Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

אנו מודים ברטה Weseloh והבל בטינה לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ארן Düsedau ו- Hennesen יאנה (לזרום cytometry בפלטפורמת הטכנולוגיה, היינריך Pette אינסטיטוט) לקבלת תמיכה טכנית.

1. אסטרטגיה מכוונת הגנום הנדסה והיעדים עיצוב וקטור (טלוויזיה)
הערה: הצעד הראשון של הגנום הנדסה כרוך בחירה ויצירת הכלים הדרושים עבור CRISPR Cas9-בתיווך מיקוד. מבחר של לוקוס באתר אינטגרציה הגנומי, בחירה של סוג התא הכוונת, ועיצוב כתב HIV-derived לשילוב צריך להקדים שלב זה. פרוטוקול ...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת מודלים לכתבת HIV-1-נגזר Jurkat עם האתרים שבחרת שילוב proviral החלת בהנדסת הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9.
מספר נקודות של הפרוטוקול דורשים תשומת לב רבה במהלך שלב התכנון. ראשית, מיקומה כדי להיות ממוקד יש לבחור בקפידה, כמו לוקוסים מסוימים ייתכן שיהיה קל יותר ?...

שילוב של proviral ה-DNA הגנום המארח בעת זיהום הוא שלב קריטי במחזור החיים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV). בעקבות שילוב, HIV נמשכת על-ידי יצירת השהיה של קבוצות משנה תאי CD4 + T חיים ארוכים כגון זיכרון CD4 + T תאים. HIV שילוב שנראה שאינן אקראיות1,2. מספר נקודות חמות גנומית עם ה-DNA proviral משולב שהדו-שיח זוהתה במספר מחקרים באמצעות הרצף של שילוב אתרים אנשים נגועים בחריפות, באופן כרוני2,3,4 ,5,-6,-7,-8. מעניין, על שילוב אתרים מסויימים, מיקומה באותו זוהה שבר גדול של תאים נגועים, שמוביל הרעיון כי אינטגרציה באתרים חוזרים ונשנים עלול להשפיע באופן חיובי משובט הרחבה1.
כדי לקדם את ההבנה שלנו של המשמעות של שילוב חוזר ונשנה אתרים, שילוב proviral אתר הבחירה חייב להיחקר. עם זאת, מספר היבטים טכניים ה"בלתי אינטגרציה HIV לימוד באתר הבחירה ואת ההשלכות. בשימוש רחב תא תרבות מודלים של השהיה HIV, כמו שורות תאים JLat אינן משקפות את שילוב חוזר ונשנה הרלוונטית קלינית אתרי9. מחקרים על תאים נגזר החולה הראשי, מצד אחד, מאפשרים תיאור של שילוב האתר נוף על ידי רצף אך אינם מאפשרים ניתוחים פונקציונליים. ידיעתנו אין דגם ניסיוני נאותה זמין לנתח אתרים נבחרים הרלוונטית קלינית אינטגרציה פונקציונלית.
כאן אנו מציגים נתונים היסטוריים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חדשניים הידבקות ב- HIV באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. זרימת העבודה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כדי ליצור קווים תא תא T-derived כתב דגם הידבקות ב- HIV, נושא כתב proviral genomically משולב באתר שבחרת שילוב. הם משרתים וכך גם כלים חדשים לחקור איך האתר אינטגרציה proviral יכולים להשפיע ביולוגיה HIV ואת איך provirus מגיבה אסטרטגיות טיפול שונה (למשל, inducibility על ידי סוכנים היפוך השהיה). השיטה שלנו משתמשת את היתרונות של הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי הנדסה, בשילוב אשר כתב רצף מאת רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של Cas9 הנוצרות על-ידי נוקלאז כפול-strand הפסקה באתר היעד. אתרי היעד עבור שילוב נבחרו על פי קרבה לאתרים שילוב חוזר ונשנה שתואר ממחקרים על אנשים נגועים ב- HIV ואת נוכחותם של מוטיבים מתאימים פאם הגנום בתיווך Cas9 הנדסה.
