Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

우리 기술 지원 Britta Weseloh와 베티 아벨 감사합니다. 우리 또한 감사 아르네 두 제 다우와 Jana Hennesen (교류 cytometry 기술 플랫폼, 하인리히 Pette Institut) 기술 지원.

1. 게놈 엔지니어링 및 벡터 (tv) 디자인을 타겟팅에 대 한 전략을 타겟팅
참고: 유전자 공학의 첫 번째 단계는 선택 및 필요한 도구 CRISPR Cas9 중재 하는 대상에 대 한 포함 됩니다. 게놈 통합 사이트 로커 스의 선택, 타겟팅, 셀 형식의 선택 그리고 디자인의 통합에 대 한 HIV 파생 기자가이 단계를 선행 한다. 이 프로토콜은 Jurkat 대상 세포로 HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA 최소한의...

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	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. 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A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

여기, 우리가 선택한 proviral 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 적용 HIV 1 파생 Jurkat 기자 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다.
프로토콜의 몇 가지 포인트는 계획 단계에서 주의 필요합니다. 첫째, 타겟이 될 장소 선택 해야 신중 하 게, 일부 loci 대상에 다른 사람 보다 쉽게 될 수 있습니다 (예:, 지역 및 대상의 염색 질 상태에 따라 자체 순서). 반복 시퀀?...

감염 시 호스트 게놈으로 통합 proviral DNA의 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 수명 주기에서 중요 한 단계입니다. 통합에 따라 HIV 메모리 CD4 + T 세포 같은 긴 CD4 + T 세포 부분 집합에서 대기 시간을 설정 하 여 유지 합니다. 에이즈 통합 비 무작위1,2나타납니다. Recurrently 통합 proviral dna 게놈 핫스팟의 숫자 심하게만 성으로 감염 된 개인2,,34 통합 사이트의 시퀀싱을 통해 여러 연구에서 발견 되었습니다. 5,6,,78. 흥미롭게도, 이러한 통합 사이트의 일부에 같은 로커 스 재발 사이트에서 통합 클론 확장1미칠 긍정적으로 생각을 이끌어 감염 된 세포의 큰 분수에서 발견 되었다.
재발 성 통합 사이트의 중요성에 대 한 우리의 이해를 사전에 proviral 통합 사이트 선택 탐구 해야 합니다. 그러나 여러 가지 기술적인 측면 공부 에이즈 통합을 방해 하는, 선택과 결과 사이트. JLat 셀 라인 임상 관련 재발 통합 사이트9를 반영 하지 않습니다 처럼 광범위 하 게 HIV 대기 시간에 대 한 셀 문화 모델 사용. 기본 환자 파생 셀에 대 한 연구 한 한편으로, 통합 사이트 프리의 설명 연속 있지만 기능 분석에 대 한 허용 하지 않습니다. 우리의 지식을 하려면, 아무 적절 한 실험 모델은 선택 된 임상 관련 통합 사이트를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다.
여기 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 새로운 모델을 생성 하는 자세한 워크플로 선물이. 여기에 설명 된 워크플로 HIV 감염, 선택한 통합 사이트에서 genomically 통합된 proviral 기자를 들고 모델 T 세포 유래 기자 셀 라인을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그들은 따라서 proviral 통합 사이트 에이즈 생물학 영향을 미칠 수 어떻게는 provirus 다른 치료 전략 (예: 대기 시간 역전 에이전트에서, inducibility)에 응답 하는 방법을 탐구 하는 새로운 도구로 봉사는. 우리의 방법은 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링, 기자는 통합에 동종 재결합 하 여 시퀀스는 대상 사이트에서 Cas9 nuclease 유도 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된의 장점을 사용 합니다. 통합에 대 한 대상 사이트는 HIV에 감염 된 개인과 Cas9 중재 게놈 엔지니어링에 대 한 적합 한 PAM 모티프의 존재에 대 한 연구에서 설명된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선택 됩니다.
우리의 훌륭한 결과에서 우리는 BACH2 유전자 소재 시는 BTB와 CNC 상 동 transcriptional 레 귤 레이 터 2에 대 한 코드에 집중 했다. 항 레트로 바이러스 치료에만 성으로 HIV 감염 된 개인, BACH2 통합된 HIV-1 시퀀스3,6,7,,810의 농축을 보여주는 loci 중 하나입니다. 우리는 우리 BACH2 intron 5에서에서 두 개의 특정 사이트를 대상으로 HIV 1 파생 긴 단말기 반복 (LTR), tdTomato 코딩 시퀀스, 소 성장 호르몬 (BGH) polyadenylation 신호 (PA)의 구성 된 최소한의 HIV 파생 기자를 선택 했습니다. 제시 프로토콜 Jurkat 세포 인간의 CD4 + T 세포에서 파생 된 현 탁 액 셀 라인, 하지만 다른 셀 라인을 사용할 수 있습니다, 적절 하 게 적응 하는 프로토콜 최적화 되어 있습니다. 선물이 다양 한 대상 사이트, 대상 상 동 팔, CRISPR-Cas9-중재 선택한 게놈 사이트, 생성 및 클론 라인의 선택으로 취재의 대상으로 하 고 포괄적인 벡터의 건설에 대 한 자세한 워크플로 확인 새로 생성 된, 대상 기자 셀 라인의.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 재발 사이트 및 게놈 핫스팟 호스트 세포 게놈으로 비 무작위로 proviral DNA를 통합합니다. 여기 우리가 선택한 게놈 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 소설 체 외 모델의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 이 방법으로 선택의 기자 시퀀스 수 있습니다 통합할 수는 타겟, 선택한 genomic 소재 시, 임상 관련 통합 사이트를 반영.
프로토콜, HIV 파생 기자의 디자인과 대상 사이트 및 gRNA 순서의 선택 설명 합니다. 상 동 팔 대상 벡터 생성 이며 Jurkat T 세포로 페. 기자 시퀀스 선택 된 게놈 사이트에 대상 사이트에 Cas9 중재 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된 동종 재결합 대상 이다. 단일 셀 클론 생성 되며 cytometry 및 PCR에 의해 이벤트 대상에 대 한 상영. 선택 된 클론 확장 다음, 그리고 PCR, 시퀀싱, 그리고 남부 blotting에 의해 확인 된다 정확한 타겟팅. CRISPR Cas9 중재 하는 유전자 공학의 잠재적인 대상에서 이벤트는 분석 했다.
이 프로토콜, 소설 세포 배양 시스템을 사용 하 여 임상 관련 통합 사이트에서 그 모델 HIV 감염을 생성할 수 있습니다. 단일 세포 클론의 생성 및 올바른 기자 시퀀스 통합의 확인은 시간이 걸리는, 결과 클론 라인 proviral 통합 사이트 선택 기능 분석에 강력한 도구입니다.

