Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Vi takker Britta Weseloh og Bettina Abel for teknisk assistanse. Vi takker også Arne Düsedau og Jana Hennesen (flyt cytometri teknologiplattform, Heinrich Pette Institut) for kundestøtte.

1. målretting strategi for genomet Engineering og målretting vektor (tv) Design
Merk: Det første trinnet i genomet engineering innebærer utvalg og generering av de nødvendige verktøyene for CRISPR-Cas9-mediert målretting. Utvalg av et genomisk integrering området locus, valg av celle type for målretting og design av en HIV-avledet reporter for integrasjon bør foran dette trinnet. Denne protokollen beskriver målretting av en HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA minimal reporter i J...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Her beskriver vi en protokoll for å generere HIV-1-derivert Jurkat reporter modeller med valgt proviral integrasjon nettsteder bruke CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering.
Flere punkter av protokollen krever nøye på planleggingsstadiet. Først locus bli målrettet bør velges nøye, som noen loci kan være lettere å mål enn andre (f.eks, avhengig av chromatin status i regionen og målet sekvens selv). Gjentatte sekvenser er vanskelig å klone til målretting vektoren og er ofte...

Integrering av proviral DNA i vert genomet på infeksjon er en avgjørende skritt i livet syklus av humant immunsviktvirus (HIV). Etter integrasjon, HIV vedvarer ved å etablere ventetid i varige CD4 + T celle undergrupper som minne CD4 + T celler. HIV integrering synes å være ikke tilfeldig1,2. En rekke genomisk hotspots med recurrently integrerte proviral DNA påvist i flere studier gjennom sekvensering av integrering i akutt og kronisk infiserte individer2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, på noen av disse integrasjon, ble samme locus oppdaget i en stor andel av infiserte celler, fører til ideen at integrering på tilbakevendende nettsteder kan positivt påvirke klonal ekspansjon1.
For å fremme vår forståelse av betydningen av tilbakevendende integrering nettsteder, må proviral integrasjon området valg utforskes. Imidlertid flere tekniske aspekter hemme studere HIV integrering valg og konsekvensene. Bredt brukt celle kultur modeller for HIV ventetid som JLat cellelinjer ikke reflekterer klinisk relevante tilbakevendende integrering nettsteder9. Studier på primære pasient-avledede celler, på den ene siden, aktiverer beskrivelse av integrasjon området landskap av sekvensering men tillater ikke for funksjonell analyser. Til vår kunnskap er ingen tilstrekkelig eksperimentell modell tilgjengelig funksjonelt analysere valgte klinisk relevante integrering nettsteder.
Her presenterer vi en detaljert arbeidsflyt for å generere nye modeller for HIV-smitte ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering teknologi. Arbeidsflyten beskrevet her kan brukes til å generere T celle-avledet reporter linjer som modell HIV-smitte, bærer genomically integrert proviral reporter på et valgt integrering område. De er dermed fungerer som nye verktøy for å utforske hvordan webområdet proviral integrering kan påvirke HIV biologi og hvordan provirus reagerer på ulike behandling strategier (f.eks, inducibility av ventetid snu agenter). Vår metode bruker fordelene av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering, i hvilken integrering av reporteren sekvensen homologe rekombinasjon er tilrettelagt av en Cas9 nuclease-indusert dobbel-strand pause på målområdet. Målområder for integrering er valgt etter avstand til beskrevet tilbakevendende integrering nettsteder fra studier på HIV-infiserte individer og tilstedeværelsen av egnet PAM motiver Cas9-mediert genomet engineering.
I våre eksemplarisk resultater, har vi fokusert på BACH2 gene locus, hvilke koder for BTB og CNC homologi transcriptional regulator 2. Kronisk HIV-infiserte individer på antiretroviral behandling er BACH2 en av loci viser berikelse av integrert HIV-1 sekvenser3,6,7,8,10. Vi har valgt en minimal HIV-avledet reporter bestående av HIV-1-derivert lang terminal gjenta (VTH), tdTomato koding sekvens og storfe veksthormon (BGH) polyadenylation signal (PA), som vi har rettet mot to bestemte områder i BACH2 intron 5. Presentert protokollen er optimalisert for Jurkat celler, en menneskelig CD4 + T celle-avledet suspensjon cellen linje, men andre cellen linjer kan brukes og protokollen tilpasset deretter. Vi presenterer en detaljert arbeidsflyt for valg av målområdet, bygging av målet vektor med homologi armer, CRISPR-Cas9-mediert målretting av reporteren i valgt genomisk område, generasjon og valg av klonal linjer og omfattende bekreftelse nyopprettede, målrettet reporter cellen linjer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

Humant immunsviktvirus (HIV) integrerer sin proviral DNA ikke-tilfeldig i verten celle genomet tilbakevendende nettsteder og genomisk hotspots. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av romanen i vitro modeller for HIV-infeksjon med valgte genomisk integrering webområder ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering-teknologi. Med denne metoden kan en reporter rekke valg integreres i et målrettet, valgte genomisk locus, reflekterer klinisk relevante integrering nettsteder.
