slutförandet av experiment, ta bort plattan från utrustning och exportera data till en databehandling programvara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvalitetskontroll av konvertering, säd samling och lagring.
	<ol>
<li>Ta bort remsan från plattan och pool replikerar den olika i 1,5 mL rör. Blanda väl aggregerade provet i brunnarna genom pipettering upp och ner 2 gånger innan du samlar in den. Aggregat tenderar att deponera på botten av brunnen.</li>
		<li>Blanda noggrant i 1,5 mL röret genom pipettering upp och ner 5 gånger och avstå från 10-20 μL på en glimmer yta för att analysera aggregaten av AFM (för ytterligare detaljer se Apetri et al. ( 24).</li>
		<li>Skörda aggregaten genom att snurra 1,5 mL röret på 20 000 x g och 4 ° c i 1 timme. Aggregat bilda en pellet.</li>
		<li>Separera och analysera supernatanten med S-MALS bekräfta avsaknaden av monomer tau i provet som anger en lyckad konvertering till aggregat (för ytterligare detaljer se Apetri o.a. ( 24).</li>
		<li>Etikett 1,5 mL röret som innehåller de återstående aggregat (pellets) som anger inledande huTau441 proteinkoncentration och provvolymen. Snapin fryser aggregaten och förvaras vid-80 ˚C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seedade reaktion
	<ol>
<li>Ta bort huTau441 aggregat från-80 ° c frys. Lägga till volymen av reaktion buffert anges på etiketten (utfallsprov volym) och låt röret stabilisera att RT. resuspendera aggregaten genom pipettering upp och ner 5 till 8 gånger.</li>
		<li>Sonikera aggregerade provet. För en 200 μL prov (15 μM huTau441), Sonikera på is med en 1/8 ”microtip (från 100 μL upp till 10 mL) under totalt 15 s med pulser av 1 s och pauser 2 s på 30% amplitud (någon sonikator 250 watt). Re jämvikta prov till RT. Observera: De anställda ultraljudsbehandling villkor leda till en homogen befolkning på tau fibriller med längder på 20-50 nm24.</li>
		<li>Förbereda reaktion provet i 1,5 mL rör. Använd 200 μL mix per reaktion och minst 4 replikat (reaktionsvolym för 4 replikerar = 800 μL).</li>
		<li>Förbereda 800 μL reaktion prov som innehåller 15 μM huTau441, 8 μM heparin och 50 μM ThT. Start genom att blanda proteinet med reaktion bufferten, Lägg till heparin och ThT och blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger. Respektera den angivna ordningen för reagens tillägg.</li>
		<li>Spinna prover på 12 000 x g och 25 ° c i 5 min att eliminera luftbubblor.</li>
		<li>Fördela 200 μL av reaktion prov per brunn i 96 brunnar (96 brunnar svart solid mikroplattan, väl-volym 360 μL, platt botten). Undvika att luftbubblor bildas.</li>
		<li>Homogenisera grundligt förformade fibrill provet av repetitiva upp och ner pipettering (5 gånger) och lägga till varje brunn det belopp som motsvarar den önskad procentandelen av frön. För en 200 μL väl total volym är 2 μL av förformade utsäde tillägg en 1% (v/v). Mix av pipettering upp och ned 3 gånger när du lägger till brunnen och undvika att luftbubblor bildas.</li>
		<li>Försegla mikroplattan att undvika avdunstning.</li>
		<li>Placera mikroplattan i multi-mode microplate reader och starta mätningar.</li>
		<li>Avlägsna plattan från utrustning och exportera data till ett kalkylblad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+tauopathies.">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li><li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease:+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau.">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li><li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains.">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li><li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer's+disease.">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li><li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A68:+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau.">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li><li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer's+disease.">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li><li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies.">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li><li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro.">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li><li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation.">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li><li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231.">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li><li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation.">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).