התוצאות המופת שלנו, אנחנו התמקדו מיקומה ג'ין BACH2, אשר הקודים המתקן תעתיק BTB ו CNC הומולוגיה 2. אצל אנשים באופן כרוני נגוע ב- HIV על טיפול תרופתי, BACH2 הוא אחד לוקוסים מציג העשרה משולב HIV-1 רצפים של3,6,7,8,10. בחרנו עיתונאי HIV-derived מינימלי של HIV-1-derived זמן מסוף חוזר (משמאל לימין), רצף קידוד tdTomato, הורמון גדילה (BGH) הסימן פוליאדנילציה (PA), אשר בוחר לשני אתרים ספציפיים באינטרון BACH2 5. פרוטוקול הציג ממוטב Jurkat תאים, אנושי CD4 + תא T-derived ההשעיה תא קו, אבל תא שני קווים עשוי לשמש, פרוטוקול הותאם בהתאם. אנו מציגים זרימת עבודה מפורט באתר היעד, בניית היעד וקטור בזרועות הומולוגיה, CRISPR Cas9-בתיווך פילוח של הכתב לתוך האתר גנומית שבחרת, הדור ואת הבחירה של קווי המשובטים, ומקיף מבחר אימות של שורות תאים הכתב החדש שנוצר, ממוקד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) משלב ה-DNA שלו proviral שאינה אקראית לתוך הגנום התא המארח-חוזרים ונשנים אתרים ונקודות גנומית. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של הרומן מודלים במבחנה הידבקות ב- HIV עם אתרי אינטגרציה הגנומי שבחרת באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. בשיטה זו, כתב רצף של הבחירה שניתן לשלב לוקוס גנומית יישוב, שבחרת, המשקף הרלוונטית קלינית שילוב אתרים.
בפרוטוקול, מתוארים העיצוב של הכתב HIV-derived ובחירה של רצף באתר, gRNA היעד. וקטור מיקוד בזרועות הומולוגיה נבנה, transfected לתוך תאי Jurkat T. הרצף כתב לאוכלוסייה אתר גנומית שנבחר על ידי רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של הפסקה כפולה-strand בתיווך Cas9 באתר היעד. תא בודד שיבוטים שנוצר, הוקרן הכוונת האירועים על ידי cytometry זרימה ו- PCR. שיבוטים שנבחרו ואז מורחבות, פילוח נכון מאומתת על ידי ה-PCR, רצף סופג הדרומי. ניתוח אירועים פוטנציאליים את המטרה של הגנום CRISPR Cas9-בתיווך הנדסה.
באמצעות פרוטוקול, מערכות התרבות התא הרומן הזה ניתן להפיק את הידבקות ב- HIV דגם באתרים אינטגרציה הרלוונטית קלינית. למרות הדור של תא בודד שיבוטים ואימות של שילוב רצף כתב הנכונה היא גוזלת זמן, הקווים המשובטים וכתוצאה מכך הם כלים רבי-עוצמה לנתח באופן פונקציונלי אינטגרציה proviral אתר הבחירה.