대표적인 실험에서 LTR, tdTomato 코딩 순서, 및17의 BACH2 유전자 intron 5 두 loci polyA 신호 시퀀스의 구성 된 최소한의 HIV-1 파생 기자를 대상으로 선택 했습니다. 대상에 대 한 loci HIV 감염 환자2,,45,6, 기본 T 세포에 다른 연구에서 발견 된 재발 통합 사이트에 근?...

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CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

이 방법은 HIV 프로바이러스 통합이 어떻게 ANDrogynous 유전자 발현에 영향을 미치는지, 그리고 왜 특정 게놈 통합 사이트가 최근 HIV 감염 된 세포에서 선택되는지에 대한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HIV 감염을 위한 체외 모형이 CRISPR/Cas9 기지를 둔 게놈 공학을 사용하여 선택한 통합 사이트에 표적으로 한 프로 바이러스 성 기자를 전송하는 생성될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 토마스 월터, 박사 과정 학생, 줄리아 비알렉, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다.UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 표적화될 원하는 게놈 궤적의 게놈 서열을 실리코 추출물로 사용하여 시작한다. 선택한 게놈 궤적의 표적화를 위한 20개의 뉴클레오티드의 가이드 RNA를 선택하려면 E-CRISP 웹 도구를 사용합니다. 그런 다음, 호모 사피엔스 게놈 참조 컨소시엄 인간 게놈:빌드 38.게놈을 게놈서의 유기체 및 입력 2, 000기쌍으로 참조하여 이전에 추출한 원하는 게놈 궤적을 덮는다. 모든 PAM, 모든 5 프라임 베이스, 오프 타겟과 중간 응용 프로그램 설정을 사용하여 가이드 RNA 검색을 시작 불일치를 허용하고 인트론과 CPG 섬을 제외. 나타나는 가능한 가이드 RNA 설계를 가진 목록에서, 표적화될 원하는 게놈 궤적에 가능한 한 가까운 특이성 및 효율성에 대한 높은 점수를 가진 가이드 RNA를 선택한다.참조 게놈에 대해 선택한 가이드 RNA 서열을 폭발하는 NCBI 블라스트 브라우저를 엽니다. 선택한 가이드-RNA 결합 부위의 고유성을 확인하기 위해 먼저 인간을 게놈으로 선택한 다음 가이드-RNA 서열을 쿼리 서열로 입력한다. 그런 다음 가이드-RNA 서열이 고유한지 확인하기 위해 프로그램으로 매우 유사한 서열 또는 메가 블라스트를 선택합니다.그 후, 처음에 추출된 게놈 서열으로부터 가이드-RNA 서열의 상류 및 하류인 실리코 1, 000염기 쌍을 선택한다. 이러한 선택된 1, 000베이스 쌍, 업스트림 및 다운스트림을 5프라임 및 3프라임 호모로지 암으로 사용하여 벡터 시공을 타겟팅하고 기자 시퀀스를 타겟팅합니다. jurkat T 세포의 변환 24 시간 전에, 단일 표적 실험을 위한 세포의 1개의 완전한 6-웰 플레이트를 준비합니다.시작하려면, 플레이트 1, 250, 000 세포RPMI의 2.5 밀리리터 1640 보충제와 항생제없이, 잘 당. 다음 날, 원형 표적 벡터와 2마이크로그램의 Cas9 및 가이드-RNA 발현 플라스미드를 잘, 트랜스페션에 최적화된 상업용 RPMI 배지 의 250 마이크로리터에 반응 튜브에 추가하고 소용돌이에 의해 잘 혼합한다. 그런 다음 튜브의 벽을 만지지 않고 DNA 매체에 12 마이크로리터의 트랜스펙트 제를 천천히 추가합니다.튜브를 플릭하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 혼합물을 하나의 우물에 드롭와이즈로 추가합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.그리고 72 시간 후 형질 전환 후, 전감염된 세포를 당겨, 그들을 계산하고 FACS에 의해 농축을 준비. 혼합 표적 세포 집단에서 표적 이벤트를 확인한 후, 건강하고 치료되지 않은 jurkat T 세포로부터 항생제로 RPMI를 수집하여 jurkat 조절 배지를 미리 준비하여 단일 세포 클론생성을 시작합니다. 