Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
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我们感谢 britta wweeloh 和 bettina abel 的技术援助。我们还感谢 arne düsedau 和 jara hennesen (heinrich pette 研究所流式细胞术技术平台) 的技术支持。

1. 基因组工程的目标策略与定位向量 (tv) 设计
请注意:基因组工程的第一步是选择和生成必要的工具, 以实现 crispr-cas9 介导的目标。在这一步之前, 应选择基因组整合位点, 选择用于定位的细胞类型, 以及设计一个 hiv 衍生的整合记者。该协议描述了针对一个 hiv-ltr _ tdTomato _ bgh-pa 最小记者到 jurkat 目标细胞的目标。基于 crispr-cas9 的克隆线定位、生成、筛选和验证的工...

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	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

在这里, 我们描述了一个协议, 以生成 hiv-1 衍生 jurkat 记者模型与选择的天方集成站点应用基于 crispr-cas9 的基因组工程。
在规划阶段, 议定书的几个要点需要认真注意。首先, 应仔细选择要针对的位点, 因为某些位点可能比其他位点更容易瞄准 (例如,取决于区域的染色质状态和目标序列本身)。重复序列很难克隆到靶向载体中, 在基因组中通常不是唯一的。用 crispr-cas9 系?...

感染后将天分 dna 整合到宿主基因组中是人体免疫缺陷病毒 (hiv) 生命周期中的一个关键步骤。整合后, 艾滋病毒持续存在, 在长寿命 cd4+ t 细胞子集 (如记忆 cd4+ t 细胞) 中建立潜伏期。艾滋病毒的整合似乎不是随机的 1,2。通过对急性和慢性感染个体 2, 3,4的 整合位点进行测序, 在几项研究中发现了一些具有递归整合天方 dna 的基因组热点,5,6,7,8。有趣的是, 在其中一些整合位点中, 在很大一部分受感染的细胞中检测到相同的位点, 从而导致了在复发位点的整合可能会对克隆扩展 1产生积极影响的想法。
为了提高我们对经常性集成站点意义的认识, 必须探索天方集成站点的选择。然而, 若干技术方面阻碍了研究艾滋病毒整合地点的选择及其后果。广泛使用的用于艾滋病毒潜伏期的细胞培养模型, 如 jlat 细胞系, 并不反映临床相关的反复整合位点9。对初级患者衍生细胞的研究一方面, 可以通过测序来描述整合场地景观, 但不允许进行功能分析。据我们所知, 没有足够的实验模型可用于功能分析选定的临床相关的集成站点。
在这里, 我们提供了一个详细的工作流程, 以生成新的模型的艾滋病毒感染使用基于 crispr-cas9 为基础的基因组工程技术。本文描述的工作流程可用于生成 t 细胞衍生的病毒感染模型的记者细胞系, 在选定的集成站点携带基因整合的天方记者。因此, 它们是新的工具, 探讨天长整合站点如何影响艾滋病毒生物学, 以及天长如何应对不同的治疗策略 (例如,延迟反转剂的诱导性)。我们的方法利用了基于 crispr-cas9 的基因组工程的优势, 在目标位置上通过同源重组促进了记者序列的整合。根据对艾滋病毒感染者的研究和为 cas9 介导的基因组工程提供合适的 pam 图案的情况, 选择了整合的目标地点。
在我们的示范性结果中, 我们重点研究了 bach2 基因位点, 它编码为 btb 和 cnc 同源转录调节器2。在接受抗逆转录病毒治疗的慢性艾滋病毒感染者中, bach2 是显示艾滋病毒-1 综合序列3、6、7、8、10的丰富情况之一。我们选择了一个最低限度的艾滋病毒衍生的记者组成的 hiv-1-源长终端重复 (ltr), tdTomato 编码序列, 和牛生长激素 (bgh) 多腺苷信号 (pa), 我们已经针对两个特定的地点在 bovine 内含子5。该协议针对 jurkat 细胞进行了优化, jurkat 细胞是人类 cd4+ t 细胞衍生的悬浮细胞系, 但可以使用其他细胞系, 该协议也相应调整。我们提出了一个详细的工作流程, 选择目标地点, 构建目标载体与同源武器, crispr-cas9 介导的目标的记者进入选定的基因组站点, 生成和选择克隆线, 并进行综合验证新生成的、有针对性的记者细胞系。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

