Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Мы благодарим Бритта Weseloh и Bettina Абель для оказания технической помощи. Мы также благодарим Арне Düsedau и Яна Hennesen (поток цитометрии технологическая платформа, Генриха Pette Institut) для технической поддержки.

1. Ориентация стратегии для генома инженерных и ориентации дизайн вектор (ТВ)
Примечание: Первый шаг генома техники включает в себя подбор и создание необходимых инструментов для ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ориентации. Выбор геномной интеграции сайта локус, выб...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Здесь мы описываем протокол для создания ВИЧ-1-производные Jurkat репортер модели с выбранной proviral интеграции сайтов применения ТРИФОСФАТЫ-Cas9-основанные геном инженерии.
Несколько точек протокола требуют пристального внимания на этапе планирования. Во-первых, локус напра?...

Интеграция proviral ДНК в геноме хоста после инфекции является важным шагом в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). После интеграции ВИЧ сохраняется путем установления задержку в долгоживущих подмножеств клеток CD4 + T например CD4 + Т-клеток памяти. Интеграции ВИЧ, по-видимому, не случайные1,2. Ряд очагов геномной с периодически комплексной proviral ДНК была обнаружена в нескольких исследованиях через последовательность интеграции сайтов в остро и хронически инфицированных лиц2,3,4 ,5,6,,78. Интересно, что в некоторых из этих сайтов интеграции, же Локус был обнаружен в большой доли инфицированных клеток, приводит к идее, что интеграции на текущих сайтах может положительно повлиять на клоновых расширения1.
Для продвижения нашего понимания значимости периодических интеграции сайтов, необходимо изучить выбор сайта proviral интеграции. Однако, несколько технических аспектов препятствуют изучению интеграции ВИЧ сайт выбор и последствия. Широко используется модели культуры клеток для задержки ВИЧ как JLat клеточных линий не отражают клинически значимых периодически интеграции сайтов9. Исследования на первичной клетки пациента производные, с одной стороны, включить описание интеграции сайта ландшафта путем sequencing но не позволяют для функционального анализа. Насколько нам известно не адекватные Экспериментальная модель доступна для функционально анализировать выбранный клинически значимых интеграции сайтов.
Здесь мы представляем подробный рабочий процесс для создания новых моделей для ВИЧ-инфекции с использованием генома, основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника. Рабочий процесс описан здесь может использоваться для создания Т клеток, полученных репортер клеточных линий, которые моделируют ВИЧ-инфекции, перевозящих genomically комплексных proviral репортер на сайте выбранного интеграции. Таким образом, они выступают в качестве новых инструментов для изучения влияния на сайте proviral интеграции биологии ВИЧ и как Провирус реагирует на различные лечения (например, inducibility, задержка обратного агентами). Наш метод использует преимущества инженерства основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генома, в котором интеграции репортер последовательности гомологичная рекомбинация облегчается Cas9 Нуклеаза индуцированной двухручьевой перерыв на целевом сайте. Целевые объекты для интеграции выбираются по близости от описанных периодических интеграции сайтов от исследований на ВИЧ инфицированных лиц и наличие подходящих PAM мотивы для машиностроения Cas9-опосредованной генома.
В наши образцовые результаты мы сосредоточились на BACH2 Локус гена, который коды для BTB и CNC гомологии transcriptional регулятор 2. В хронически ВИЧ инфицированных людей на антиретровирусной терапии BACH2 является одним из локусов, показаны обогащения комплексных ВИЧ-1 последовательности3,6,,78,10. Мы выбрали минимальная ВИЧ производные репортер, состоящий из ВИЧ-1-производные длинные концевые повторить (LTR), tdTomato кодирующая последовательность и гормон роста крупного рогатого скота (BGH) сплайсингу сигнала (ПА), которые мы избрали двух определенных сайтов в BACH2 Интрон 5. Представленные протокол оптимизирован для Jurkat клеток, человека CD4 + Т клеток, полученных подвеска клеток линии, но другие ячейки, строки могут быть использованы и протокола, адаптированными таким образом. Мы представляем подробную рабочего процесса для выбора целевого сайта, строительство целевой вектора с гомологии оружия, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной против репортера в выбранный геномной сайт, поколения и выбор клоновых линий и всеобъемлющей проверки созданный, целенаправленных репортер клеточных линий.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

Вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) не случайно интегрирует его proviral ДНК генома клетки хоста на текущих сайтах и геномных горячих точках. Здесь мы представляем подробный протокол для поколения роман в пробирке моделей для ВИЧ-инфекции с выбранной геномной интеграции сайтов с использованием генома, основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника. С помощью этого метода репортер последовательность выбора могут быть интегрированы в целенаправленной, выбранной геномной локус, отражающие клинически значимых интеграции сайтов.