</li><li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers:+Insight+from+studies+in+vitro.">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li><li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li><li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans.">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li><li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments.">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li><li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li><li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments.">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li><li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution.">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer's+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein.">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li><li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer's+disease+and+the+tauopathies.">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li><li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein:+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation.">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li><li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy,+corticobasal+degeneration,+FTDP-17+and+Pick's+disease.">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Trots många försök, de tau aggregation kineticsen rapporterats i litteraturen att datum saknas önskad nivå av reproducerbarhet och/eller några av funktionerna en kärnbildning beroende polymerisation19,20,21 , 22 , 23 , 25. Detta framhävs ofta av bristen på en eftersläpning fas, ineffektiva sådd och icke-fibrillar natur av tau aggregat. Orsaken till dessa brister kan variera och inkluderar suboptimala tau proteinkvalitet (fragmentering, förekomsten av aggregat, låg renhet osv.), val av protein och förmå reagenser och eller experimentella förhållanden. En annan komplicerande faktor är två cystein rester ligger runt tau aggregering gränssnittet som kan bilda intra - eller inter - molekylär disulfide broar beroende på redox miljö och påverkar effektiviteten av tau aggregation. I de flesta metoder att minska reagens såsom DTT eller TCEP har använts för att bibehålla cystein rester i reducerade former och därmed öka nivåer av reproducerbarhet25. En extinktionskoefficient Tau är dessutom mycket låg vilket leder till svårigheter med noggranna mätningar av proteinkoncentration.
Vi fokuserade särskilt på några parametrar och kvalitetsattribut som vi ha avgörande betydelse för en robust, reproducerbar och representativa aggregering profil för tau-protein: att eliminera möjligheten av intra - och inter-molekylär disulfid bildande, Generera en högt rena tau monomer och förbättra koncentration beslutsamhet noggrannhet. Alla dessa reagens relaterade frågor är potentiella uppmärksamhet punkter som vi ansåg kritiska för optimal analys utveckling. För att lösa dessa frågor, uttrycktes full längd huTau441 med två mutationer, C291A och C322A, och N - och C-terminal taggar. Mutation av cystein rester har minimal påverkan på tau protein samtidigt som det eliminerar den annars mycket svårt att styra disulfid överbrygga. Uttrycker proteinet med relativt kort N - och C-terminal Taggar tillät oss att fullfölja en två-stegs affinitet rening protokollet vilket ledde till mycket hög renhet, integritet och monomer innehåll. Dessutom presenterade vi en F8W-mutation som ökade extinktionskoefficient av protein och får mycket mer exakt koncentration mätningar24.
Förutom att använda högkvalitativt protein reagenser, var andra assay parametrar också optimerad. Den optimala tau: heparin baserat identifierades för att vara runt 0,5 (M/M) som är i linje med tidigare publicerade studier26. Mekaniska och optiska instrumental inställningar är dessutom avgörande att säkerställa reproducerbarhet och de optimala parametrarna skiljer sig till viss del beroende på tillverkaren.
Sammanläggning av tau som beskrivs i denna analys visar egenskaper som är associerade med tau patogenes i AD och relaterade tauopathies. Processen börjar med en inledande lag fasen motsvarar bildandet av hög energi kärnor och följs av en snabb tillväxtfas som motsvarar till fibrill tillväxt. Lagfasen är tillräckligt lång för att öppna ett brett fönster för att i detalj studera sådd processen som täcker ett brett spektrum av utsäde koncentrationer (figur 5) medan fortfarande inte alltför länge så proteinnedbrytning och/eller icke-specifik aggregering undviks (figur 2). dessa sekundära händelser kan speciellt hända när ett intimt oordnade protein såsom huTau441 utsätts för långa tidsperioder att fysiologiska förhållanden. Erhållna tau aggregat displayen morfologi av PHFs isolerade från hjärnan hos AD patienter och är mycket effektiva i att rekrytera monomer tau och konvertera den till de novo genereras aggregat, en process som kallas sådd. Analysen är mycket reproducerbara, kinetic kurvorna att vara praktiskt taget omöjlig att skilja mellan brunnar, experimentell körningar och protein partier. Även om den aktuella analysen fokuserar endast på den längsta tau isoformen, huTau441, programmet kan anpassas för att studera omvandlingen av andra former av tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Dessutom gör det möjligt mekanistiska studier fokuserar på samspelet mellan tau isoformer och eventuellt belysa skillnaderna mellan tau patogenes i AD där både 3R och 4R isoformer är närvarande i PHFs och Picks sjukdom eller Frontotemporal demens där tau patologi innehåller huvudsakligen 3R och 4R tau-isoformer, respektive27.
