Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Wij danken Britta Weseloh en Bettina Abel voor technische bijstand. Wij danken ook Arne Düsedau en Jana Hennesen (stroom cytometry technologieplatform, Heinrich-Pette Institut) voor technische ondersteuning.

1. gericht op de strategie voor genoom Engineering en Targeting Vector (tv)-ontwerp
Opmerking: De eerste stap van genoom engineering impliceert selectie en generatie van de nodige instrumenten voor CRISPR-Cas9-gemedieerde targeting. Selectie van een genomic integratie site locus, keuze van celtype voor targeting, en het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever voor integratie moeten voorafgaan aan deze stap. Dit protocol beschrijft doelgerichtheid van een HIV-LTR_tdTomato_BGH-...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van HIV-1-afgeleide Jurkat verslaggever modellen met gekozen proviraal integratie sites CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering toe te passen.
Verschillende punten van het protocol vereist zorgvuldige aandacht tijdens de planningsfase. Ten eerste de locus worden gericht moet worden zorgvuldig gekozen, zoals sommige loci gemakkelijker te richten dan anderen wellicht (bijvoorbeeld, afhankelijk van de status van de chromatine van de r...

Integratie van proviraal DNA in het genoom van de host na infectie is een cruciale stap in de levenscyclus van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). Na de integratie, HIV blijft door de oprichting van latentie in langlevende CD4 + T cel subsets zoals geheugen CD4 + T cellen. HIV integratie lijkt te zijn non-random1,2. Een aantal genomic hotspots met productlevering geïntegreerde proviraal DNA is vastgesteld in verschillende studies door de sequencing van integratie sites in acuut en chronisch geïnfecteerde individuen2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, werd sommige van deze sites van de integratie, de zelfde locus gedetecteerd in een groot deel van de geïnfecteerde cellen, wat leidt tot het idee dat integratie op terugkerende sites klonale uitbreiding1positief kan beïnvloeden.
Om te gaan ons begrip van de betekenis van terugkerende integratie sites, moet proviraal integratie site keuze worden onderzocht. Echter, verschillende technische aspecten bestuderen HIV integratie belemmeren site keuze en de gevolgen. In grote lijnen gebruikt cel cultuur modellen voor HIV latentie zoals JLat cellijnen niet klinisch relevante terugkerende integratie sites9 weerspiegelen. Studies over primaire patiënt-afgeleide cellen, aan de ene kant, beschrijving van integratie site landschap inschakelen door sequentiebepaling maar laat niet voor functionele analyses. Om onze kennis is geen voldoende experimentele model beschikbaar voor de geselecteerde klinisch relevante integratie sites functioneel te analyseren.
Hier presenteren we een gedetailleerd workflow voor het genereren van nieuwe modellen voor HIV-infectie met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. De hierin beschreven werkstroom kan worden gebruikt voor het genereren van verslaggever T cel-afgeleide cellijnen die model van HIV-infectie, uitvoering van een genomically geïntegreerde proviraal verslaggever bij een gekozen integratie-site. Ze zijn dus nieuwe instrumenten te onderzoeken hoe de site proviraal integratie kan invloed hebben op HIV biologie en hoe de provirus reageert op verschillende behandelingsstrategieën (b.v., inducibility door latency achteruitrijlicht agenten) bijeenkomen. Onze methode maakt gebruik van de voordelen van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom techniek, in welke integratie van de verslaggever opeenvolging van homologe recombinatie wordt vergemakkelijkt door een Cas9 nuclease-geïnduceerde dubbele-strand break op de doelsite. Doel sites voor integratie zijn gekozen op basis van nabijheid van de sites beschreven terugkerende integratie van studies over HIV-geïnfecteerde individuen en de aanwezigheid van geschikte PAM motieven voor Cas9-gemedieerde genoom engineering.