В протоколе описаны дизайн ВИЧ производные репортер и выбор целевого сайта и gRNA последовательности. Ориентации вектора с гомологии оружия построен и transfected в клетки Jurkat T. Репортер последовательность ориентирован на выбранный сайт геномной гомологичная рекомбинация, при содействии Cas9-опосредованной двухручьевой перерыв на целевом сайте. Клоны одной ячейки создаются и экранируется проточной цитометрии и ПЦР для ориентации событий. Выбранный клоны затем расширяется, и правильной ориентации подтверждена ПЦР, последовательности и Южный blotting. Проанализированы потенциальные пробить события ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной генома техники.
Используя этот протокол, Роман клетки культуры системы, модель ВИЧ-инфекции в клинически значимых интеграции сайты могут быть созданы. Хотя поколение одной ячейки клонов и проверка правильного репортер последовательность интеграции является длительным, результирующий клоновых линий являются мощными инструментами, функционально анализировать выбор сайта proviral интеграции.

В этот представитель эксперимента мы выбрали для минимальной ВИЧ-1-производные репортер, состоящий из ЛТР, tdTomato кодирования последовательность и последовательность поля сигнала для двух локусов в Интрон 5 гена BACH217. Локусов для ориентации были выбраны по ?...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Мы представляем генома инженерных рабочих процессов для создания новых моделей в пробирке для инфекции ВИЧ-1, что итог proviral интеграции на отдельных участках генома. Нападения на журналистов ВИЧ производный облегчается манипуляция ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной, участкам генома. Предоставляются подробные протоколы для одной ячейки клонов поколения, скрининг и правильной ориентации проверки.

Основанный ТРИФОСФАТЫ Cas9 генома инженерии для создания модели Jurkat репортер для инфекции ВИЧ-1 с выбранной Proviral интеграции сайтов

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Этот метод может помочь ответить на вопрос о том, как интеграция ВИЧ-провируса влияет на андрогинную экспрессию генов и почему в последнее время в ВИЧ-инфицированных клетках отбираются определенные сайты геномной интеграции. Основным преимуществом этого метода является то, что в пробирке модели для ВИЧ-инфекции могут быть произведены, которые несут провирусных репортеров, ориентированных на выбранных интеграционных сайтов с использованием CRISPR / Cas9 основе генома инженерии. Демонстрация процедуры будет Томас Вальтер, аспирант, и Джулия Bialek, postdoc из моей лаборатории.Начните с использования UCSC Genome Browser для извлечения геномной последовательности желаемого геномного локуса, который будет мишенью. Для выбора руководства РНК из 20 нуклеотидов для таргетинга выбранного геномного локуса используйте веб-инструмент E-CRISP. Затем выберите, Homo Sapiens Геном Справочный консорциум геном человека: Построить 38.Справочный геном как организм и входной 2000 базовых пар геномной последовательности, охватывающих желаемый геномный локус, ранее извлеченный. Начните поиск руководства-РНК, используя средние настройки приложения с любыми PAM, любые пять-премьер-базы, вне цели терпеть несоответствия и исключены интроны и острова CPG. Из списка с возможным руководством РНК конструкций, которые появляются, выберите руководство РНК с высоким баллом за специфику и эффективность, которая близка как можно ближе к желаемой геномного локуса, которые будут направлены.Откройте браузер NCBI Blast, чтобы взорвать выбранную последовательность направляющий выступ-РНК против эталонного генома. Чтобы проверить уникальность выбранного направляющего-РНК-связывающего сайта, сначала выберите человека в качестве генома, а затем ввемите последовательность направляющего-РНК в качестве последовательности запросов. Затем выберите очень похожие последовательности или Mega Blast в качестве программы, чтобы убедиться, что руководство-РНК последовательность уникальна.