Mycket hög reproducerbarhet av analysen bör tillåta läsarna att genomföra det med relativ lätthet i sina specifika lab inställningar. Analysens härmar vad som tros vara i vivo Skellefteåsjukan och aggregering av tau, aktivera mekanistiska studier som kommer att belysa tau patogenes och det utgör ett värdefullt verktyg för screening läkemedelskandidater och utvärdera deras inblandning med de olika stegen i processen patogenes.

Alzheimers sjukdom är en förödande neurodegenerativ sjukdom som definieras histopatologiskt av ansamling av extracellulära senila plack av aggregerade Amyloid beta1 och intracellulära neurofibrillära trassel som innehåller aggregerade hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiska tau är monomer och presenterade som sex unika isoformer som innehåller 0-2 N terminal skär och 3 eller 4 mikrotubulära bindande domäner3,4 uppkommer alternativ splitsning och ett genomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det tros att hyperphosphorylation, Skellefteåsjukan och själv aggregering i fibrillary strukturer utgör nyckelelementen i tau patogenes, bedömdes patologiskt i dementa personer5,6.
De aggregerade neurofibrillära tau tovor är ett kännetecken inte bara för AD, men också för andra tauopathies, däribland frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Picks sjukdom, Progressiv Supranukleär pares (PSP), fronto-temporal demens (FTD) och primär åldersrelaterade tauopathy (del)2. Från en biokemisk synvinkel, förstå mekanismen av tau Skellefteåsjukan och aggregering kunde belysa patologiska processer i samband med AD och andra tauopathies. Förutom den vetenskapliga aspekten finns robust in vitro- aggregering analyser värdefulla verktyg för screening av drogen kandidater7,8,9,10. Det tros att sammanläggning av tau följer en kärnbildning beroende polymerisation process (NDP)11,12,13,14. NDP kinetik är sigmoidal och börjar med ett energetically unfavorable kärnbildning steg följt av en snabb energiskt utförsåkning aggregering process.
Till skillnad från andra amyloidogenic proteiner, inklusive prionproteinet, beta-amyloid och α-synuclein, tau spontant samlade inte under fysiologiska betingelser och även extrema pHs eller höga temperaturer är icke-främjar för sammanläggning15. Detta beror troligen på de hydrofila interaktionerna i gränssnittet tau aggregering. Dock aggregerar tau effektivt vid fysiologiska koncentrationer när inducerare såsom heparin16 eller andra polyanions17,18 används.
Tidigare insatser för att ställa in vitro- tau aggregering analyser har kasta lite ljus på detaljerna tau Skellefteåsjukan och aggregering, men de kom kort att härma vad som tros vara i vivo tau aggregering kinetik. I de flesta fall saknades de tau aggregation kineticsen den inledande lag fasen är associerad med tau kärnbildning. Detta kan ha varit följden av med mycket hög tau protein koncentrationer, förekomsten av aggregat i Start tau protein förberedelserna och/eller användning av tau fragment med mycket högre aggregeringsnivå benägenhet än den mer fysiologiska full längd-tau protein19,20,21,22,23. Dessutom upp tidigare studier inte den reproducerbarhet och robusthet aspekt av tau aggregation kinetics.