人类免疫缺陷病毒 (hiv) 将其非随机 dna 整合到复发地点和基因组热点的宿主细胞基因组中。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以生成新的体外模型的艾滋病毒感染与选定的基因组整合位点使用基于 crispr-cas9 的基因组工程技术。通过这种方法, 可以将选择的报告序列集成到有针对性的、选择的基因组位点中, 反映临床相关的整合位点。
该协议描述了 hiv 衍生记者的设计以及目标站点和 grna 序列的选择。构造了具有同源臂的靶向载体, 并将其转染到 jurkat t 细胞中。记者序列是针对选定的基因组位点的, 由在目标站点上的 cas9 介导的双链断裂促成的同源重组。通过流式细胞仪和 pcr 生成单细胞克隆并筛选靶向事件。然后展开选定的克隆体, 并通过 pcr、测序和南方印迹验证正确的靶向。分析了 crispr-cas9 介导的基因组工程的潜在离目标事件。
通过使用该协议, 可以生成在临床相关整合点模拟艾滋病毒感染的新细胞培养系统。尽管单细胞克隆的生成和正确的报告序列集成的验证是非常耗时的, 但由此产生的克隆线是功能上分析天方集成站点选择的强大工具。

在这个具有代表性的实验中, 我们选择了一个最小的 hiv-1 衍生的记者, 包括一个 ltr, ttomato 编码序列, 和多 a 信号序列到两个位点内含子5的bach2 基因17。根据在对感染艾滋病毒的患者 2,4, 5,6的原代 t 细胞进行不同研究时发现的已公布的复发整合位点的接近度, 选择了靶向定位位?...

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CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

我们提出了一个基因组工程工作流程, 用于生成新的 hiv-1 感染体外模型, 在选定的基因组站点重新构建天际整合。利用 crispr-cas9 介导的、特定地点的基因组操作, 为针对艾滋病毒来源的记者提供了便利。提供了单细胞克隆生成、筛选和正确目标验证的详细协议。

