Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

ونشكر ويسيلوه Britta وهابيل بيتينا للمساعدة التقنية. كما نشكر أرني Düsedau وجانا هنسن (التدفق الخلوي منصة التكنولوجيا، معهد بيت هاينريش) لتقديم الدعم التقني.

1-استراتيجية استهداف للجينوم الهندسية وتستهدف تصميم المتجهات (التلفزيون)
ملاحظة: الخطوة الأولى لهندسة الجينوم ينطوي على التحديد وجيل من الأدوات اللازمة لاستهداف كريسبر-Cas9-بوساطة. اختيار موضع موقع التكامل الجينوم، اختيار نوع الخلية لاستهداف، وتصميم لمراسل المستمد...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

وهنا يصف لنا وضع بروتوكول لإنشاء نماذج مراسل جوركات مشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع المواقع المختارة التكامل بروفيرال تطبيق هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد.
نقاط عدة من البروتوكول تتطلب عناية فائقة أثناء مرحلة التخطيط. أولاً، موضع استهداف ينبغي أن تختار بعناية، كما ب...

إدماج الحمض النووي بروفيرال في جينوم مضيف عند الإصابة خطوة حاسمة في دورة حياة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV). وبعد الاندماج، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية بوضع الكمون في خلايا CD4 + "تي" خلية فرعية المعمرة مثل خلايا CD4 + T الذاكرة. إدماج فيروس نقص المناعة البشرية، على ما يبدو، غير عشوائية1،2. تم الكشف عن عدد من النقاط الساخنة الجينوم مع الحمض النووي بروفيرال المتكاملة متكرر في عدة دراسات عن طريق تسلسل مواقع التكامل في الأفراد المصابين حادة ومزمنة2،،من34 ،،من56،،من78. من المثير للاهتمام، في بعض من هذه المواقع التكامل، تم الكشف عن المكان نفسه في جزء كبير من الخلايا المصابة، مما يؤدي إلى فكرة أن التكامل في المواقع المتكررة قد تؤثر تأثيراً إيجابيا على التوسع في الاستنساخ1.
المضي قدما في فهمنا لأهمية مواقع التكامل المتكررة، يجب استكشاف خيار التكامل بروفيرال الموقع. ومع ذلك، العديد من الجوانب التقنية تعيق دراسة إدماج فيروس نقص المناعة البشرية الموقع الاختيار والعواقب. تستخدم على نطاق واسع نماذج ثقافة الخلية لزمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية مثل خطوط الخلايا جلات لا تعكس التكامل المتكررة ذات الصلة سريرياً مواقع9. دراسات على الخلايا الأولية المستمدة من المريض، من ناحية، تمكين وصف للتكامل الموقع المشهد بالتسلسل ولكن لا تسمح للتحليلات الفنية. على حد علمنا، يتوفر لا نموذج تجريبي كافية لتحليل المواقع المختارة ذات الصلة سريرياً الاندماج وظيفيا.
نقدم هنا سير عمل مفصلة لإنشاء نماذج جديدة بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام تكنولوجيا الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد الهندسة. يمكن استخدام سير العمل الموضحة هنا لإنشاء خطوط الخلايا المشتقة من الخلايا T مراسل أن نموذج الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، تحمل مراسل بروفيرال جينوميكالي متكاملة في موقع تكامل الذي تم اختياره. وهكذا يقضون كأدوات جديدة لاستكشاف كيف يمكن أن تؤثر موقع التكامل بروفيرال بيولوجيا فيروس نقص المناعة البشرية، وكيف بروفيروس يستجيب لاستراتيجيات علاجية مختلفة (مثل، إيندوسيبيليتي بعكس وكلاء الكمون). يستخدم أسلوب لدينا مزايا هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد، في أي اندماج المراسل يسر تسلسل من جزئ مثلى فاصل مزدوج-حبلا المستحثة نوكلاس Cas9 في الموقع المستهدف. ويتم اختيار المواقع المستهدفة للاندماج وفقا لقربها من مواقع وصف التكامل المتكررة من الدراسات المتعلقة بالأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، ووجود زخارف بام مناسبة للهندسة Cas9 بوساطة الجينوم.