300G에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 0.22 마이크로미터 필터를 새로운 50밀리리터 원유형 튜브로 사용하여 25 밀리리터 주사기로 수퍼네티를 필터링합니다.이전에 FACS에 의해 농축된 표적 세포를 계산하고, 확장 후 10-14일 후에 항생제로 RPMI에서 희석하여 밀리리터당 100, 000 세포의 농도로 희석합니다. 밀리리터당 1, 000세포를 달성하기 위해 중간 크기의 9.9 밀리리터로 이 세포 희석제 100마이크로리터를 희석시합니다. 그런 다음 밀리리터 당 100 세포의 농도에 매체의 9 밀리리터와 이 희석의 1 밀리리터를 희석.96개의 웰 플레이트를 플레이트에 음파1셀을 함유하고, 밀리리터 당 1밀리리터 1밀리리터를 5밀리리터의 상태 배지와 4밀리리터의 신선한 배지와 부드럽게 혼합하여 멸균 시약 저장소에 놓습니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 웰당 각 세포 희석제 100 마이크로리터를 추가하여 잘 희석당 1개 및 2개의 세포를 달성한다. 96 개의 웰 플레이트를 쌓고 각 스택을 6 웰 플레이트로 덮어 3 밀리리터의 PBS가 들어 있습니다.3주 동안 5%의 이산화탄소를 가진 가습된 인큐베이터에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션을 완료한 후, 4배 배율로 가벼운 현미경 검사를 사용하여 재배된 식민지의 존재를 시각적으로 확인하고, 재배된 식민지로 우물을 표시한다. 파이펫팅으로 잘 표시된 하나의 셀을 부드럽게 다시 중단합니다.이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 항생제로 RPMI 100 마이크로리터와 함께 갓 준비된 96웰 라운드 하단 플레이트 1개에 옮기고, 모든 표시된 우물에 대해 반복하여 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 플레이트를 복제하려면 이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 두 번째 빈 96웰 라운드 하단 플레이트로 옮기고 표시된 모든 우물에 대해 이 과정을 반복합니다. 마지막으로, 항생제로 RPMI의 200 마이크로 리터로 빈 우물을 채웁니다.플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 중복 플레이트가 24~48시간 동안 배양한 후 모든 웰에 항생제를 가진 RPMI의 100마이크로리터를 첨가하여 다시 복제합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 100 마이크로 리터를 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 전송합니다.이 두 개의 중복 플레이트 중 하나를 인큐베이터에 넣습니다. 먼저 잘 당 PMA / 이오노마이신 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터를 추가하여, 유세포 측정에 대한 새로운 중복 플레이트의 두 번째를 사용하여 세포를 자극합니다. 24 시간 동안 배양하고 텍스트에 설명 된 바와 같이 유동 세포 측정에 대한 세포를 준비합니다.전방 및 측면 분산의 크기를 기반으로 실행 가능한 단일 셀을 게이트합니다. 유동 세포측정에 의한 형광 기자 유전자 발현을 분석한다. PCR에 의해 단일 셀 클론을 선별하기 위해, 선택한 리포터 서열에 기초하여 PCR을 선별하기 위한 디자인 프라이머 P5 및 P6, 리포터 시퀀스의 500~800개의 기본 쌍을 증폭한다.양포 제어 PCR의 경우, 설계 프라이머 P7및 P8은 630개의 기본 쌍을 야생형, 비표적 게놈 궤적으로 증폭시다. 타겟팅 벡터 백본 서열의 특이하지 않은 통합을 위한 컨트롤로 타겟팅 벡터 백본의 500~600개의 기본 쌍을 증폭시키는 세 번째 프라이머 쌍을 디자인합니다. 두 번째 중복 플레이트의 클론이 충분히 성장하면 실온에서 300-G에서 10 분 동안 플레이트를 원심분리하여 PCR 스크리닝을 준비하십시오.