I protokollen, er utformingen av en HIV-avledet reporter og velge av et mål sted og gRNA beskrevet. En målretting vektor med homologi våpen er konstruert og transfekterte i Jurkat T celler. Reporter sekvensen er målrettet genomisk området av homologe rekombinasjon tilrettelagt av en Cas9-mediert dobbel-strand pause på målområdet. Encellede kloner er generert og vist for målretting hendelser av flowcytometri og PCR. Valgte kloner deretter utvides, og riktig målgruppe er bekreftet av PCR, sekvensering og Southern blotting. Potensielle off-målet hendelser av CRISPR-Cas9-mediert genomet engineering analyseres.
At modellen HIV-smitte på klinisk relevante integrering nettsteder kan genereres ved hjelp av denne protokollen, romanen celle kultur systemer. Selv om generering av encellede kloner og verifisering av riktig reporter sekvens integrering er tidkrevende, er resulterende klonal linjene kraftige verktøy for å analysere funksjonelt proviral integrasjon området valg.

I dette representant eksperimentet har vi valgt å målrette en minimal HIV-1-derivert reporter bestående av en polyA-signalet rekkefølge til to loci i intron 5 BACH2 gen17med LTR og tdTomato-coding sekvens. Loci for målretting ble valgt etter avstand til publiserte tilbakevendende integrering nettsteder funnet i forskjellige studier på primær T-celler fra HIV-infiserte pasienter2,4,<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Vi presenterer en genomet engineering arbeidsflyt for generering av nye i vitro modeller for HIV-1 smitte som recapitulate proviral integrering på utvalgte genomisk områder. Målretting av HIV-avledet journalister er tilrettelagt av CRISPR-Cas9-mediert, områdespesifikke genomet manipulasjon. Detaljert protokoller for encellede klone generasjon, screening og riktig målretting verifisering tilbys.

CRISPR-Cas9-baserte genomet Engineering generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 smitte med valgte Proviral integrasjon nettsteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Denne metoden kan bidra til å svare på spørsmålet om hvordan HIV provirus integrasjon påvirker androgynous genuttrykk, og hvorfor visse genomiske integrasjonssteder blir valgt i det siste HIV-infiserte celler. Den største fordelen med denne teknikken er at in-vitro-modeller for HIV-infeksjon kan produseres, som bærer pro-virale reportere rettet mot utvalgte integreringssteder ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genomteknikk. Å demonstrere prosedyren vil være Thomas Walther, en ph.d.-student, og Julia Bialek, en postdoktor fra laboratoriet mitt.Begynn med å bruke UCSC Genome Browser til å trekke ut genomisk sekvens av ønsket genomisk locus som skal målrettes. For å velge veiledning RNA-er på 20 nukleotider for målretting av den valgte genomiske locus, bruk E-CRISP webverktøy. Velg deretter Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.Referanse genom som organismen og input 2, 000 basepar av genomisk sekvens, som dekker ønsket genomisk locus tidligere ekstrahert. Start et guide-RNA-søk ved hjelp av mellomstore programinnstillinger med noen PAM, noen fem-prime-base, off-targets tolererer uoverensstemmelser og ekskludert introner og CPG-øyer. Fra listen med mulige guide-RNA-design som vises, velger du en guide RNA med høy poengsum for spesifisitet og effektivitet, som er nær som mulig til ønsket genomisk locus som skal målrettes.Åpne NCBI Blast-nettleseren for å sprenge den valgte guide-RNA-sekvensen mot referansegenomet. Hvis du vil se etter unikheten til det valgte bindende området for guide-RNA, velger du først mennesket som genom og skriver deretter inn guide-RNA-sekvensen som spørringssekvensen. Velg deretter svært lignende sekvenser eller Mega Blast som programmet for å sikre at guide-RNA-sekvensen er unik.Deretter velger du in-silico 1, 000 basispar, oppstrøms og nedstrøms av guide-RNA-sekvens fra genomisk sekvens hentet i begynnelsen. Bruk disse utvalgte 1000 basisparene, oppstrøms og nedstrøms som fem-prime og tre-prime homology armer for målretting vektor konstruksjon og tilstøtende reporter sekvens som skal målrettes. 