In onze voorbeeldige resultaten, hebben we gericht op de BACH2 gen locus, welke codes voor de BTB en CNC homologie transcriptionele regulator 2. In chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie is BACH2 een van de loci verrijking van geïntegreerde HIV-1 sequenties3,6,7,8,10te tonen. Wij hebben een minimale HIV-afgeleide verslaggever bestaande van HIV-1-afgeleide lange terminal herhalen (LTR), tdTomato codering sequentie, en groeihormoon voor runderen (BGH) polyadenylatie signaal (PA), die we hebben gericht op twee specifieke sites in BACH2 intron 5 gekozen. Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor Jurkat cellen, een menselijke CD4 + T cel-afgeleide schorsing cellijn, maar andere cel lijnen kunnen worden gebruikt en het protocol aangepast. We presenteren een gedetailleerde workflow voor selectie van de doelsite, bouw van doel vector met homologie armen, CRISPR-Cas9-gemedieerde doelgerichtheid van de verslaggever in de gekozen genomic locatie, de generatie en de selectie van klonen lijnen en uitgebreide verificatie van de nieuw gegenereerde, gerichte verslaggever cellijnen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) integreert zijn proviraal DNA niet-willekeurig in het genoom van de cel host op terugkerende sites en genomische hotspots. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van nieuwe in vitro modellen voor HIV-infectie met gekozen genomic integratie sites met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. Met deze methode kan een verslaggever opeenvolging van keuze worden geïntegreerd in een gerichte, gekozen genomic locus, als gevolg van de integratie van klinisch relevante sites.
In het protocol, worden het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever en kiezen voor een doel-site en gRNA-sequence beschreven. Een targeting vector met homologie armen is gebouwd en in Jurkat T cellen transfected. De verslaggever-reeks is gericht op de geselecteerde genomic site door homologe recombinatie vergemakkelijkt door een Cas9-gemedieerde dubbel-strand break op de doelsite. Eencellige klonen zijn gegenereerd en gescreend voor het targeten van gebeurtenissen door stroom cytometry en PCR. Geselecteerde klonen zijn dan uitgebreid en de juiste targeting is geverifieerd door PCR, sequencing en Southern blotting. Potentiële uit doelsoort zijn gebeurtenissen van CRISPR-Cas9-gemedieerde genoom engineering worden geanalyseerd.
Met behulp van dit protocol, de nieuwe cel cultuur systemen kan dat model HIV-infectie op klinisch relevante integratie sites worden gegenereerd. Hoewel de generatie van eencellige klonen en verificatie van de juiste verslaggever reeks integratie tijdrovend is, zijn de resulterende klonale lijnen krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van functioneel proviraal integratie site keuze.

In dit representatieve experiment hebben wij besloten te richten op een minimale HIV-1-afgeleide verslaggever die bestaat uit een LTR, volgorde tdTomato-codering en polyA-signaal volgorde naar twee loci in intron 5 van de BACH2 gen17. De loci voor targeting werden gekozen op basis van nabijheid naar gepubliceerde terugkerende integratie sites gevonden in verschillende studies op primaire T-cellen van HIV-geïnfecteerde patiënten2,</sup...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de vraag hoe HIV provirus integratie beïnvloedt androgyne genexpressie, en waarom bepaalde genomische integratie sites worden geselecteerd in de laatste tijd HIV-geïnfecteerde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat in-vitro modellen voor HIV-infectie kunnen worden geproduceerd, die pro-virale verslaggevers gericht op gekozen integratie sites met behulp van CRISPR / Cas9-gebaseerde genoom engineering. Het aantonen van de procedure zal Thomas Walther, een promovendus, en Julia Bialek, een postdoc uit mijn laboratorium.Begin met het gebruik van UCSC Genome Browser om in-silico-extract de genomische sequentie van de gewenste genomische locus worden gericht. Gebruik E-CRISP webtool om gids RNAs van 20 nucleotiden te kiezen voor targeting van de gekozen genomische locus. Selecteer vervolgens, Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.Referentiegenoom als het organisme en input 2.000 basisparen van de genomische sequentie, die de gewenste genomische locus eerder geëxtraheerd. Start een gids-RNA-zoekopdracht met behulp van medium applicatie-instellingen met een PAM, elke vijf-prime-base, off-targets tolereren mismatches en uitgesloten intronen en CPG-eilanden. Selecteer uit de lijst met mogelijke guide-RNA-ontwerpen die verschijnt een gidsRNA met een hoge score voor specificiteit en efficiëntie, die zo dicht mogelijk bij de gewenste genomische locus ligt