Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Nous remercions Britta Weseloh et Bettina Abel pour l’assistance technique. Nous remercions également Arne Düsedau et Jana Hennesen (plate-forme de technologie dans la cytométrie en flux, Heinrich Pette Institut) pour le support technique.

1. cibler stratégie pour génome d’ingénierie et le ciblage de dessin vectoriel (tv)
Remarque : La première étape de l’ingénierie du génome consiste sélection et génération des outils nécessaires pour cibler les CRISPR Cas9-induite. Sélection d’un locus du site intégration génomique, choix du type de cellule afin de cibler et conception d’un reporter dérivé du VIH pour intégration doivent précéder cette étape. Ce protocole décrit le ciblage d’un jo...

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	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. 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A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Nous décrivons ici un protocole visant à générer des modèles de journaliste Jurkat dérivés du VIH-1 avec des sites d’intégration proviral choisi appliquant le génie du génome CRISPR dotés de Cas9.
Plusieurs points du protocole nécessitent une attention particulière durant la phase de planification. Tout d’abord, le locus d’être la cible doit être choisi avec soin, car certains loci pourrait être plus facile à la cible que d’autres (par exemple, selon l’état...

Intégration de l’ADN proviral dans le génome de l’hôte à l’infection est une étape essentielle dans le cycle de vie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Après intégration, VIH persiste en établissant la latence en sous-ensembles de cellules T CD4 + vivaces telles que les cellules T CD4 + mémoire. Intégration du VIH semble être non aléatoire1,2. On a décelé un certain nombre de hotspots génomiques avec l’ADN proviral intégré de manière récurrente dans plusieurs études à travers le séquençage des sites d’intégration aux personnes infectées de manière aiguë et chronique2,3,4 ,5,6,7,8. Fait intéressant, à certains de ces sites d’intégration, un même locus a été détecté dans une grande partie des cellules infectées, conduisant à l’idée que l’intégration aux sites récurrents pourrait affecter positivement expansion clonale1.
Pour faire progresser notre compréhension de l’importance des sites d’intégration récurrente, choix du site intégration proviral doit être explorée. Cependant, plusieurs aspects techniques entravent étudie l’intégration du VIH du site choix et les conséquences. Largement utilisé des modèles de culture de cellules pour la latence du VIH comme les lignées cellulaires JLat ne reflètent pas cliniquement pertinente intégration récurrente sites9. Études sur des cellules primaires dérivés de patient, d’une part, permettent la description du paysage du site intégration par séquençage mais ne permettent pas d’analyses fonctionnelles. À notre connaissance, aucun modèle expérimental adéquat n’est disponible pour analyser fonctionnellement certains sites d’intégration cliniquement pertinente.
Nous présentons ici un flux de travail détaillé pour générer de nouveaux modèles pour l’infection par le VIH en utilisant des technologies d’ingénierie génomique CRISPR dotés de Cas9. Le flux de travail décrit ci-après peut être utilisé pour générer des lignées de cellules de culture cellulaire T journaliste qui modélisent l’infection par le VIH, transportant un journaliste proviral génomiquement intégré à un site d’intégration choisie. Ils servent ainsi que de nouveaux outils pour explorer comment le site intégration proviral peut avoir un impact biologie le VIH et comment le provirus répond aux différentes stratégies de traitement (p. ex., inductibilité par inversion des agents de latence). Notre méthode utilise les avantages du génie de génome CRISPR dotés de Cas9, dans laquelle intégration du reporter séquence par recombinaison homologue est facilitée par une pause de bicaténaires induite par la nucléase Cas9 sur le site cible. Les sites cibles pour l’intégration sont choisis selon la proximité avec les sites décrits intégration récurrente d’études sur les personnes infectées par le VIH et la présence de motifs de PAM appropriés pour l’ingénierie du génome induite par le Cas9.
Dans nos résultats exemplaires, nous avons mis l’accent sur le locus du gène BACH2, qui code pour le régulateur transcriptionnel BTB et CNC homologie 2. Chez les personnes chroniquement infectées par le VIH sous traitement antirétroviral, BACH2 est un des locus montrant l’enrichissement du integrated HIV-1 séquences3,6,7,8,10. Nous avons choisi un journaliste dérivé du VIH minimal consistant en dérivés du VIH-1 long terminal repeat (LTR), tdTomato séquence codante et signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine (BGH) (PA), dont nous avons ciblé deux sites spécifiques dans l’intron BACH2 5. Le protocole présenté est optimisé pour Jurkat cellules, une lignée de cellules humaine CD4 + suspension dérivé de lymphocytes T, mais autre cellule lignées peuvent être utilisées et le protocole adapté en conséquence. Nous présentons un flux de travail détaillé pour la sélection du site cible, construction du vecteur de la cible avec les bras de l’homologie, CRISPR Cas9-médiation ciblant le reporter dans le site choisi de génomique, la génération et la sélection des lignées clonales et complètes vérification des lignées cellulaires de journaliste nouvellement généré et ciblées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