24 timer før transfection av jurkat T-celler, forberede en komplett 6-brønns plate av cellene for en enkelt målretting eksperiment.For å starte, plate 1, 250, 000 celler i 2,5 milliliter RPMI 1640 med kosttilskudd og uten antibiotika, per brønn. På følgende dag, legg til mikrogram sirkulær målretting vektor og to mikrogram Cas9 og guide-RNA uttrykk plasmid per brønn, til 250 mikroliter av kommersielle RPMI medium optimalisert for transfection, i et reaksjonsrør og bland godt ved vortexing. Tilsett deretter sakte 12 mikroliter transinfeksjonsmiddel til DNA-mediet uten å berøre rørveggen.Knips røret og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Tilsett blandingen dråpe til en brønn av celler. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius og 5%karbondioksid.Og 72 timer etter transfection, trekk de trans infiserte cellene, telle dem og forberede seg på berikelse av FACS. Etter å ha bekreftet målrettingshendelsene i den blandede målrettede cellepopulasjonen, begynner du å generere encellekloner ved å forberede jurkatbetingede medier på forhånd, ved å samle RPMI med antibiotika fra friske, ubehandlede jurkat T-celler. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 300 G, og filtrer supernatanten med en 25 milliliter sprøyte, ved hjelp av et 0,22 mikrometerfilter til nye, 50 milliliter koniske rør.Telle målrettede celler tidligere beriket av FACS, 10 til 14 dager etter ekspansjon, og deretter fortynne dem i RPMI med antibiotika til en konsentrasjon på 100.000 celler per milliliter. Fortynn 100 mikroliter av denne cellefortynningen med 9,9 milliliter medium for å oppnå 1000 celler per milliliter. Deretter fortynner en milliliter av denne fortynningen med ni milliliter medium til en konsentrasjon på 100 celler per milliliter.For å plate 96 brønnplater for å inneholde en celle per brønn, bland forsiktig en milliliter 100-celler-per-milliliter løsning med fem milliliter tilstandsmedium og fire milliliter friskt medium, i et sterilt reagensreservoar. Deretter bruker du en flerkanals pipette til å legge til 100 mikroliter av den respektive cellefortynningen per brønn med nye 96-brønn runde bunnplater for å oppnå en og to celler per brønnfortynninger. Stable de 96 brønnplatene og dekk hver stabel med en seksbrønns plate som inneholder tre milliliter PBS per brønn.Inkuber platene ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid, i tre uker. Etter fullført inkubasjon bekrefter visuelt tilstedeværelsen av voksne kolonier ved hjelp av lett mikroskopi med fire ganger forstørrelse, og merk brønnene med dyrkede kolonier. Forsiktig resuspend celler av en merket godt ved pipettering.Overfør 100 mikroliter av denne cellesuspensjonen til en brønn med nylaget 96-brønns rund bunnplate med 100 mikroliter RPMI med antibiotika, per vel og gjenta for alle merkede brønner, bland forsiktig ved pipettering. For å duplisere platen, overfør 100 mikroliter av denne cellefjæringen til en annen tom, 96-brønns rundbunnsplate og gjenta denne prosessen for alle merkede brønner. Til slutt fyller du de tomme brønnene med 200 mikroliter RPMI med antibiotika.Inkuber platene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter at duplikatplaten har inkubert i 24 til 48 timer duplisere den igjen ved å legge til 100 mikroliter RPMI med antibiotika til alle brønner. Bruk en flerkanals pipette til å blande forsiktig og overføre 100 mikroliter til hver brønn av en ny 96-brønn rund bunnplate.Plasser en av disse to dupliserte platene i inkubatoren. Bruk den andre av de nye duplikatplatene for strømningscytometri, ved først å legge til fem mikroliter pma / ionomycin Master Mix per brønn, for å stimulere cellene. Inkuber i 24 timer og klargjør cellene for strømningscytometri som beskrevet i teksten.Gate noen levedyktige enkeltceller basert på størrelse i fremover og sidelengs scatter. Analyser fluorescerende reportergenuttrykk ved strømningscytometri. Hvis du vil screene encellede kloner etter PCR, utformer du primere P5 og P6 for screening av PCR basert på den valgte reportersekvensen, for å forsterke 500 til 800 basispar av reportersekvensen.For pcr med positiv kontroll, design primere P7 og P8 som forsterker 630 base par av en vill-type, ikke-målrettet