בניסוי זה נציג בחרנו להתמקד עיתונאי HIV-1-derived מינימלי המורכב LTR, tdTomato-קידוד רצף, תיקים עשויים. האות רצף מנחלת שני באינטרון 5 של ג'ין BACH217. לוקוסים עבור המיקוד נבחרו על פי קרבה לאתרי שילוב חוזר ונשנה שפורסמו שנמצאו במחקרים שונים על ראשי T תאים נגועים ב- HIV2<...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על השאלה כיצד אינטגרציה של נגיף האיידס משפיעה על ביטוי גנים אנדרוגיניים, ומדוע אתרי אינטגרציה גנומיים מסוימים נבחרים לאחרונה בתאים נגועים ב- HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מודלים במבחנה לזיהום HIV, הנושאים כתבים פרו-ויראליים המיועדים לאתרי אינטגרציה נבחרים באמצעות הנדסת גנום מבוססת CRISPR/Cas9. הדגימו את ההליך יהיו תומאס ולטר, דוקטורנט, וג'וליה ביאלק, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.התחל על ידי שימוש בדפדפן הגנום UCSC כדי in-silico-לחלץ את הרצף הגנומי של לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד. כדי לבחור RNAs מנחים של 20 נוקלאוטידים לפילוח של הלוקוס הגנומי שנבחר, השתמש בכלי האינטרנט E-CRISP. לאחר מכן בחר, הומו ספיינס גנום הפניה קונסורציום הגנום האנושי:לבנות 38.התייחסות הגנום כמו האורגניזם קלט 2, 000 זוגות הבסיס של הרצף הגנומי, מכסה את לוקוס הגנומי הרצוי שחולץ בעבר. התחל חיפוש מדריך-RNA באמצעות הגדרות יישום בינוני עם כל PAM, כל בסיס חמישה ראשים, מחוץ ליעדים לסבול אי התאמות ולא נכללו introns ואיי CPG. מהרשימה עם עיצובים RNA מדריך אפשרי שמופיע, בחר RNA מדריך עם ציון גבוה עבור ספציפיות ויעילות, אשר קרוב ככל האפשר לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד.פתח את דפדפן NCBI Blast כדי לפוצץ את רצף המדריך-RNA שנבחר נגד גנום הייחוס. כדי לבדוק את הייחודיות של אתר איגוד ה- Guide-RNA שנבחר, בחר תחילה את האדם כגנום ולאחר מכן הזן את רצף ה- RNA של המדריך כרצף השאילתה. לאחר מכן בחר רצפים דומים מאוד או פיצוץ מגה כתוכנית כדי לוודא כי רצף RNA המדריך הוא ייחודי.לאחר מכן, בחר ב-silico 1, 000 זוגות בסיס, במעלה הזרם ובמורד הזרם של רצף Guide-RNA מהרצף הגנומי שחולץ בהתחלה. השתמש ב-1,000 זוגות בסיסים נבחרים אלה, במעלה הזרם ובמורד הזרם כזרועות הומולוגיה של חמישה ראשים ושלושה ראשים כדי להתמקד בבנייה וקטורית וברצף הכתבים הסמוך כדי להיות ממוקדים. 24 שעות לפני ההמרה של תאי T jurkat, להכין צלחת אחת שלמה 6 באר של התאים לניסוי מיקוד יחיד.כדי להתחיל, צלחת 1, 250, 000 תאים ב 2.5 מיליליטר של RPMI 1640 עם תוספי מזון וללא אנטיביוטיקה, לגם. ביום שלמחר, להוסיף מיקרוגרם של וקטור מיקוד עגול ושני מיקרוגרם של Cas9 ו plasmid ביטוי מדריך-RNA ל הבאר, כדי 250 microliters של מדיום RPMI מסחרי אופטימיזציה עבור transfection, בצינור תגובה לערבב היטב על ידי מערבולת. ואז לאט להוסיף 12 microliters של סוכן transfection למדיום ה-DNA מבלי לגעת בקיר של הצינור.מצליפים בצינור ומטגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים את התערובת dropwise ל באר אחת של תאים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ו-72 שעות לאחר ההתמזגות, משוך את התאים המותבים, ספור אותם והתכונן להעשרה על ידי FACS. לאחר אישור אירועי המיקוד באוכלוסיית התאים הממוקדים המעורבים, התחל לייצר שיבוטים של תאים בודדים על ידי הכנת מדיום ממוזג מראש, על ידי איסוף RPMI עם אנטיביוטיקה מתאי T בריאים ולא מטופלים. צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 300 G, ולסנן את supernatant עם מזרק 25 מיליליטר, באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 לתוך חדש, 50 צינורות חרוט מיליליטר.