Virus de l’immunodéficience humaine (VIH) intègre son ADN proviral non aléatoirement dans le génome de cellule hôte sites récurrents et génomiques hotspots. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la génération de nouveaux modèles in vitro d’infection à VIH avec des sites choisis intégration génomique à l’aide des technologies d’ingénierie génomique CRISPR dotés de Cas9. Avec cette méthode, une séquence de journaliste de choix peut être intégrée dans un locus génomique ciblé et choisi, reflétant des sites d’intégration cliniquement pertinente.
Dans le protocole, la conception d’un journaliste dérivé du VIH et en choisissant une séquence cible de site et gRNA sont décrites. Un vecteur de ciblage avec les bras de l’homologie est construit et transfecté dans des cellules T Jurkat. La séquence de journaliste s’adresse au site génomique sélectionné par recombinaison homologue, facilitée par une médiation Cas9 bicaténaires pause sur le site cible. Clones de cellules individuelles sont générées et projetés pour le ciblage des événements par cytométrie en flux et par PCR. Clones sélectionnés sont ensuite développées, et un ciblage correct est vérifiée par PCR, séquençage et de Southern. Événements hors-cible du génie de génome CRISPR Cas9-médiation sont analysés.
En utilisant ce protocole, les systèmes de cultures cellulaires roman cette infection à VIH modèle à sites d’intégration cliniquement pertinente peut être générée. Bien que la génération de clones de cellules individuelles et la vérification de l’intégration de séquence correcte journaliste prend du temps, les lignées clonales qui en résultent sont des outils puissants pour analyser fonctionnellement choix site intégration proviral.

Dans cette expérience de représentant, nous avons choisi de cibler un journaliste dérivés du VIH-1 minime consistant en une LTR, séquence codant pour tdTomato et la séquence polyA-signal à deux loci dans l’intron 5 du gène BACH217. Les locus pour le ciblage ont été choisis selon la proximité avec les sites publiés intégration récurrente trouvés dans différentes études sur des cellules de T primaires de patients infectés par le VIH<sup class="xre...

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CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Nous présentons un flux de travail de génie du génome pour la génération de nouveaux modèles in vitro pour l’infection à VIH-1 qui récapitulent l’intégration provirale dans certains sites génomiques. Ciblage des journalistes dérivé du VIH est facilitée par la manipulation du génome CRISPR Cas9-médiation, in situ. Des protocoles détaillés pour la génération de cellule unique clone, dépistage et vérification de ciblage correcte sont fournis.

Génie de génome CRISPR dotés de Cas9 pour produire des modèles de Jurkat Reporter pour l’Infection à VIH-1 avec les Sites d’intégration Proviral sélectionnés