genomisk locus. Design et tredje primerpar som forsterker 500 til 600 basispar av målrettingsvektorradbenet som en kontroll for uspesifær integrering av målrettingsvektorradradssekvenser. Når klonene i den andre duplikatplaten har vokst tilstrekkelig, klargjør dem for PCR-screening ved først å sentrifugere platen i 10 minutter ved 300-G ved romtemperatur.Ta forsiktig av det overnaturlige, og pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten. Vask cellene med 100 mikroliter PBS ved skånsom pipettering, sentrifuger platen i fem minutter ved 300 G ved romtemperatur. Fjern PBS og tilsett 200 mikroliter lysisbuffer per brønn.Pipetten forsiktig for å blande, og overføre suspensjonen til en ny PCR-plate. Forsegle platen med parafinfilm og inkuber i en time ved 55 grader Celsius i en termocycler. Etter å ha sentrifugert ned celleavfall ved maksimal hastighet i 10 minutter, overfør supernatanten til en ny PCR-plate.Tilsett 10 mikroliter av denne cellelylaten til hver brønn av en 96-brønns PCR-plate fylt med 110 mikroliter destillert H2O, per brønn. Inkuber deretter i 10 minutter ved 99 grader Celsius i en termocycler, for å inaktivere proteinase K.Bruk 2 mikroliter av denne cellen lysate som en mal og bruk en kommersiell PCR master mix for screening, kontroll og ryggrad PCR. Kjør PCR for 38 til 40 sykluser med PCR-forsterkning i et 96-brønnsformat.Bruk fem mikroliter pcr-produkter og kjør dem på en 1,5% agarose TAE gel for å analysere og kombinere strømningscytometri og PCR-resultater, for å bekrefte enkeltcellekloner. Reportergenuttrykk etter PMA/Ionomycin-induksjon ble bekreftet av både strømningscytometri og PCR i fire til 12 % av cellene, avhengig av integreringsstedet. PCR-analyse av genomisk DNA ved hjelp av primere for fem-prime og tre-prime integrasjon krysset, bekrefter at målretting hendelser har skjedd.Etter screening av encellede kloner for korrekt målretting ved strømningscytometri ble det observert kloner med høyt, lavt og ingen fluorescerende reportergenuttrykk. Encellekloner ble også bekreftet av PCR ved hjelp av reporterspesifikke primere og kontroll primere. Kloner bekreftet positivt i screening PCR ble brukt og videre analysert for riktig målretting av Southern blot, ved hjelp av en reporter-spesifikk sonde og en genomisk-sonde binding utenfor reporteren.Bare en del viste riktige båndstørrelser i Southern blot analyse og hadde heterozygously integrert reporteren, viser at det er viktig å verifisere PCR resultater av Southern blot. Kloner ble også analysert ved sekvensering for ytterligere å bekrefte positive encellede kloner. Sekvensering av målstedet:homologe allele, var reporteren ikke hadde integrert, avslørte Cas9-induserte mutasjoner.Når mestret, kan generering av HIV-reporterlinjer oppnås om to til tre måneder. Før målretting er det viktig å bruke nok tid på å velge et integreringsnettsted hos og passende reporter, avhengig av forskningsspørsmålet du ønsker å takle. Journalister kan for eksempel inkludere ulike HIV-regulatoriske elementer hvis ønskelig.Etter denne fremgangsmåten kan cellelinjer for eksempel brukes til å teste effekten av forskjellige latensstigende agenter på transkripsjonsaktiviteten til reporterEN LTR, avhengig av integreringsområdet. Etter å ha sett denne videoen bør du ha en god forståelse av hvordan du genererer integrasjons-site-spesifikke HIV reporter-linjer for å designe guide RNA og målretting vektor, utføre CRISPR / Cas9-baserte genom engineering i jurkat celler, produsere encellede kloner og velge for riktig målrettede kloner av FACS og PCR screening. Ikke glem, at hvis du velger å jobbe med en replikering-kompetent HIV-reporter, må du jobbe under BSL3 sikkerhetsforhold.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging av HIV-1-konvolutt-indusert virologisk Synapse og signaliserer på Syntetiske Lipid bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nye verktøy for å utvide Regulatoriske T-celler fra HIV-1-infiserte individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering av HIV-1 Gag Binding til Giant unilamelære vesikkel (GUV) Membraner

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...