في نتائج مثالية، وركزنا على موضع الجينات BACH2، أي رموز للجهة النسخي BTB والتماثل باستخدام الحاسب الآلي 2. في الأفراد المصابين بأمراض مزمنة على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، BACH2 واحد من المكاني عرض تخصيب المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل3،6،7،،من810. وقد اخترنا مراسل المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية الحد أدنى تتكون مشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 طويلة طرفية تكرار (لاتينية) وتسلسل ترميز تدتوماتو وهرمون النمو البقري (محكمة العدل الاتحادية) بوليادينيليشن إشارة (السلطة الفلسطينية)، التي كنا قد استهدفت موقعين من مواقع محددة في إنترون BACH2 5. البروتوكول المقدم هو الأمثل للخلايا جوركات والبشرية CD4 + خط الخلية المستمدة من الخلايا T تعليق، ولكن خلية أخرى يمكن أن تستخدم خطوط وبروتوكول تكييفها تبعاً لذلك. نقدم سير عمل مفصلة لاختيار الموقع المستهدف، بناء ناقلات الأمراض المستهدفة مع الأسلحة التماثل، كريسبر-Cas9-بوساطة استهداف المراسل في موقع جينومي المختار، وتوليد واختيار الخطوط الاستنساخ، وشاملة التحقق خطوط الخلية مراسل المستهدف، والذي تم إنشاؤه حديثا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) يدمج الحمض النووي بروفيرال غير عشوائي في جينوم الخلية المضيفة في مواقع المتكررة، والنقاط الساخنة الجينوم. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نماذج في المختبر رواية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مع مواقع التكامل الجينوم الذي تم اختياره باستخدام الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد تكنولوجيا الهندسة. مع هذا الأسلوب، تسلسل مراسل الاختيار يمكن إدماج محور الجينوم المستهدف، والذي تم اختياره، تعكس مواقع التكامل ذات الصلة سريرياً.
ويرد في البروتوكول، تصميم مراسل المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية واختيار الهدف تسلسل الموقع وجرنة. ناقل استهداف مع الأسلحة التماثل التي شيدت وترانسفيكتيد في خلايا تي جوركات. التسلسل مراسل يستهدفها إلى موقع جينومي المحدد جزئ مثلى سهلت من كسر مزدوج-حبلا بوساطة Cas9 في الموقع المستهدف. استنساخ الخلايا المفردة التي تم إنشاؤها وفرزهم لاستهداف الأحداث بالتدفق الخلوي وبكر. ثم يتم توسيع استنساخ المحدد، واستهداف الصحيح يمكن التحقق منه ببكر وتسلسلها والنشاف جنوبي. ويتم تحليل الأحداث المحتملة خارج الهدف من هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-بوساطة.
باستخدام هذا البروتوكول، ونظم الثقافة الخلية رواية يمكن أن تتولد أن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية النموذجي في المواقع ذات الصلة سريرياً التكامل. ورغم أن توليد استنساخ الخلايا المفردة، والتحقق من تكامل التسلسل الصحيح مراسل مضيعة للوقت، خطوط الاستنساخ الناتجة أدوات قوية لتحليل وظيفيا اختيار موقع التكامل بروفيرال.

في هذه التجربة التمثيلية اخترناه لاستهداف مراسل مشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحد أدنى تتكون لتر والترميز تدتوماتو التسلسل، والتسلسل بوليا-إشارة إلى اثنين المكاني في إنترون 5 من الجينات BACH217. وقد تم اختيار المكاني لاستهداف وفقا لقربها من المواقع الم?...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

نقدم جينوم سير عمل الهندسي لتوليد نماذج جديدة في المختبر للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 أن الخص التكامل بروفيرال في مواقع مختارة الجينوم. استهداف الصحفيين المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية يسهل التلاعب جينوم كريسبر-Cas9-بوساطة، والمعينة للموقع. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوليد استنساخ الخلايا المفردة والفحص والتحقق الاستهداف الصحيح.

هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد لتوليد نماذج مراسل جوركات للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 مع مواقع مختارة من التكامل بروفيرال

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على السؤال حول كيفية تأثير تكامل الفيروس الفيروس الفيروس التعبير الجيني أندروجينوس، ولماذا يتم اختيار بعض مواقع التكامل الجينومي في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في الآونة الأخيرة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنتاج نماذج في المختبر للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية، والتي تحمل مراسلين محترفين للفيروسات يستهدفون مواقع الاندماج المختارة باستخدام هندسة الجينوم القائمة على CRISPR/Cas9. إثبات الإجراء سيكون توماس والثر، طالب دكتوراه، وجوليا بياليك، ما بعد الدكتوراه من مختبري.ابدأ باستخدام UCSC Genome Browser لاستخراج التسلسل الجينومي للملغة الجينومية المطلوبة. لاختيار RNAs دليل من 20 النيوكليوتيدات لاستهداف من المكبس الجينومية المختارة، استخدم أداة ويب E-CRISP. ثم حدد، الإنسان العاقل الجينوم المرجعي كونسورتيوم الجينوم البشري:بناء 38.الجينوم المرجعي ككائن حي ومدخل 2000 أزواج قاعدة من التسلسل الجينومي، تغطي موضع الجينوم المطلوب الذي سبق استخراجه. بدء البحث دليل RNA باستخدام إعدادات التطبيق المتوسط مع أي PAM، أي خمسة رئيس الوزراء قاعدة، خارج الأهداف تتسامح مع عدم التطابق واستبعد introns وجزر CPG. من القائمة مع التصاميم دليل-RNA التي تظهر، حدد دليل الجيش الملكي النيبالي مع درجة عالية لخصوصية وكفاءة، وهو أقرب ما يمكن إلى مكان الجينوم المطلوب أن تكون مستهدفة.فتح متصفح انفجار NCBI لتفجير تسلسل الدليل-RNA المختار ضد الجينوم المرجعي. للتحقق من تفرد موقع الربط الدليل-RNA المحدد، حدد أولاً الإنسان كمجين ومن ثم إدخال تسلسل الدليل-RNA كتسلسل الاستعلام. ثم حدد تسلسلات مشابهة للغاية أو انفجار ميجا كما البرنامج للتأكد من أن تسلسل دليل الجيش الملكي النيبالي هي فريدة من نوعها.بعد ذلك، حدد في-silico 1، 000 أزواج قاعدة، المنبع والمصب من تسلسل دليل الجيش الملكي النيبالي من تسلسل الجينوم المستخرجة في البداية. استخدم هذه الأزواج 1000 قاعدة المختارة، المنبع والمصب كأسلحة homology خمسة رئيس وثلاثة أولي لاستهداف البناء ناقلات ومتجاورة مراسل تسلسل أن تكون مستهدفة. قبل 24 ساعة من نقل الخلايا التائية jurkat، إعداد واحد لوحة كاملة 6-جيدا من الخلايا لتجربة استهداف واحدة.لبدء, لوحة 1, 250, 000 الخلايا في 2.5 ملليلتر من 1640 RPMI مع المكملات الغذائية ودون المضادات الحيوية, في بئر. في اليوم التالي، إضافة إلى ميكروغرام من ناقلات استهداف دائري واثنين من ميكروغرام من Cas9 ودليل RNA التعبير plasmid في كل بئر، إلى 250 ميكرولترات من المتوسط التجاري RPMI الأمثل لtransfection، في أنبوب رد فعل ومزيج جيد من قبل دوامة. ثم إضافة ببطء 12 ميكرولترات من عامل transfection إلى وسيط الحمض النووي دون لمس جدار الأنبوب.نفض الغبار الأنبوب واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة الخليط قطرة إلى بئر واحد من الخلايا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.وبعد 72 ساعة من العدوى، اسحب الخلايا المُزوّرة، عدّها، واستعدّ للإثراء بواسطة القوات المسلحة الكونغولية. بعد التأكد من أحداث الاستهداف في مجموعات الخلايا المستهدفة المختلطة ، ابدأ في توليد مستنسخات خلايا واحدة عن طريق إعداد وسيط مكيف بالجونكات مقدمًا ، من خلال جمع RPMI مع المضادات الحيوية من الخلايا التائية السليمة وغير المعالجة. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 300 G، وتصفية فائقة مع حقنة 25 ملليلتر، وذلك باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر في أنابيب مخروطية جديدة، 50 ملليلتر.عد الخلايا المستهدفة التي تم إثراؤها سابقًا بواسطة FACS ، بعد 10 إلى 14 يومًا من التوسع ، ثم تمييعها في RPMI بالمضادات الحيوية إلى تركيز 100،000 خلية لكل ملليلتر. تمييع 100 ميكرولترات من هذه الخلية تخفيف مع 9.9 ملليلتر من المتوسطة لتحقيق 1،000 خلية لكل ملليلتر. ثم تمييع مليلتر واحد من هذا التخفيف مع تسعة ملليلتر من متوسطة إلى تركيز 100 خلية لكل ملليلتر.لوحة 96 لوحة جيدا لاحتواء خلية واحدة في البئر، مزيج بلطف ملليلتر واحد من 100-الخلايا في مليلتر حل مع خمسة ملليلتر من متوسطة الشرط وأربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة، في خزان كاشف معقم. ثم، استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولترات من تخفيف الخلية المعنية في بئر من جديد 96 جيدا جولة لوحات أسفل لتحقيق واحد واثنين من الخلايا في تخفيف جيدا. كومة 96 لوحات جيدا وتغطية كل كومة مع لوحة ستة جيدا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني في بئر.احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ثلاثة أسابيع. بعد الانتهاء من الحضانة، وتأكيد بصريا وجود المستعمرات نمت باستخدام المجهر الخفيفة مع التكبير أربع مرات، ووضع علامة على الآبار مع المستعمرات نمت. بلطف resuspend الخلايا واحدة ملحوظ جيدا عن طريق الأنابيب.نقل 100 microliters من هذا التعليق الخلية في بئر واحدة من الطازجة أعدت 96 جيدا لوحة أسفل جولة مع 100 ميكرولترات من RPMI مع المضادات الحيوية، في بئر وتكرار لجميع الآبار ملحوظ، مزيج بلطف عن طريق الأنابيب. لتكرار لوحة، نقل 100 ميكرولترات من هذا التعليق الخلية إلى لوحة فارغة ثانية، 96 جيدا جولة القاع وتكرار هذه العملية لجميع الآبار ملحوظ. وأخيراً، املأ الآبار الفارغة بـ 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية في الـ RPMI.احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد أن حضن لوحة مكررة لمدة 24 إلى 48 ساعة تكرار مرة أخرى عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من RPMI مع المضادات الحيوية إلى كل بئر. استخدام ماصة متعددة القنوات لخلط بلطف ونقل 100 ميكرولترات إلى كل بئر من لوحة جديدة 96 جيدا جولة القاع.ضع واحدة من هذه اللوحتين المكررتين في الحاضنة. استخدم الثاني من اللوحات المكررة الجديدة لعملية استئصال الخلايا المتدفقة ، عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من PMA / Ionomycin Master Mix لكل بئر ، لتحفيز الخلايا. احتضان لمدة 24 ساعة وإعداد الخلايا لعملية استئصال الخلايا تدفق كما هو موضح في النص.بوابة أي خلايا واحدة قابلة للحياة على أساس حجم في إلى الأمام والجانبية مبعثر. تحليل التعبير الجيني مراسل الفلورسنت حسب تدفق استئصال الدراجات. لفحص استنساخ خلية واحدة من قبل PCR، وتصميم التمهيدي P5 وP6 لفحص PCR على أساس تسلسل مراسل المختار، لتضخيم أزواج قاعدة 500 إلى 800 من تسلسل مراسل.للتحكم الإيجابي PCR، تصميم التمهيدي P7 و P8 التي تضخيم أزواج قاعدة 630 من نوع البرية، والملصاص الجينومية غير المستهدفة. تصميم زوج التمهيدي الثالث الذي يضخم أزواج قاعدة 500 إلى 600 من العمود الفقري المستهدفة الموجهة كتحكم في التكامل غير المحدد لتسلسلات العمود الفقري المستهدفة المتجهة. مرة واحدة في استنساخ في لوحة مكررة الثانية نمت بما فيه الكفاية، وإعدادها لفحص PCR عن طريق الطرد المركزي أولا لوحة لمدة 10 دقيقة في 300-G في درجة حرارة الغرفة.