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Cette méthode peut aider à répondre à la question de savoir comment l’intégration du provirus du VIH influence l’expression des gènes androgynes et pourquoi certains sites d’intégration génomique sont sélectionnés dans des cellules récemment infectées par le VIH. Le principal avantage de cette technique est que des modèles in vitro d’infection par le VIH peuvent être produits, qui transportent des reporters proviraux ciblés sur des sites d’intégration choisis à l’aide de l’ingénierie génomique basée sur CRISPR/Cas9. Thomas Walther, doctorant, et Julia Bialek, postdoc de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Commencez par utiliser ucsc Genome Browser pour extraire in-silico la séquence génomique du locus génomique désiré pour être ciblé. Pour choisir le guide ARN de 20 nucléotides pour cibler le locus génomique choisi, utilisez l’outil Web E-CRISP. Ensuite, sélectionnez, Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.Génome de référence comme organisme et entrée 2000 paires de base de la séquence génomique, couvrant le locus génomique désiré précédemment extrait. Commencez une recherche d’ARN-guide à l’aide de paramètres d’application moyens avec n’importe quel PAM, toutes les cinq cibles de base et hors cible tolèrent les inadéquations et les introns exclus et les îles CPG. De la liste avec les conceptions possibles de guide-ARN qui apparaît, sélectionnez un ARN de guide avec un score élevé pour la spécificité et l’efficacité, qui est proche autant que possible du locus génomique désiré pour être visé.Ouvrez le navigateur NCBI Blast pour faire sauter la séquence guide-ARN choisie par rapport au génome de référence. Pour vérifier l’unicité du site de liaison guide-ARN sélectionné, sélectionnez d’abord l’humain comme génome, puis entrez la séquence guide-ARN comme séquence de requête. Sélectionnez ensuite des séquences très similaires ou Mega Blast comme programme pour vous assurer que la séquence guide-ARN est unique.Après cela, sélectionnez in-silico 1000 paires de base, en amont et en aval de la séquence guide-ARN de la séquence génomique extraite au début. Utilisez ces paires de base sélectionnées de 1 000, en amont et en aval, comme bras d’homologie à cinq et trois premiers pour cibler la construction vectorielle et la séquence de reporters à cibler. 24 heures avant la transfection des cellules T de jurkat, préparez une plaque complète de 6 puits des cellules pour une expérience de ciblage unique.Pour commencer, plaque 1, 250.000 cellules dans 2,5 millilitres de RPMI 1640 avec des suppléments et sans antibiotiques, par puits. Le lendemain, ajouter aux microgrammes de vecteur de ciblage circulaire et deux microgrammes de Cas9 et plasmide d’expression guide-ARN par puits, à 250 microlitres de milieu commercial RPMI optimisé pour la transfection, dans un tube de réaction et bien mélanger par vortex. Ajouter ensuite lentement 12 microlitres d’agent transfection au milieu de l’ADN sans toucher la paroi du tube.Feuilleter le tube et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter le mélange dropwise à un puits de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Et 72 heures après la transfection, tirez sur les cellules transfectées, comptez-les et préparez-vous à l’enrichissement par FACS. Après avoir confirmé les événements de ciblage dans la population mixte de cellules ciblées, commencez à générer des clones à cellules individuelles en préparant à l’avance un milieu conditionné par jurkat, en recueillant l’IRP avec des antibiotiques provenant de cellules T de jurkat saines et non traitées. Centrifuger les tubes pendant 5 minutes à 300 G, et filtrer le supernatant avec une seringue de 25 millilitres, à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres.Comptez les cellules ciblées précédemment enrichies par facs, 10 à 14 jours après expansion, puis diluez-les dans RPMI avec des antibiotiques à une concentration de 100.000 cellules par millilitre. Diluer 100 microlitres de cette dilution cellulaire avec 9,9 millilitres de milieu pour atteindre 1000 cellules par millilitre. Puis diluer un millilitre de cette dilution avec neuf millilitres de milieu à une concentration de 100 cellules par millilitre.Pour plaquer 96 plaques de puits pour contenir une cellule par puits, mélangez doucement un millilitre de solution de 100 cellules par millilitre avec cinq millilitres de milieu d’état et quatre millilitres de milieu frais, dans un réservoir stérile de réaccentrage. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de la dilution cellulaire respective par puits de nouvelles plaques inférieures rondes de 96 puits pour obtenir une et deux cellules par dilutions de puits. Empilez les 96 plaques de puits et couvrez chaque pile d’une plaque de six puits contenant trois millilitres de PBS par puits.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone, pendant trois semaines. Après avoir terminé l’incubation, confirmer visuellement la présence de colonies cultivées à l’aide d’une microscopie légère avec grossissement quatre fois, et marquer les puits avec des colonies cultivées. Resuspendez doucement les cellules d’une cellule bien marquée par le pipetage.Transférer 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans un puits de plaque inférieure ronde fraîchement préparée de 96 puits avec 100 microlitres de RPMI avec antibiotiques, par puits et répéter pour tous les puits marqués, mélanger délicatement par pipetting. Pour dupliquer la plaque, transférez 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans une deuxième plaque vide à fond rond de 96 puits et répétez ce processus pour tous les puits marqués. Enfin, remplissez les puits vierges de 200 microlitres de RPMI avec des antibiotiques.