die moet worden gericht.Open de NCBI Blast-browser om de gekozen gids-RNA-sequentie tegen het referentiegenoom te blazen. Als u wilt controleren op uniciteit van de geselecteerde bindingssite guide-RNA, selecteert u eerst de mens als genoom en voert u vervolgens de volgorde van de gids-RNA in als de querysequentie. Selecteer vervolgens zeer vergelijkbare sequenties of Mega Blast als het programma om ervoor te zorgen dat de gids-RNA-reeks uniek is.Selecteer daarna in-silico 1,000 basisparen, stroomopwaarts en stroomafwaarts van de richt-RNA-sequentie van genomische sequentie die aan het begin is geëxtraheerd. Gebruik deze geselecteerde 1.000 basisparen, stroomopwaarts en stroomafwaarts als vijf-prime en drie-prime homologie armen voor het richten van vector constructie en aangrenzende reporter sequentie worden gericht. 24 uur voor de transfectie van jurkat T-cellen, bereid een complete 6-well plaat van de cellen voor een enkele targeting experiment.Om te beginnen, plaat 1, 250, 000 cellen in 2,5 milliliter RPMI 1640 met supplementen en zonder antibiotica, per goed. Op de volgende dag, toe te voegen aan microgram van circulaire targeting vector en twee microgram van Cas9 en gids-RNA expressie plasmid per goed, tot 250 microliters van commerciële RPMI medium geoptimaliseerd voor transfectie, in een reactie buis en meng goed door vortexing. Voeg vervolgens langzaam 12 microliter transfectiemiddel toe aan het DNA-medium zonder de wand van de buis aan te raken.Veeg de buis en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg het mengsel dropwise aan een put van cellen. Broed de cellen uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.En 72 uur na transfectie, trek de transfected cellen, tel ze en voor te bereiden op verrijking door FACS. Na het bevestigen van de targeting gebeurtenissen in de gemengde gerichte cel populatie, beginnen met het genereren van eencellige klonen door de voorbereiding van jurkat-geconditioneerde medium op voorhand, door het verzamelen van RPMI met antibiotica uit gezonde, onbehandelde jurkat T-cellen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op 300 G en filter de supernatant met een spuit van 25 milliliter, met behulp van een filter van 0,22 micrometer in nieuwe, 50 milliliter conische buizen.Tel de beoogde cellen die eerder door FACS zijn verrijkt, 10 tot 14 dagen na de expansie, en verdun ze vervolgens in RPMI met antibiotica tot een concentratie van 100.000 cellen per milliliter. Verdun 100 microliter van deze celverdunning met 9,9 milliliter medium om 1.000 cellen per milliliter te bereiken. Verdun vervolgens een milliliter van deze verdunning met negen milliliter medium tot een concentratie van 100 cellen per milliliter.Om plaat 96 put platen om een cel per goed bevatten, voorzichtig meng een milliliter van 100-cellen-per-milliliter oplossing met vijf milliliter van conditie medium en vier milliliter van vers medium, in een steriel reagens reservoir. Gebruik vervolgens een multi-channel pipet om 100 microliter van de respectievelijke celverdunning per put van nieuwe 96-goed ronde bodemplaten toe te voegen om een en twee cellen per putverdunning te bereiken. Stapel de 96 putplaten en bedek elke stapel met een zes-put plaat met drie milliliter PBS per put.Incubeer de platen op 37 graden Celsius in een bevochtigde couveuse met 5% kooldioxide, gedurende drie weken. Na voltooide incubatie, visueel bevestigen de aanwezigheid van volwassen kolonies met behulp van lichte microscopie met vier keer vergroting, en markeer de putten met volwassen kolonies. Voorzichtig resuspend cellen van een goed gemarkeerd door pipetting.Breng 100 microliter van deze celsuspensie over in een put van vers bereide 96-goed voorbereide bodemplaat met 100 microliters RPMI met antibiotica, per goed en herhaal voor alle gemarkeerde putten, meng voorzichtig door pipetteren. Om de plaat te dupliceren, breng je 100 microliters van deze celsuspensie over in een tweede lege, 96-goed ronde bodemplaat en herhaal dit proces voor alle gemarkeerde putten. Tot slot, vul de lege putten met 200 microliters van RPMI met antibiotica.Broed de platen uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Nadat de dubbele plaat 24 tot 48 uur is geïncubeerd, dupliceert u deze opnieuw door 100 microliter RPMI met antibiotica toe te voegen aan elke put. Gebruik een multi-channel pipet om voorzichtig te mengen en 100 microliters over te brengen naar elke put van een nieuwe 96-well ronde bodemplaat.Plaats een van deze twee dubbele platen in de couveuse. Gebruik de tweede van de nieuwe dubbele platen voor flow cytometrie, door eerst vijf microliters van PMA/Ionomycine Master Mix per put toe te voegen, om de cellen te stimuleren. 