조심스럽게 상체를 벗고 세포 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 PBS 100 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 300G에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. PBS를 제거하고 잘 당 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.파이펫을 부드럽게 섞고 서스펜션을 새로운 PCR 플레이트로 옮기습니다. 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 열사이클러에서 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 10분 동안 최대 속도로 셀 이물질을 원심분리한 후, 상체판을 새로운 PCR 플레이트로 옮긴다.이 셀 용액 10 마이크로 리터를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 110 마이크로리터의 증류된 H2O로 채워 넣습니다. 그런 다음 열순환기에서 섭씨 99도에서 10분 동안 배양하여 이 셀의 단백질Ase K.Use 2 마이크로리터를 템플릿으로 비활성화하고 스크리닝, 제어 및 백본 PCR에 상업용 PCR 마스터 믹스를 사용합니다. PCR을 96웰 형식으로 38~40사이클의 PCR 증폭에 실행합니다.PCR 제품의 5개의 마이크로리터를 사용하고 1.5%의 아가로즈 TAE 젤로 실행하여 유동 세포측정및 PCR 결과를 분석하고 결합하여 단일 세포 클론을 확인합니다. PMA/이오노마이신 유도 후 기자 유전자 발현은 통합 부위에 따라 세포의 4~12%에서 혈류 세포및 PCR 모두에 의해 확인되었다. 5-프라임 및 3-프라임 통합 접합을 위한 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 PCR 분석은 표적 이벤트가 발생했는지 확인합니다.유동 세포측정에 의한 올바른 표적화를 위한 단일 세포 클론의 스크리닝 후, 높은, 낮음 및 형광 기자 유전자 발현이 없는 클론이 관찰되었다. 단일 셀 클론은 또한 리포터 특정 프라이머 및 제어 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인되었다. 클론은 기자 특정 프로브와 기자 외부의 게놈 프로브 바인딩을 사용하여 남부 블롯에 의한 올바른 표적화를 위해 PCR 검사를 양성으로 확인했습니다.남부 블롯 분석에서 올바른 대역 크기만 보였고, 이종수구우스가 기자를 통합하여 남부 블롯에 의해 PCR 결과를 확인하는 것이 중요하다는 것을 보여주었습니다. 클론은 또한 양양성 단세포 클론을 더 확인하기 위해 시퀀싱에 의해 분석되었다. 대상 부위의 시퀀싱:상동성 적선, 기자가 통합되지 않았고, Cas9 유도 돌연변이가 밝혀졌다.일단 마스터되면, HIV 기자 라인의 생성은 2 ~ 3 개월 안에 달성 될 수있다. 타겟팅하기 전에 해결하려는 연구 질문에 따라 통합 사이트와 적절한 리포터를 선택하는 데 충분한 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 기자는 예를 들어 원하는 경우 다른 HIV 규제 요소를 포함할 수 있습니다.이 절차에 따라, 세포주 예를 들어, 통합 부위에 따라 리포터 LTR의 전사 활동에 대한 상이한 대기 시간 상승 제의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 가이드 RNA 를 설계하고 벡터를 타겟팅하고, JUrkat 세포에서 CRISPR/Cas9 기반 게놈 엔지니어링을 수행하고, 단일 셀 클론을 생성하고, FACS 및 PCR 스크리닝에 의해 올바르게 표적화된 클론을 선택하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 복제 능력이 있는 HIV 리포터와 함께 일하기로 선택한 경우 BSL3 안전 조건하에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...