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après que la plaque en double a incubé pendant 24 à 48 heures le dupliquer à nouveau en ajoutant 100 microlitres de RPMI avec des antibiotiques à chaque puits. Utilisez une pipette multicanal pour mélanger doucement et transférer 100 microlitres à chaque puits d’une nouvelle plaque à fond rond de 96 puits.Placez l’une de ces deux plaques en double dans l’incubateur. Utilisez la deuxième des nouvelles plaques en double pour la cytométrie d’écoulement, en ajoutant d’abord cinq microlitres de PMA/Ionomycine Master Mix par puits, pour stimuler les cellules. Incuber pendant 24 heures et préparer les cellules pour la cytométrie d’écoulement tel que décrit dans le texte.Portez toutes les cellules simples viables en fonction de la taille dans la dispersion vers l’avant et vers le côté. Analyser l’expression des gènes fluorescents par cytométrie de flux. Pour filtrer les clones unicellules par PCR, concevez les amorces P5 et P6 pour la projection de PCR en fonction de la séquence de reporter choisie, afin d’amplifier 500 à 800 paires de base de la séquence reporter.Pour un contrôle positif pcr, concevoir des amorces P7 et P8 qui amplifie 630 paires de base d’un locus génomique de type sauvage et non ciblé. Concevoir une troisième paire d’amorce qui amplifie 500 à 600 paires de base de l’épine dorsale du vecteur de ciblage comme un contrôle pour l’intégration non spécifique des séquences dorsales de ciblage-vecteur. Une fois que les clones de la deuxième plaque en double se sont suffisamment développés, préparez-les au criblage pcr en centrifugant d’abord la plaque pendant 10 minutes à 300 G à température ambiante.Enlever soigneusement le surnatant, en s’assurant de ne pas déranger la pastille cellulaire. Lavez les cellules avec 100 microlitres de PBS par pipetting doux, centrifugant la plaque pendant cinq minutes à 300 G à température ambiante. Retirer le PBS et ajouter 200 microlitres de tampon de lyse par puits.Pipette doucement pour mélanger, et transférer la suspension à une nouvelle plaque PCR. Sceller la plaque avec un film de paraffine et incuber pendant une heure à 55 degrés Celsius dans un thermocycler. Après avoir centrifugé les débris cellulaires à la vitesse maximale pendant 10 minutes, transférez le supernatant sur une nouvelle plaque PCR.Ajouter 10 microlitres de cette cellule lysate à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits remplie de 110 microlitres de H2O distillé, par puits. Puis incuber pendant 10 minutes à 99 degrés Celsius dans un thermocycler, pour inactiver proteinase K.Utilisez 2 microlitres de cette cellule lysate comme un modèle et utiliser un mélange commercial PCR maître pour le criblage, le contrôle et l’épine dorsale PCR. Exécutez pcr pendant 38 à 40 cycles d’amplification PCR dans un format de 96 puits.Utilisez cinq microlitres de produits PCR et exécutez-les sur un gel TAE agarose de 1,5 % pour analyser et combiner la cytométrie du débit et les résultats du PCR, afin de confirmer les clones à cellules simples. L’expression de gène de reporter après induction de PMA/Ionomycin a été confirmée par cytométrie de flux et PCR dans quatre à 12%de cellules, selon le site d’intégration. L’analyse PCR de l’ADN génomique à l’aide d’amorces pour la jonction d’intégration à cinq et trois premiers, confirme que des événements de ciblage se sont produits.Après le criblage des clones de cellules simples pour le ciblage correct par cytométrie de flux, des clones avec l’expression élevée, basse et aucune expression fluorescente de gène de reporter ont été observés. Des clones de cellules simples ont également été confirmés par PCR à l’aide d’amorces spécifiques aux journalistes et d’amorces de contrôle. Des clones confirmés positifs dans le criblage pcr ont été dépensés et analysés plus loin pour le ciblage correct par la tache méridionale, utilisant une sonde reporter-spécifique et une liaison génomique-sonde à l’extérieur du journaliste.Seule une partie a montré la taille correcte de bande dans l’analyse méridionale de tache et avait hétérozygously intégré le journaliste, montrant qu’il est important de vérifier des résultats de PCR par tache méridionale. Les clones ont également été analysés par séquençage pour confirmer davantage les clones positifs à cellules simples. Séquençage du site cible: allèle homologue, si le journaliste n’avait pas intégré, a révélé cas9 mutations induites.Une fois maîtrisées, la génération de lignes de reporters sur le VIH peut se faire en deux à trois mois. Avant de cibler, il est important de passer suffisamment de temps à choisir un site d’intégration et un journaliste approprié, selon la question de recherche que vous souhaitez aborder. Les journalistes peuvent, par exemple, inclure différents éléments réglementaires sur le VIH si vous le souhaitez.Suite à cette procédure, les lignées cellulaires peuvent par exemple être utilisées pour tester l’effet des différents agents en hausse de latence sur l’activité transcriptionnelle du reporter LTR, selon son site d’intégration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des lignes de reporters vih spécifiques au site d’intégration pour la conception d’ARN guides et de vecteurs de ciblage, l’exécution de CRISPR / Cas9 basée sur l’ingénierie du génome dans les cellules jurkat, la production de clones à cellules individuelles et la sélection de clones correctement ciblés par FACS et pcr dépistage. N’oubliez pas que si vous choisissez de travailler avec un journaliste vih compétent en réplication, vous devez travailler dans des conditions de sécurité BSL3.

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