Här beskriver vi ett robust in vitro- tau aggregering test som härmar de viktigaste egenskaperna hos en kärnbildning beroende polymerisation med en inledande lag fasen motsvarar tau kärnbildning följt av en exponentiell tillväxtfas. Dessutom genererade rekombinant tau aggregaten är fibrillar i naturen och har en extremt hög sådd potens. Analysen är mycket reproducerbara också mellan tau batchar och utgör ett värdefullt verktyg att skärmen för aggregering hämmare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1240px;" width="1239">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:353px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:393px;">T3516-5G</td>
			<td style="width:308px;">dry powder (Mw = 318.86 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td>dry powder (Mw = 17-19 kDa)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259-1G</td>
			<td>dry powder (MW= 286.65 g/mol)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Sterile, pH 7.4 (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.20 &#956;m sterile serynge filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431229</td>
			<td>PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-well microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9502867</td>
			<td>Black, flat botton</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microplate sealers&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY992</td>
			<td>Adhesive strips&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td>Hybrid Technology, Gen5 Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>1,5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonics-Branson SFX250</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101-063-966R</td>
			<td>1/2&#34; Solid Horn and 1/8&#34; microtip&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assay for studying the aggregation of tau protein and drug screening

Sammanläggning av tau-protein och bildandet av Parade spiralformade filament är ett kännetecken för Alzheimers sjukdom och andra tauopathies. Jämfört med andra proteiner som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar, rapporterade in vitro- aggregering kinetiken för tau-protein är mindre konsekvent presenterar en relativt hög variabilitet. Här beskriver vi utvecklingen av en in vitro- aggregering analysmetod som härmar de förväntade stegen i samband med tau Skellefteåsjukan och aggregation i vivo. Analysen använder den längsta tau isoform (huTau441) som innehåller både N-terminala sura skär samt fyra mikrotubulära bindande domäner (MBD). In vitro- aggregering utlöses genom tillsats av heparin och följs kontinuerligt av Tioflavin T fluorescens i 96 väl mikroplattan format. Tau aggregering analysen är mycket reproducerbara mellan olika brunnar, experimentell körningar och partier av proteinet. Aggregeringen leder till tau PHF morfologi som är mycket effektiv i sådd bildandet av de novo fibrillar strukturer. Förutom sin ansökan för att studera mekanismen för tau Skellefteåsjukan och aggregering, är aktuella analysen ett robust verktyg för screening av läkemedel som kan störa patogenesen av tau.

Rekombinant huTau441 som innehåller C291A och C322A mutationer och N-terminala hans och C-terminal C-Taggar var uttryckt och renat som tidigare beskrivs24. HuTau441 partier är mycket ren som visualiseras på SDS-PAGE och nästan 100% monomer enligt bedömning av S-MALS (figur 1). Sammanläggning av 15 µM huTau441 förmåddes genom tillsats av 8 µM HMW heparin och reaktionen följdes kontinuerligt av ThT fluorescens med en multimode microplate reader. Magnetiseringen våglängden var 440 nm (bandbredd 20 nm) medan utsläppen mättes på 485 nm (bandbredd 20 nm). Analysen är mycket reproducerbara, med resultat från 10 enskilda brunnar är praktiskt taget omöjlig att skilja (figur 2A). Morfologier av ThT positiva huTau441 aggregaten bedömdes efter 50 h av AFM. Aggregerade hutau441 är en homogen blandning av fibrillar strukturer av olika längder liknar rapporterade ex vivo morfologier (figur 2B). Slutliga reaktionsblandningen innehåller dessutom inte monomer, vilket tyder på en fullständig omvandling till aggregat som framgår av S-MALS mätningar (figur 2 c). Kinetiken av huTau441 aggregation i oberoende experimentella körningar är mycket lika som understryks av liknande sigmoidal kurvor och omöjlig att skilja eftersläpning och tillväxt faser (figur 3). Den höga graden av reproducerbarhet bibehålls när olika partier av protein används (figur 4). Förformade huTau441 aggregat är dessutom mycket effektivt rekrytera tau monomer och inducera bildandet av de novo tau aggregat. Belopp som är så låg som 0,0025% (v/v) av förformade tau aggregat klarar att kringgå kärnbildning och trigger generation