Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Vi takker Britta Weseloh og Bettina Abel for teknisk bistand. Vi takker også Arne Düsedau og Jana Hennesen (flow flowcytometri teknologiplatform, Heinrich Pette Institut) for teknisk support.

1. målretning strategi for genom Engineering og målretning vektor (tv) Design
Bemærk: Det første trin i genom engineering involverer udvælgelse og generation de nødvendige værktøjer for CRISPR-Cas9-medieret målretning. Valg af en genomisk integration site locus, valg af celletype for målretning og design af en HIV-afledte reporter for integration bør gå forud for dette trin. Denne protokol beskriver målretning af en HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA minimal reporter i Jurkat ...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Her, beskriver vi en protokol til at generere HIV-1-afledt Jurkat reporter modeller med valgte proviral integration websteder anvender CRISPR-Cas9-baseret genom engineering.
Flere punkter i protokollen kræver omhyggelig opmærksomhed i planlægningsfasen. Først, locus skal målrettes skal vælges omhyggeligt, som kan være lettere at målrette end andre, nogle loci (f.eks., afhængigt af regionen og målet kromatin status sekvens sig selv). Gentagne sekvenser er svært at klone i de...

Integration af proviral DNA i vært genom ved infektion er et kritisk skridt i livscyklus af human immundefekt virus (HIV). Efter integrationen fortsætter HIV ved at etablere ventetid i langlivede CD4 + T celle subsets som memory CD4 + T-celler. HIV integration synes at være ikke-tilfældige1,2. En række af genomisk hotspots med jævne integreret proviral DNA er blevet påvist i flere undersøgelser gennem sekventering af integration websteder i akut og kronisk smittede personer2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, på nogle af disse websteder, integration, blev den samme locus fundet i en stor del af inficerede celler, fører til tanken om, at integration på tilbagevendende steder positivt kan påvirke klonal ekspansion1.
For at fremme vores forståelse af betydningen af tilbagevendende integration websteder, skal proviral integration site valg udforskes. Dog flere tekniske aspekter hæmme studere HIV integration site valg og konsekvenserne. Generelt anvendes celle kultur modeller for HIV latency gerne JLat cellelinjer ikke afspejler klinisk relevante tilbagevendende integration websteder9. Undersøgelser på primære patient-afledte celler, på den ene side aktiverer beskrivelse af integration site landskab af sekventering men tillader ikke for funktionelle analyser. Til vores viden er ingen passende eksperimentel model tilgængelig for funktionelt analysere udvalgte klinisk relevante integration lokaliteter.
Her præsenterer vi en detaljeret arbejdsproces for at generere nye modeller for HIV-smitte ved hjælp af CRISPR-Cas9-baseret genom engineering technology. Arbejdsprocessen beskrevet heri kan bruges til at generere T-celle-afledte reporter cellelinjer, der model hivinfektion, transporterer gentisk integreret proviral reporter på en valgte integration site. De dermed tjener som nye værktøjer til at undersøge hvordan webstedet proviral integration kan påvirke HIV biologi og hvordan provirus reagerer på forskellige behandling strategier (f.eks., inducibility af latency baglænskørsel agenter). Vores metode bruger fordelene ved CRISPR-Cas9-baseret genom engineering, som integrationen af journalisten sekvens af homologe rekombination lettes ved en Cas9 nukleasen-induceret dobbelt-strenget pause på destinationsstedet. Målwebsteder for integration er udvalgt efter nærhed til de beskrevne tilbagevendende integration websteder fra undersøgelser af HIV-smittede individer og tilstedeværelsen af egnet PAM motiver for Cas9-medieret genom engineering.
I vores eksemplarisk resultater, har vi fokuseret på BACH2 gen locus, som koder for BTB og CNC homologi transcriptional regulator 2. I kronisk HIV-smittede personer på antiretroviral behandling er BACH2 en af de loci viser berigelse af integrerede HIV-1 sekvenser3,6,7,8,10. Vi har valgt en minimal HIV-afledte reporter bestående af HIV-1-afledt lange terminal Gentag (LTR), tdTomato kodende sekvens og kvæg væksthormon (BGH) polyadenylation signal (PA), som vi har rettet mod to specifikke websteder i BACH2 intron 5. Præsenteres protokollen er optimeret til Jurkat celler, en menneskelig CD4 + T-celle-afledte suspension cellelinie, men andre celle linjer kan bruges og protokollen tilpasset i overensstemmelse hermed. Vi præsenterer en detaljeret arbejdsproces for udvælgelse af mål-webstedet, opførelsen af target vektor med homologi arme, CRISPR-Cas9-medieret målretning af reporter i den valgte genomisk site, generation og udvælgelse af klonede linjer, og omfattende kontrol af nyligt genererede, målrettet reporter cellelinjer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