После этого выберите в силико 1000 базовых пар, вверх и вниз по течению последовательности направляющий-РНК из геномной последовательности, извлеченной в начале. Используйте эти выбранные 1000 базовых пар, вверх по течению и вниз по течению, как пять-премьер и три-премьер гомологии оружия для ориентации векторного строительства и примыстить репортер последовательности, которые будут направлены. За 24 часа до трансфекции юркатных Т-клеток подготовьйте одну полную пластину из 6 колодец клеток для одного целевого эксперимента.Для начала пластина 1, 250 000 клеток в 2,5 миллилитров RPMI 1640 с добавками и без антибиотиков, на колодец. На следующий день добавьте к микрограммам круговой вектор таргетинга и два микрограмма Cas9 и плазмиду экспрессии направляющих РНК на колодец, до 250 микролитров коммерческой RPMI среды, оптимизированной для трансфекции, в реакционной трубке и хорошо перемешивайте вихрем. Затем медленно добавьте 12 микролитров трансфектного агента в СРЕДУ ДНК, не касаясь стенки трубки.Флик трубки и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавить смесь dropwise к одному хорошо клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.А через 72 часа после трансфекции потяните трансфицированные клетки, посчитайте их и подготовьтесь к обогащению FACS. После подтверждения целевых событий в смешанной целевой популяции клеток, начать генерации одноклеточных клонов путем подготовки jurkat-кондиционированных среды заранее, путем сбора RPMI с антибиотиками из здоровых, необработанных jurkat Т-клеток. Центрифуга труб в течение 5 минут при 300 G, и фильтровать супернатант с 25 миллилитров шприц, используя 0,22 микрометрового фильтра в новые, 50 миллилитров конических труб.Подсчитайте целевые клетки, ранее обогащенные FACS, через 10-14 дней после расширения, а затем разбавьте их в RPMI антибиотиками до концентрации 100 000 клеток на миллилитр. Разбавить 100 микролитров этого разбавления клеток с 9,9 миллилитров среднего для достижения 1000 клеток на миллилитр. Затем разбавьте один миллилитр этого разбавления девятью миллилитров среднего до концентрации 100 клеток на миллилитр.Чтобы пластина 96 хорошо пластины, чтобы содержать одну клетку на колодец, осторожно смешать один миллилитр 100-клеток на миллилитр раствор с пятью миллилитров состояние среднего и четыре миллилитров свежей среды, в стерильных реагентов резервуара. Затем используйте многоканарный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров соответствующего разбавления клеток на колодец новых 96-хорошо круглых нижних пластин для достижения одной и двух ячеек на разбавления. Стек 96 хорошо пластин и покрыть каждый стек с шестью хорошо пластины, содержащие три миллилитров PBS на колодец.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию во влажном инкубаторе с 5%carbon dioxide, в течение трех недель. После завершения инкубации визуально подтвердите наличие выращенных колоний с помощью световой микроскопии с четырехкратным увеличением и отметйте колодцы выращенными колониями. Аккуратно resuspend клетки одного отмечены хорошо pipetting.Перенесите 100 микролитров этой клеточной подвески в один колодец свежеприготовленной 96-хорошо круглой нижней пластины со 100 микролитров RPMI с антибиотиками, на колодец и повторите для всех отмеченных скважин, аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Чтобы дублировать пластину, перенесите 100 микролитров этой клеточной подвески во вторую пустую, 96-ну круглую нижнюю пластину и повторите этот процесс для всех отмеченных скважин. Наконец, заполните пустые скважины 200 микролитров RPMI с антибиотиками.