לספור את התאים הממוקדים שהועשרו בעבר על ידי FACS, 10 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות, ולאחר מכן לדלל אותם RPMI עם אנטיביוטיקה לריכוז של 100, 000 תאים למיליליטר. לדלל 100 microliters של דילול תא זה עם 9.9 מיליליטר של בינוני כדי להשיג 1, 000 תאים למיליליטר. ואז לדלל מיליליטר אחד של דילול זה עם תשעה מיליליטר של בינוני לריכוז של 100 תאים למיליליטר.כדי צלחת 96 צלחות גם להכיל תא אחד ל הבאר, בעדינות לערבב מיליליטר אחד של תותב 100 תאים למיליליטר עם חמישה מיליליטר של בינוני מצב וארבעה מיליליטר של בינוני טרי, במאגר בריאגנט סטרילי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של דילול התא המתאים ל הבאר של 96 גם צלחות תחתונות עגולות 96 היטב כדי להשיג אחד ושני תאים לדילול היטב. עורמים את 96 צלחות באר ומכסים כל ערימה עם צלחת שש בארות המכילה שלושה מיליליטר של PBS לגם.דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני, במשך שלושה שבועות. לאחר הדגירה הושלמה, חזותית לאשר את נוכחותם של מושבות גדל באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה ארבע פעמים, ולסמן את בארות עם מושבות גדל. בעדינות resuspend תאים של אחד מסומן היטב על ידי צינורות.העבר 100 microliters של מתלה תא זה לתוך באר אחת של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב מוכן טרי עם 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה, ל הבאר ולחזור על כל הבארים המסומנים, לערבב בעדינות על ידי pipetting. כדי לשכפל את הצלחת, להעביר 100 microliters של ההשעיה תא זה לתוך צלחת שנייה ריקה, 96 גם עגול התחתון ולחזור על תהליך זה עבור כל בארות מסומנות. לבסוף, למלא את בארות ריקות עם 200 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הצלחת הכפולה יש דגירה במשך 24 עד 48 שעות לשכפל אותו שוב על ידי הוספת 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה לכל באר. השתמשו בפיפיטה רב-ערוצית כדי לערבב בעדינות ולהעביר 100 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת חדשה עם 96 בארים.שים אחת משתי הצלחות הכפולות האלה באינקובטור. השתמש השני של הלוחות הכפולים החדשים עבור cytometry זרימה, על ידי הוספת תחילה חמישה microliters של PMA / Ionomycin מאסטר לערבב ל הבאר, כדי לעורר את התאים. דגירה במשך 24 שעות ולהכין את התאים עבור cytometry זרימה כמתואר בטקסט.שער כל תא יחיד קיימא המבוסס על גודל פיזור קדימה וצד. לנתח ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה. כדי להקרין שיבוטים חד-תאיים על-ידי PCR, עצבו פריימרים P5 ו- P6 להקרנת PCR בהתבסס על רצף הכתבים שנבחר, כדי להגביר 500 עד 800 זוגות בסיס של רצף הכתבים.לשליטה חיובית ב-PCR, תכנן פריימרים P7 ו-P8 שמגבירים 630 זוגות בסיסים של לוקוס גנומי פראי ולא ממוקד. תכנן זוג פריימר שלישי המגבר 500 עד 600 זוגות בסיסים של עמוד השדרה של מיקוד וקטור כפקד לשילוב לא ספציפי של רצפי עמוד שדרה של מיקוד וקטור. לאחר השיבוטים בצלחת הכפולה השנייה גדלו מספיק, להכין אותם הקרנת PCR על ידי צנטריפוגה הראשונה את הצלחת במשך 10 דקות ב 300-G בטמפרטורת החדר.