Human immundefekt virus (HIV) integrerer sin proviral DNA ikke tilfældigt i vært celle genom på tilbagevendende sites og genomisk hotspots. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generation af nye in vitro-modeller for HIV-smitte med valgte genomisk integration websteder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baseret genom engineering technology. Med denne metode, kan en reporter sekvens af valget integreres i en målrettet, valgte genomisk locus, reflekterende klinisk relevante integration websteder.
I protokollen, er design af en HIV-afledte reporter og valg af en destination site og gRNA sekvens beskrevet. En målretning vektor med homologi våben er bygget og transfekteret i Jurkat T-celler. Reporter sekvens er målrettet til den valgte genomisk site af homologe rekombination lettes ved en Cas9-medieret dobbelt-strenget pause på destinationsstedet. Encellede kloner er genereret og screenes for målretning begivenheder ved flowcytometri og PCR. Udvalgte kloner er derefter udvidet, og korrekte målretning bekræftes ved PCR, sekventering og sydlige blotting. Potentielle off target begivenhederne i CRISPR-Cas9-medieret genom engineering er analyseret.
Denne model hivinfektion på klinisk relevante integration websteder kan genereres ved hjælp af denne protokol, Roman celle kultur systemer. Selv om generation af encellede kloner og verifikation af korrekte reporter sekvens integration er tidskrævende, er de resulterende klonede linjer kraftfulde værktøjer til funktionelt analysere proviral integration site valg.

I denne repræsentative eksperiment har vi valgt at målrette en minimal HIV-1-afledt reporter bestående af en LTR, tdTomato-kodende sekvens, og polyA-signal sekvensen til to loci i intron 5 af BACH2 gen17. Loci for målretning blev udvalgt efter nærhed til offentliggjorte tilbagevendende integration steder fundet i forskellige undersøgelser på primære T celler fra HIV-inficerede patienter2,4,</su...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Vi præsenterer en genom engineering arbejdsgang for generation af nye in vitro-modeller for HIV-1 infektion, at sammenfatte proviral integration på udvalgte genomisk lokaliteter. Målretning af HIV-Afledte reportere lettes ved CRISPR-Cas9-medieret, lokationsspecifikke genom manipulation. Der findes detaljerede protokoller for encellede klon generation, screening og korrekte målretning verifikation.