av de novo fibriller (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figur 1: rekombinant huTau441 är monomer och högt rena. (A) renhet bedömning enligt denatureringen villkor på en 4-12% SDS-PAGE gel inklusive molekylär vikt standard protein stege (i kDA) (Lane 1); flöda genom från sista C-tag affinitet reningssteg (Lane 2); kolumnen tvätta bråkdel (Lane 3), eluerat huTau441 protein peak, innan (Lane 4) och efter buffert utbyte (Lane 5), respektive). (B) S-MALS analys av huTau441. Protein visar sig vara > 99,9% monomer med en Molmassa av 51 kDa och innehåller inte aggregat eller fragment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figur 2: aggregering av rekombinant huTau441 är mycket reproducerbara och leder kvantitativt till fibrillar strukturer. (A) kinetik av heparin inducerad huTau441 aggregation övervakas kontinuerligt i 96 väl mikroplattan format av ThT fluorescens. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. 10 individuella kurvorna motsvarar omvandlingen av samma protein parti i tio brunnar i samma mikroplattan och kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 14,2 ± 0.38 h och t50 18,8 ± 0,40 h. kinetiska data var försedd med en 5-parametern transport c kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. Fördröjning fas och t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. Kurva montering och sammanfattande statistik erhålls med hjälp av IBM SPSS statistics version 20.0.0.2. (B). Tau aggregat Visa PHF-liknande morfologier som indikeras av AFM imaging på 50 h; (C). S-MALS analys av monomer huTau441 (t = 0 h) och supernatanten av reaktionsblandningen vid slutförandet av reaktionen (t = 50 h). Vid 50 h tidpunkten var reaktionsblandningen centrifugeras för 1h 20 000 X g och 4 ˚C och resulterade supernatanten injiceras på S-MALS. Försvinnandet av monomer toppen bekräftar komplett sammanläggning av tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figur 3: tau aggregering analysen visar hög reproducerbarhet mellan oberoende experimentella körningar. De två skärmar av fyra enskilda kinetik spår för spontan huTau441 aggregering samlas i två oberoende experiment använder samma parti av huTau441 protein. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Kinetik kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 12.2 ± 0,18 h och t50 17,8 ± 0,8 h (kör 1) och 11,6 ± 0,52 h och t50 17,8 ± 0,23 h (kör 2), respektive. Kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. T50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figur 4: tau aggregering analysen visar hög reproducerbarhet mellan olika partier av huTau441 protein. Varje panel visar fyra replikerar motsvarar en specifik huTau441 batchen. Sammanläggning av varje sats följdes oberoende experiment. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Aggregation kinetics motsvarar de fyra individuella tau batchar kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 15,3 ± 0.38 h och t50 21,1 ± 0,46 h (Batch 1); lag fasen av 12,5 ± 0,07 h och t50 19,8 ± 0,34 h (Batch 2); lag fasen av 15,1 ± 0,34 h och t50 21,9 ± 0.86 h (Batch 3) och släpa fasen av 11,5 ± 0,29 h och t50 17,8 ± 0,29 h (parti 4), respektive. Kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. Fördröjning fas och t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figur 5: förformade hutau441 aggregat har hög sådd aktivitet. För att initiera sådd, har sonicated tau aggregat lagts till monomeren hutau441. Från rött till blått, varje färg av olika kinetiska kurvorna representerar olika mängden tillsatt frön: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% och 0,0025% (v/v), respektive. Spontan konvertering av hutau441 representeras i svart. Alla villkor testades i fyra exemplar. De fyra kinetiska replikat som är associerad med en viss koncentration av frön är mycket reproducerbara och i de flesta fall inte särskiljas. Koncentrationer av hutau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Tillsats av små mängder av förformad sonicated fibrillar strukturer eliminerar den inledande lag fasen observerats i spontan konvertering och effekten är proportionell mot mängden frön. Från rött till blått, är skillnaden i t50 observerats (t50 spont.conv-t50 sådd) 18,9, 18,40, 17,8, 17,3, 16.6, 16.1, 15,4, 14.7, 14.2 och 13,7 timmar, respektive. Spontan konvertering av hutau441 kännetecknas av en genomsnittlig t50 (med SD) av 19.85 ± 0,54 h. kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening at JoVE.com

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analys för att studera sammanläggning av Tau-Protein- och drogkontroll

Tau aggregering analysen beskrivs i detta manuskript härmar de förvänta funktionerna i vivo Skellefteåsjukan tau och aggregering.