24 uur incuberen en de cellen voorbereiden op stroomcytometrie zoals beschreven in de tekst.Poort alle levensvatbare enkele cellen op basis van grootte in voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. Analyseer fluorescerende reporter genexpressie door flow cytometrie. Om eencellige klonen te screenen op PCR, ontwerp primers P5 en P6 voor het screenen van PCR op basis van de gekozen reporter-reeks, om 500 tot 800 basisparen van de reportersequentie te versterken.Voor positieve controle PCR, ontwerp primers P7 en P8 dat 630 basisparen van een wild-type, niet-gerichte genomische locus versterkt. Ontwerp een derde primerpaar dat 500 tot 600 basisparen van de targeting-vector backbone versterkt als een controle voor niet-specifieke integratie van targeting-vector backbone sequenties. Zodra de klonen in de tweede dubbele plaat voldoende zijn gegroeid, bereid ze voor op PCR-screening door de plaat eerst 10 minuten te centrifugeren bij 300-G bij kamertemperatuur.Neem voorzichtig de supernatant af, om ervoor te zorgen dat de celpellet niet wordt verstoord. Was de cellen met 100 microliters PBS door zachte pipetting, centrifugeren de plaat gedurende vijf minuten op 300 G bij kamertemperatuur. Verwijder de PBS en voeg 200 microliters lyse buffer per put.Pipette voorzichtig te mengen, en breng de schorsing naar een nieuwe PCR plaat. Verzegel de plaat met paraffinefolie en incubbate gedurende een uur bij 55 graden Celsius in een thermocycler. Nadat u celpuin met maximale snelheid gedurende 10 minuten hebt gecentrifugd, brengt u de supernatant over naar een nieuwe PCR-plaat.Voeg 10 microliter van deze cel lysaat aan elke put van een 96-well PCR plaat gevuld met 110 microliters van gedistilleerde H2O, per put. Vervolgens 10 minuten incumeren bij 99 graden Celsius in een thermocycler, om proteinase K.Use 2 microliters van dit cellysaat als sjabloon te activeren en gebruik een commerciële PCR master mix voor screening, controle en backbone PCR. Voer PCR uit voor 38 tot 40 cycli van PCR-versterking in een 96-put formaat.Gebruik vijf microliter pcr-producten en voer ze uit op een TAE-gel van 1,5% om de stroomcytometrie en PCR-resultaten te analyseren en te combineren, om eencellige klonen te bevestigen. Reporter genexpressie na PMA / Ionomycine inductie werd bevestigd door zowel flow cytometrie en PCR in vier tot 12% van de cellen, afhankelijk van de integratie site. PCR-analyse van genomisch DNA met behulp van primers voor vijf-prime en drie-prime integratie knooppunt, bevestigen dat targeting gebeurtenissen hebben plaatsgevonden.Na de screening van eencellige klonen voor de juiste targeting door flow cytometrie, werden klonen met hoge, lage en geen fluorescerende reporter genexpressie waargenomen. Single cell klonen werden ook bevestigd door PCR met behulp van reporter-specifieke primers en controle primers. Klonen bevestigd positief in screening PCR werden besteed en verder geanalyseerd voor de juiste targeting door Southern blot, met behulp van een verslaggever-specifieke sonde en een genomic-sonde binding buiten de verslaggever.Slechts een gedeelte toonde correcte bandgrootte in Zuidelijke vlekanalyse en had heterozygously de verslaggever geïntegreerd, die aantoont dat het belangrijk is om de resultaten PCR door Zuidelijke vlek te verifiëren. Klonen werden ook geanalyseerd door sequencing om positieve eencellige klonen verder te bevestigen. Sequencing van het doel site: homologe allel, waren de verslaggever niet had geïntegreerd, bleek Cas9-geïnduceerde mutaties.Eenmaal onder de knie, generatie van HIV-verslaggever-lijnen kunnen worden bereikt in twee tot drie maanden. Voorafgaand aan targeting, is het belangrijk om genoeg tijd te besteden aan het kiezen van een integratiesite bij en de juiste verslaggever, afhankelijk van de onderzoeksvraag die u wilt aanpakken. Verslaggevers kunnen bijvoorbeeld desgewenst verschillende hiv-regulerende elementen opnemen.Na deze procedure kunnen cellijnen bijvoorbeeld worden gebruikt om het effect van verschillende latentie stijgende middelen op de transcriptieactiviteit van de reporter LTR te testen, afhankelijk van de integratiesite. Na het bekijken van deze video moet je een goed inzicht hebben in hoe je integratie-site-specifieke HIV reporter-lijnen genereren voor het ontwerpen van gids RNAs en targeting vector, het uitvoeren van CRISPR/Cas9-gebaseerde genoomengineering in de cellen, het produceren van eencellige klonen en het selecteren voor correct gerichte klonen door FACS en PCR screening. Vergeet niet, dat als u ervoor kiest om te werken met een replicatie-bevoegde HIV-verslaggever, moet u werken onder BSL3 veiligheidsvoorwaarden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...