CRISPR-Cas9-baseret genom Engineering til at generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 infektion med udvalgte Proviral Integration websteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare spørgsmålet om, hvordan HIV provirus integration påvirker androgyne genekspression, og hvorfor visse genomiske integrationssteder er ved at blive udvalgt i sidst HIV-inficerede celler. Den største fordel ved denne teknik er, at in vitro-modeller for hiv-infektion kan produceres, som bærer pro-virale journalister målrettet til udvalgte integrationssteder ved hjælp af CRISPR/Cas9-baserede genom engineering. Demonstrere proceduren vil være Thomas Walther, en ph.d.-studerende, og Julia Bialek, en postdoc fra mit laboratorium.Begynd med at bruge UCSC Genome Browser til in-silico-ekstrakt den genomiske sekvens af den ønskede genomiske locus, der skal målrettes. Hvis du vil vælge guide RNA'er med 20 nukleotider til målretning af den valgte genomiske locus, skal du bruge E-CRISP webværktøj. Vælg derefter Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.Reference genom som organismen og input 2, 000 base par af den genomiske sekvens, der dækker den ønskede genomiske locus tidligere udvundet. Start en guide-RNA-søgning ved hjælp af medium programindstillinger med enhver PAM, enhver fem-prime-base, off-mål tolerere uoverensstemmelser og udelukket introder og CPG øer. Fra listen med mulige guide-RNA design, der vises, skal du vælge et guiderna med en høj score for specificitet og effektivitet, som er tæt som muligt på den ønskede genomiske locus, der skal målrettes.Åbn NCBI Blast-browseren for at sprænge den valgte guide-RNA-sekvens mod referencegenomet. Hvis du vil kontrollere, om det valgte guide-RNA-bindingssted er unikt, skal du først vælge mennesket som genom og derefter indtaste guide-RNA-sekvensen som forespørgselssekvensen. Vælg derefter meget ens sekvenser eller Mega Blast som program for at sikre, at guide-RNA-sekvensen er unik.Derefter skal du vælge in-silico 1, 000 base par, opstrøms og nedstrøms for guide-RNA sekvens fra genomisk sekvens ekstraheret i begyndelsen. Brug disse udvalgte 1,000 base par, opstrøms og nedstrøms som fem-prime og tre-prime homologi arme til målretning vektor konstruktion og tilstødende reporter sekvens, der skal målrettes. 24 timer før transfektion af jurkat T-celler, forberede en komplet 6-brønd plade af cellerne for en enkelt målretning eksperiment.For at starte, plade 1, 250, 000 celler i 2,5 milliliter RPMI 1640 med kosttilskud og uden antibiotika, per brønd. Den følgende dag, tilføje til mikrogram cirkulær målretning vektor og to mikrogram Cas9 og guide-RNA udtryk plasmid per brønd, til 250 mikroliter af kommercielle RPMI medium optimeret til transfektion, i en reaktion rør og bland godt ved vortexing. Derefter langsomt tilføje 12 mikroliter transfektion agent til DNA-mediet uden at røre væggen i røret.Svirp røret og inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt blandingen dropwise til en brønd af celler. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Og 72 timer efter transfektion, trække de transficerede celler, tælle dem og forberede berigelse af FACS. Efter at have bekræftet målretningshændelserne i den blandede målrettede cellepopulation, skal du begynde at generere encellekloner ved at forberede jurkat-konditioneret medium på forhånd ved at indsamle RPMI med antibiotika fra sunde, ubehandlede jurkat T-celler. Centrifuge rørene i 5 minutter ved 300 G, og filtrer supernatanten med en 25 millilitersprøjte ved hjælp af et 0,22 mikrometerfilter i nye 50 milliliter koniske rør.Tæl de målrettede celler, der tidligere blev beriget med FACS, 10 til 14 dage efter udvidelsen, og fortynde dem derefter i RPMI med antibiotika til en koncentration på 100.000 celler pr. milliliter. 100 mikroliter af denne cellefortynding fortyndes med 9,9 milliliter medium for at opnå 1.000 celler pr. milliliter. Derefter fortyndes en milliliter af denne fortynding med ni milliliter medium til en koncentration på 100 celler pr. milliliter.Til plade 96 brøndplader til at indeholde en celle pr brønd, bland forsigtigt en milliliter 100-celler-per-milliliter opløsning med fem milliliter tilstand medium og fire milliliter frisk medium, i en steril reagens reservoir. Brug derefter en multikanalpipette til at tilføje 100 mikroliter af den respektive cellefortynding pr. brønd af nye 96-brøndrunde bundplader for at opnå en og to celler pr. brøndfortynding. Stable de 96 brøndplader og dække hver stak med en seks-brønd plade, der indeholder tre milliliter PBS per brønd.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid, i tre uger. Efter afsluttet inkubation, visuelt bekræfte tilstedeværelsen af dyrkede kolonier ved hjælp af lys mikroskopi med fire gange forstørrelse, og markere brønde med dyrkede kolonier. Forsigtigt resuspenderede celler af en markeret godt ved pipettering.Overfør 100 mikroliter af denne celle suspension i en brønd af frisklavet 96-godt rund bundplade med 100 mikroliter RPMI med antibiotika, per brønd og gentag for alle markerede brønde, bland forsigtigt ved pipettering. For at duplikere pladen skal du overføre 100 mikroliter af denne cellesuspension til en anden tom, 96-brønd rundbundsplade og gentage denne proces for alle markerede brønde. Endelig fylde de tomme brønde med 200 mikroliter af RPMI med antibiotika.