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Misfolding av Tau protein i sin självmontering i parade spiralformade trådar är ett patologiskt kännetecken för Alzheimers sjukdom och andra Tauopathies. Här presenterar vi en robust Tau aggregering assay som skulle kunna hjälpa klarlägga Tau patogenes processen. Omvandlingen följer alla steg i en kärnbildning beroende polymerisation process och är mycket reproducerbara, vilket gör att drogscreening i ett mer rigoröst format som träffade OBSI nivå hittills.Kvaliteten på reagenser är avgörande. Den rekombinanta Tau måste vara mycket ren och saknar aggregat och fragment. Slå först på datorn och multimode-mikroplattläsaren.Efter att utrustningen har tillåtits att stabiliseras, starta programvaran och välj Standardprotokoll som protokolltyp. Ställ in temperaturen på 37 grader Celsius och välj Förvärmning innan du fortsätter protokollet. Nästa, ställ in den kinetiska körtiden till 50 timmar och mätintervallet till 15 minuter.Ställ in omloppsbanornas skakning till 425 cykler per minut i kontinuerligt läge. Efter detta väljer läsmetoden som fluorescens intensitet slutpunkt kinetiska momochromators. Ställ excitation våglängd till 440 nanometer och utsläpp våglängd till 485 nanometer, optik position till toppen, och vinsten till 80.Välj normal läshastighet och ställ in läshöjden på 4,50 millimeter. Validera och spara sedan protokollet. Starta körningen med det skapade protokollet.Namnge experimentet, välj mål för den nyskapade filen och låt instrumentet förjämna till önskad temperatur. För ett spontant rekombinant Tau-konverteringsexperiment, förbered ett 1, 000 microliter reaktionsprov med 800 mikroliter för tiooflavin-T fluorescens, och 130 mikroliter för SEC-MALS-analys genom att först blanda proteinet med reaktionsbufferten i ett 1,5 milliliterrör. Lägg sedan till heparin och thioflavin-T och blanda väl genom att pipettera upp och ner fem gånger.Det är viktigt att utföra protokollet exakt för att säkerställa hög reproducerbarhet, blanda reagenser i samma ordning och hålla sig inom tidsramar. Snurra provet i 12, 000 x g och 25 grader Celsius i fem minuter för att eliminera luftbubblor. Efter centrifugeringen dispense 200 mikroliter av reaktionsprov per brunn i en 96-väl mikroplatta, undvika bildandet av luftbubblor.Sedan försegla mikroplattan för att undvika avdunstning. Placera mikroplattan i en mikroplattläsare med multimode. Välj full platta, eller om plattan inte är full, välj de brunnar som ska läsas, och starta mätningen.Exportera datan till databehandlingsprogramvara. Ta sedan ut mikroplattan ur utrustningen. Därefter tar du bort sealern från mikroplattan.Blanda det aggregerade provet i brunnarna genom att pipettera upp och ner två gånger, och poola de olika replikaten i 1,5 milliliterrör. Blanda varje prov noggrant genom pipettering upp och ner fem gånger, och dispensera 10 till 20 mikroliter på en glimmer yta för att analysera aggregaten genom atomkraft mikroskopi. Efter detta skörda aggregaten genom att snurra var och en 1,5 milliliter rör på 20, 000 x g och 4 grader Celsius i en timme.Analysera supernatanten av SEC-MALS för att bekräfta frånvaron av monomerisk Tau i provet, vilket indikerar en lyckad omvandling till aggregat. Därefter tar du bort alla återstående supernatant och märker 1,5 milliliter röret som innehåller de återstående aggregaten med den initiala rekombinanta Tau proteinkoncentrationen och provvolymen. Snap frysa aggregaten och lagra på 80 grader Celsius.För ett såddt experiment, ta bort de rekombinanta Tau aggregat från frysen, tillsätt volymen av reaktionsbuffert som anges på etiketten, och låt röret stabiliseras till rumstemperatur. Sedan återanvänder aggregaten genom pipettering upp och ner fem till åtta gånger. Sonicate den 200 microliter aggregerade prov på is med hjälp av en 1/8 tums mikrospets för en total period av 15 sekunder med pulser på en sekund på och två sekunder av vid 30 procent amplitud.Därefter förbereda en 800 microliter reaktionsprov genom att först blanda proteinet med