בזהירות להוריד את supernatant, הקפדה לא להפריע את גלולת התא. לשטוף את התאים עם 100 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים, צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 300 G בטמפרטורת החדר. הסר את ה- PBS והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לכל באר.פיפטה בעדינות לערבב, ולהעביר את ההשעיה לצלחת PCR חדשה. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין דגירה במשך שעה אחת ב 55 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר. לאחר צנטריפוגה למטה פסולת התא במהירות המרבית במשך 10 דקות, להעביר את supernatant לצלחת PCR חדשה.הוסף 10 microliters של תא זה lysate לכל באר של צלחת PCR 96-well מלא 110 microliters של H2O מזוקק, ל הבאר. ואז דגירה במשך 10 דקות ב 99 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר, כדי להשבית proteinase K.Use 2 microliters של תא זה ללקט כתבנית ולהשתמש בתערובת ראשית PCR מסחרית להקרנה, בקרה ו- PCR עמוד השדרה. הפעל PCR במשך 38 עד 40 מחזורים של הגברה PCR בפורמט 96 באר.השתמש חמישה microliters של מוצרי PCR ולהפעיל אותם על 1.5% agarose TAE ג'ל לנתח ולשלב את ציטומטריית זרימה ותוצאות PCR, כדי לאשר שיבוטים תא יחיד. ביטוי גנים כתב לאחר אינדוקציה PMA / Ionomycin אושרה על ידי שני ציטומטריה זרימה PCR בארבעה עד 12% של תאים, בהתאם לאתר האינטגרציה. ניתוח PCR של דנ"א גנומי באמצעות פריימרים לצומת אינטגרציה של חמישה ראשים ושלושה ראשים, מאשרים כי אירועי מיקוד התרחשו.לאחר ההקרנה של שיבוטים תא יחיד עבור מיקוד נכון על ידי cytometry זרימה, שיבוטים עם גבוה, נמוך ולא ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי נצפו. שיבוטים תא יחיד אושרו גם על ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לכתב פריימרים שליטה. שיבוטים אישרו חיובי בהקרנת PCR הוצאו ונותחו עוד יותר עבור מיקוד נכון על ידי כתם דרומי, באמצעות בדיקה ספציפית לכתב ו מחייב בדיקה גנומי מחוץ לכתב.רק חלק הראו גדלי הלהקה הנכונים בניתוח הכתמים הדרומיים ושלבו את הכתב בצורה הטרוזית, מה שמראה שחשוב לאמת את תוצאות PCR על ידי כתם דרומי. שיבוטים נותחו גם על ידי רצף כדי לאשר עוד יותר שיבוטים חד-תאיים חיוביים. רצף של אתר היעד: אלל הומולוגי, אם הכתב לא השתלב, חשף מוטציות הנגרמות על ידי Cas9.לאחר השליטה, הדור של איידס כתב שורות ניתן להשיג בחודשיים עד שלושה חודשים. לפני הפילוח, חשוב להשקיע מספיק זמן בבחירת אתר אינטגרציה אצל כתב מתאים, בהתאם לשאלת המחקר שאתה רוצה להתמודד איתה. כתבים יכולים למשל, לכלול אלמנטים רגולטוריים שונים HIV אם תרצה.בעקבות הליך זה, קווי תאים יכולים לשמש לדוגמה כדי לבדוק את ההשפעה של סוכנים עולים השהיה שונים על פעילות שעתוק של הכתב LTR, בהתאם לאתר האינטגרציה שלה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור אינטגרציה-אתר ספציפי HIV כתב קווים לעיצוב מדריך RNAs ומיקוד וקטור, ביצוע הנדסת גנום מבוסס CRISPR /Cas9 בתאי jurkat, הפקת שיבוטים תא יחיד ובחירה שיבוטים ממוקדים כראוי על ידי FACS ו PCR הקרנה. אל תשכח, שאם תבחר לעבוד עם כתב HIV מוסמך שכפול, אתה צריך לעבוד תחת תנאי בטיחות BSL3.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...