اخلع بعناية المُندفع، مع التأكد من عدم إزعاج بيليه الخلية. اغسل الخلايا بـ 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب اللطيفة ، وتجف اللوحة لمدة خمس دقائق عند 300 جرام في درجة حرارة الغرفة. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل في بئر.الماصات بلطف لخلط، ونقل تعليق إلى لوحة PCR جديدة. ختم لوحة مع فيلم البارافين واحتضان لمدة ساعة واحدة في 55 درجة مئوية في ثيركلوسير. بعد الطرد المركزي أسفل حطام الخلية في السرعة القصوى لمدة 10 دقائق، نقل فائقة إلى لوحة PCR جديدة.إضافة 10 ميكرولترات من هذه الخلية lysate إلى كل بئر من 96 جيدا PCR لوحة مليئة 110 ميكرولترات من H2O المقطر، في بئر. ثم احتضان لمدة 10 دقائق في 99 درجة مئوية في thermocycler، لتنشيط البروتينات K.Use 2 microliters من هذه الخلية lysate كقالب واستخدام مزيج رئيسي PCR التجارية للفحص، والسيطرة والعمود الفقري PCR. تشغيل PCR لمدة 38 إلى 40 دورات من تضخيم PCR في شكل 96-جيدا.استخدام خمسة microliters من منتجات PCR وتشغيلها على 1.5٪ agarose TAE هلام لتحليل والجمع بين تدفق cytometry ونتائج PCR، لتأكيد استنساخ خلية واحدة. تم تأكيد التعبير الجيني لمراسل بعد PMA / Ionomycin التعريفي من قبل كل من تدفق استئصال الخلايا وPCR في أربعة إلى 12 ٪ من الخلايا ، اعتمادا على موقع التكامل. إن تحليل PCR للحمض النووي الجينومي باستخدام الزهَم الخماسية و الثلاثة اُبرى للدمج، يؤكد أن أحداث الاستهداف قد وقعت.بعد فحص استنساخ خلية واحدة لاستهداف الصحيح عن طريق تدفق cytometry، لوحظ استنساخ مع عالية ومنخفضة ولا التعبير الجيني مراسل الفلورسنت. كما تم تأكيد استنساخ خلايا واحدة من قبل PCR باستخدام التمهيديات الخاصة بمراسل معين وابتداخ التحكم. تم إنفاق المستنسخين المؤكدين إيجابيين في فحص PCR وتم تحليلهم بشكل أكبر من أجل الاستهداف الصحيح من قبل البقعة الجنوبية ، باستخدام مسبار خاص بمراسل ومسبار الجينوم الملزم خارج المراسل.أظهر جزء فقط أحجام النطاق الصحيح في تحليل البقعة الجنوبية وكان قد دمج المراسل بشكل غير ترددي ، مما يدل على أنه من المهم التحقق من نتائج PCR بواسطة لطخة الجنوبي. كما تم تحليل المستنسخات عن طريق التسلسل للتأكد من صحة النسخ الموجبة من الخلايا الواحدة. تسلسل الموقع المستهدف: أليل homologous، إذا كان المراسل لم تتكامل، وكشفت الطفرات التي تسببها Cas9.وبمجرد أن يتقن، يمكن إنجاز إنشاء خطوط مراسلي فيروس نقص المناعة البشرية في غضون شهرين إلى ثلاثة أشهر. قبل الاستهداف ، من المهم قضاء وقت كاف في اختيار موقع التكامل والمراسل المناسب ، اعتمادًا على سؤال البحث الذي ترغب في معالجته. ويمكن للمراسلين على سبيل المثال أن يشملوا عناصر تنظيمية مختلفة بشأن فيروس نقص المناعة البشرية إذا رغبت في ذلك.بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام خطوط الخلية على سبيل المثال، لاختبار تأثير عوامل تزايد زمن الوصول المختلفة على النشاط النسخي للمراسل LTR، اعتماداً على موقع التكامل الخاص به. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد التكامل موقع محدد فيروس نقص المناعة البشرية مراسل خطوط لتصميم دليل RNAs واستهداف ناقلات، وأداء CRISPR / Cas9 المستندة إلى هندسة الجينوم في خلايا jurkat، وإنتاج استنساخ خلية واحدة واختيار لاستنساخ المستهدفة بشكل صحيح من قبل FACS وفحص PCR. لا تنس، أنه إذا اخترت العمل مع مراسل فيروس نقص المناعة البشرية المختص بالتكرار، فأنت بحاجة إلى العمل في ظل ظروف السلامة BSL3.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...