基于 crispr-cas9 的基因组工程, 用于生成 hiv-1 感染与选定的证明病毒整合点的 jurkat 报告模型

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

这种方法可以帮助回答艾滋病毒原病毒整合如何影响和性基因表达的问题，以及为什么某些基因组整合点被选择到最近HIV感染的细胞中。这项技术的主要优点是，可以生成HIV感染的体外模型，该模型使用基于CRISPR/Cas9的基因组工程，将亲病毒的测量仪靶向选定的整合地点。演示这个程序的将是托马斯·沃尔瑟，一个博士生，和朱莉娅·比亚莱克，一个博士后从我的实验室。首先使用 UCSC 基因组浏览器对所需的基因组位点进行硅内提取基因组序列。要选择 20 个核苷酸的指南 RNA 来定位所选基因组位点，请使用 E-CRISP 网络工具。然后选择，人类萨皮恩斯基因组参考联盟人类基因组：建立38。参考基因组作为生物体，输入2000个基因组序列碱基对，覆盖先前提取的所需基因组位点。使用任何 PAM 的中等应用设置开始引导 RNA 搜索，任何五基、非目标都允许不匹配和排除的内向和 CPG 孤岛。从显示的可能指南RNA设计的列表中，选择具有高分的引导RNA的特异性和效率，该指南RNA尽可能接近所需的基因组位点。打开 NCBI 爆炸浏览器，对参考基因组进行选定的指南RNA序列。要检查所选指南RNA结合位点的独特性，首先选择人类作为基因组，然后输入指南RNA序列作为查询序列。然后选择高度相似的序列或巨型爆炸作为程序，以确保引导RNA序列是唯一的。之后，从开始提取的基因组序列中选择1000个基对，上游和下游的引导RNA序列。使用这些选定的1000个碱基对，上游和下游作为五等和三等同臂，以目标向量构造和相邻的报告序列为目标。在转染的jurkat T细胞前24小时，为单个靶向实验准备一个完整的6井板。首先，每井有2.5毫升的RPMI 1640，没有抗生素，在2.5毫升的细胞中， 1，250，000个细胞。第二天，将圆形靶向量和两微克的Cas9和引导RNA表达质粒添加到每孔的250微升商用RPMI介质中，在反应管中，通过涡旋混合。然后缓慢地将12微升的转染剂加入DNA介质，而不接触管壁。轻拂管子，在室温下孵育15分钟。将混合物滴入一个细胞井中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞。转染72小时后，拉转染细胞，计数，并准备由FACS富集。在确认混合靶向细胞群体中的靶向事件后，通过提前制备由jurkat条件培养基开始生成单细胞克隆，从健康、未经治疗的jurkat T细胞中采集RPMI的抗生素。在 300 G 下将管离心 5 分钟，使用 0.22 微米过滤器将上清液过滤到新的 50 毫升锥形管中。计算以前由FACS富集的目标细胞，在扩张10至14天后，然后用抗生素在RPMI中稀释它们，浓度为每毫升10万细胞。用9.9毫升的介质稀释100微升的细胞，达到每毫升1000个细胞。然后用9毫升的中到浓度为每毫升100个细胞稀释一毫升。将 96 孔板板，每孔包含一个细胞，在无菌试剂库中，将 1 毫升 100 细胞/毫升溶液与 5 毫升条件介质和 4 毫升新鲜介质混合。然后，使用多通道移液器，每孔新96孔圆形底板添加100微升各细胞稀释，实现每孔稀释一个和两个细胞。堆叠 96 个孔板，用每孔包含 3 毫升 PBS 的六孔板覆盖每个孔。在加湿的培养箱中用5%的二氧化碳孵化板孵育三周。完成孵育后，目视地确认生长菌落的存在，使用四倍放大倍率的光显微镜，并标记与生长菌落的井。轻轻重新暂停一个通过移液标记良好的细胞。将该细胞悬浮液的 100 微升转移到一个新鲜准备的 96 孔圆形底板中，其中 100 微升的 RPMI 与抗生素，每孔并对所有标记的孔重复，通过移液轻轻混合。要复制板，请将该电池悬浮液的 100 微升转移到第二个空的 96 孔圆底板中，并对所有标记的孔重复此过程。最后，用200微升RPMI用抗生素填充空白井。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。重复板孵育24至48小时后，通过在每一个井中加入100微升的RPMI和抗生素，再次复制。使用多通道移液器轻轻混合，将 100 微升转移到新 96 井圆底板的每个井中。将这两个重复的板之一放在培养箱中。使用第二个新的重复板流动细胞学，首先添加五微升的PMA/Ionomycin主混合每孔，以刺激细胞。孵育24小时，并准备细胞流动细胞测量，如文本所述。根据向前和侧散射的大小，将任何可行的单个细胞栅极。通过流式细胞学分析荧光记者基因表达。要按PCR筛选单细胞克隆，设计底源P5和P6，根据所选的检测器序列筛选PCR，放大500到800个应报序列的基对。对于正对PCR，设计底源P7和P8，可放大野生型非靶向基因组位点630个碱基对。设计第三个底像对，放大目标向量主干的 500 到 600 个基对，作为目标向量主干序列非特异性集成的控制。一旦第二个重复板中的克隆足够生长，在室温下先在300-G下离心10分钟，为PCR筛查做好准备。小心地取出上一液，确保不要干扰细胞颗粒。用100微升PBS洗涤细胞，通过轻轻移液，在室温下在300G下离心5分钟。拆下 PBS，每井添加 200 微升的解液缓冲液。轻轻混合，将悬挂转移到新的PCR板。用石蜡膜密封板，在55摄氏度的热循环器中孵育一小时。以最大速度离心 10 分钟后，将上经液转移到新的 PCR 板上。在每井中，每井都加入10微升的细胞，将每井充满110微升的蒸馏H2O的PCR板的每一个井中。然后在99摄氏度的热循环中孵育10分钟，以灭活蛋白酶K.使用该细胞的2微升作为模板，并使用商用PCR主混合物进行筛选、控制和骨干PCR。以 96 井格式运行 PCR，进行 38 到 40 个周期的 PCR 放大。使用五微升的PCR产品，并在1.5%的阿加罗斯TAE凝胶上运行，以分析和结合流式细胞学和PCR结果，以确认单细胞克隆。记者基因表达后PMA/Ionomycin诱导被确认的流动细胞学和PCR在4至12%的细胞，取决于整合位点。利用五等和三等融合交汇点的基因组DNA的PCR分析，证实发生了靶向事件。在通过流细胞学对单细胞克隆进行正确靶向筛选后，观察到高、低、无荧光检测器基因表达的克隆。PCR 也使用特定于记者的底向器和控制底向器确认了单细胞克隆。克隆在筛选PCR中确认为阳性，使用记者特异性探针和记者外部的基因组探针结合，对南方印迹的正确靶向进行了进一步分析。只有一部分在南方印迹分析中显示了正确的波段大小，并且与记者进行了异质整合，这表明通过南方印迹验证PCR结果很重要。克隆也通过测序进行分析，以进一步确认阳性的单细胞克隆。目标位点测序：同源等位基因，被记者未整合，揭示了Cas9诱发的突变。一旦掌握，艾滋病毒记者线的生成可以在两到三个月内完成。在定位之前，根据您要处理的研究问题，在适当的记者中花费足够的时间选择集成站点非常重要。例如，如果需要，记者可以包括不同的艾滋病毒监管要素。按照此过程，单元系可用于测试不同延迟上升代理对报告器 LTR 的转录活动的影响，具体取决于其集成站点。观看此视频后，您应该清楚地了解如何生成集成站点特定的 HIV 报告线，以便设计指南 RNA 和靶向载体、在 jurkat 细胞中执行基于 CRISPR/Cas9 的基因组工程、生成单细胞克隆以及通过 FACS 和 PCR 筛选选择正确的靶向克隆。不要忘记，如果您选择使用具有复制功能的 HIV 报告服务器，则需要在 BSL3 安全条件下工作。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

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