reaktionsbufferten i ett 1,5 milliliter rör. Lägg sedan till heparin och thioflavin-T och blanda väl genom att pipettera upp och ner fem gånger. Snurra proverna i 12, 000 x g och 25 grader Celsius i fem minuter för att eliminera luftbubblor.Efter centrifugeringen, dispensera 198 mikroliter av reaktionsprov per brunn i en 96-brunns mikroplatta, undvika bildandet av luftbubblor. Homogenisera det förformade fibrala provet genom pipettering upp och ner tre gånger. Lägg till det belopp som motsvarar den önskade andelen frön till varje brunn och blanda genom pipettering upp och ner tre gånger.Sedan försegla mikroplattan för att undvika avdunstning. Placera mikroplattan i mikroplattläsaren för multimode och starta mätningen. När experimentet är klart, ta bort mikroplattan från utrustningen.Exportera sedan data till ett kalkylblad. Rekombinanta Tau som innehåller C291A och C322A mutationer och n terminal hans och c terminal c-taggar är mycket ren som visualiseras på SDS sida och praktiskt taget 100 procent monomeric som bedöms av SEC-MALS. Heparin inducerad rekombinant Tau aggregering följdes av thioflavin-T fluorescens med hjälp av en excitation våglängd av 440 nanometer och ett utsläpp våglängd av 485 nanometer.Analysen är mycket reproducerbar med resultat från 10 individuella brunnar är praktiskt taget omöjlig att skilja. De rekombinanta Tau aggregat är en homogen blandning av fibular strukturer av olika längd, liknande rapporterade ex-vivo morphologies. Den slutliga reaktionsblandningen innehåller inte monomer, vilket tyder på en fullständig omvandling till aggregat, vilket visas av SEC-MALS mätningar.Kinetiken av rekombinant Tau aggregering i oberoende experimentella körningar är liknande, vilket betonas av liknande sigmoideala kurvor och omöjliga att skilja lag och tillväxt faser. Den höga reproducerbarheten bibehålls när olika partier protein används. Pre-bildade rekombinanta Tau aggregat är effektiva i att rekrytera Tau monomer och förmå bildandet av de novo Tau aggregat, och effektiviteten i processen är direkt proportionell med andelen frön.Belopp så låga som 0,0025 procent av förformade Tau aggregat uttryckt i volym kan kringgå rekombinanta Tau kärnbildning och utlösa de novo fibral generation. Den nuvarande analysen härmar vad som tros vara in vivo misfolding och aggregering av Tau och möjliggör mekanistiska studier som skulle kunna belysa patogenes processen och utgör ett värdefullt verktyg för läkemedelsscreening och studera inblandning av läkemedelskandidater med olika stadier av processen. Den höga reproducerbarheten av analysen gör det möjligt för forskare att genomföra det med relativ lätthet i laboratoriet.Även om den nuvarande analysen fokuserar endast på den längsta Tau isoform, mänskliga Tau-441, kan ansökan anpassas för att studera olika Tau varianter. Och glöm inte, välja rätt protein reagenser och producera dem på höga kvalitetskrav är avgörande för att inrätta en robust och mycket reproducerbar analys.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhinnans Micropocket Analys: En modell av angiogenes i mus Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerv Förberedelse för Studera Förbränningsegenskaper för Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

De indirekta Neuron-astrocyternas Coculture analys: En<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up för detaljerad undersökning av Neuron-Glia interaktioner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescence avbildning av Neuroinflammation i transgena möss efter perifer ympning av alfa-synuklein fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Ett Microbiomechanical System för att studera Praparat bildandet och återhämtning i centrala Neuron axoner

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ autoradiografisk metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral protein syntes in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-baserad analys att studera antikroppsmedierad Tau Clearance av mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...