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter duplikeret plade er inkuberet i 24 til 48 timer duplikere det igen ved at tilføje 100 mikroliter af RPMI med antibiotika til hver brønd. Brug en multi-kanal pipette til at blande forsigtigt og overføre 100 mikroliter til hver brønd af en ny 96-brønd rund-bund plade.Anbring en af disse to dobbeltplader i inkubatoren. Brug den anden af de nye dublerede plader til flow cytometri, ved først at tilføje fem mikroliter PMA / Ionomycin Master Mix per brønd, at stimulere cellerne. Inkuber i 24 timer, og forbered cellerne til flowcytometri som beskrevet i teksten.Gate eventuelle levedygtige enkeltceller baseret på størrelse i fremad og sidegående scatter. Analysér fluorescerende reporter-genekspression ved flowcytometri. For at screene encellede kloner af PCR, skal du designe primere P5 og P6 til screening PCR baseret på den valgte reportersekvens for at forstærke 500 til 800 basispar i reportersekvensen.For positiv kontrol PCR, design primere P7 og P8, der forstærker 630 base par af en vild-type, ikke-målrettet genomisk locus. Design et tredje primerpar, der forstærker 500 til 600 basispar i målvektorens rygrad som en kontrol for uspecifik integration af målretningsvektorens rygradssekvenser. Når klonerne i den anden dobbelte plade er vokset tilstrækkeligt, forberede dem til PCR screening ved først centrifugering pladen i 10 minutter ved 300-G ved stuetemperatur.Tag forsigtigt supernatanten af, og sørg for ikke at forstyrre cellepellet. Cellerne vaskes med 100 mikroliter PBS ved skånsom pipettering, der centrifugeres med pladen i fem minutter ved 300 G ved stuetemperatur. Fjern PBS og tilsæt 200 mikroliter lysis buffer per brønd.Pipette forsigtigt at blande, og overføre suspensionen til en ny PCR plade. Forsegle pladen med paraffin film og inkubere i en time ved 55 grader Celsius i en termocykator. Efter centrifugering ned celle snavs ved maksimal hastighed i 10 minutter, overføre supernatant til en ny PCR plade.Tilføj 10 mikroliter af denne celle lysat til hver brønd af en 96-brønd PCR plade fyldt med 110 mikroliter af destilleret H2O, per brønd. Derefter inkuberes i 10 minutter ved 99 grader Celsius i en thermocycler, at inaktivere proteinase K.Use 2 mikroliter af denne celle lysate som en skabelon og bruge en kommerciel PCR master mix til screening, kontrol og rygrad PCR. Kør PCR i 38 til 40 cyklusser af PCR forstærkning i en 96-godt format.Brug fem mikroliter af PCR-produkter og køre dem på en 1,5% agarose TAE gel til at analysere og kombinere flow cytometri og PCR resultater, for at bekræfte enkelt celle kloner. Reporter-genekspression efter PMA/Ionomycininduktion blev bekræftet af både flowcytometri og PCR i fire til 12% af cellerne, afhængigt af integrationsstedet. PCR analyse af genomisk DNA ved hjælp af primere for fem-prime og tre-prime integration krydset, bekræfte, at målretning begivenheder har fundet sted.Efter screening af encellede kloner for korrekt målretning efter flow cytometri, kloner med høj, lav og ingen fluorescerende reporter genekspression blev observeret. Single cell kloner blev også bekræftet af PCR ved hjælp af reporter-specifikke primere og kontrol primere. Kloner bekræftet positiv i screening PCR blev brugt og yderligere analyseret for korrekt målretning af Southern blot, ved hjælp af en reporter-specifik sonde og en genomisk-sonde bindende uden for reporter.Kun en del viste korrekte båndstørrelser i Southern blot analyse og havde heterozygously integreret reporter, viser, at det er vigtigt at kontrollere PCR resultater ved Southern blot. Kloner blev også analyseret ved sekventering for yderligere at bekræfte positive encellede kloner. Sekventering af målet site: homologal allel, var reporter ikke havde integreret, afslørede Cas9-induceret mutationer.Når mestrer, generation af HIV reporter-linjer kan opnås i to til tre måneder. Før målretning er det vigtigt at bruge nok tid på at vælge et integrationswebsted hos og relevant reporter, afhængigt af det forskningsspørgsmål, du gerne vil tage fat på. Journalister kan for eksempel medtage forskellige hiv-reguleringselementer, hvis det ønskes.Efter denne procedure kan cellelinjer for eksempel bruges til at teste effekten af forskellige latency stigende agenter på transskriptionel aktivitet af reporter LTR, afhængigt af dens integration site. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man genererer integration-site-specifikke HIV reporter-linjer til at designe guide RNAs og målretning vektor, der udfører CRISPR / Cas9-baserede genom teknik i jurkat celler, der producerer enkelt celle kloner og vælge til korrekt målrettede kloner af FACS og PCR screening. Glem ikke, at hvis du vælger at arbejde med en replikation-kompetent HIV reporter, skal du arbejde under BSL3 sikkerhedsforhold.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating af HIV-1 kerner

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Scanning af HIV-1 Envelope-induceret Virologisk Synapse og signaler på syntetiske lipiddobbeltlagenes

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nye værktøjer til at udvide regulatoriske T celler fra HIV-1-inficerede personer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering af Exosomer fra plasma af HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering af HIV-1 Gag binding til Giant unilamellare vesikel (GUV) Membraner

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering af effekt og toksicitet af RNA Målretning HIV-1 Produktion til brug i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...