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. После дубликат пластины инкубируется в течение 24 до 48 часов дублировать его снова, добавив 100 микролитров RPMI с антибиотиками в каждой хорошо. Используйте многоканарный пипетку, чтобы аккуратно перемешать и передать 100 микролитров в каждую колодец новой 96-хорошо круглой нижней пластины.Поместите одну из этих двух дубликатов пластин в инкубатор. Используйте второй из новых дублирующих пластин для цитометрии потока, сначала добавив пять микролитров PMA/Ionomycin Master Mix на колодец, чтобы стимулировать клетки. Инкубировать в течение 24 часов и подготовить клетки для потока цитометрии, как описано в тексте.Ворота любых жизнеспособных одиночных ячеек на основе размера в вперед и в сторону рассеяния. Проанализируйте экспрессию генов флуоресцентного репортера с помощью цитометрии потока. Для проверки одноклеточных клонов ПЦР, дизайн грунтовки P5 и P6 для скрининга ПЦР на основе выбранной последовательности репортера, чтобы усилить от 500 до 800 базовых пар репортер последовательности.Для положительного контроля ПЦР, дизайн грунтовки P7 и P8, который усиливает 630 базовых пар дикого типа, не целевых геномных локусов. Создать третью грунтовочную пару, которая усиливает от 500 до 600 базовых пар позвоночника таргетинга-вектора в качестве контроля для неспецифической интеграции последовательностей позвоночника целевых векторов. После того, как клоны во второй дубликатной пластине выросли достаточно, подготовить их к скринингу ПЦР, сначала центрифугирование пластины в течение 10 минут при 300-G при комнатной температуре.Аккуратно смахив супернатант, убедившись, что не беспокоить клеточные гранулы. Вымойте клетки 100 микролитров PBS нежным пипетки, центрифугирование пластины в течение пяти минут при 300 Г при комнатной температуре. Удалите PBS и добавьте 200 микролитров буфера лиза на колодец.Пипетту аккуратно перемешать и перенести подвеску на новую пластину ПЦР. Печать пластины с парафиновой пленкой и инкубировать в течение одного часа при 55 градусов по Цельсию в термоциклер. После центрифугирования клеточного мусора на максимальной скорости в течение 10 минут, перенесите супернатант на новую пластину ПЦР.Добавьте 10 микролитров этого листата клетки к каждому колодец 96-хорошо ПЦР пластины заполнены 110 микролитров дистиллированной H2O, на колодец. Затем инкубировать в течение 10 минут при 99 градусах по Цельсию в термоциклере, инактивировать протеиназу K.Use 2 микролитров этой клетки лизать в качестве шаблона и использовать коммерческий PCR мастер смесь для скрининга, управления и позвоночника ПЦР. Запустите PCR для 38 до 40 циклов усиления ПЦР в формате 96-колодец.Используйте пять микролитров продуктов ПЦР и запустите их на 1,5%agarose TAE гель для анализа и объединения потока цитометрии и PCR результаты, чтобы подтвердить одноклеточных клонов. Экспрессия гена репортера после индукции PMA/Ionomycin была подтверждена как цитометрией потока, так и ПЦР в четырех-12% клеток, в зависимости от места интеграции. ПЦР-анализ геномной ДНК с использованием праймеров для пяти-премьер и трех-премьер-интеграции соединения, подтверждают, что таргетинг событий имели место.После скрининга одноклеточных клонов для правильного таргетинга по цитометрии потока наблюдались клоны с высокой, низкой и отсутствием экспрессии генов флуоресцентного репортера. Одноклеточные клоны были также подтверждены ПЦР с помощью репортеров конкретных грунтовки и управления грунтовки. Клоны подтвердили положительные в скрининге ПЦР были израсходованы и дополнительно проанализированы для правильного ориентации на южной пятно, используя репортер-специфический зонд и геномного зонда связывания за пределами репортера.Только часть показала правильные размеры полосы в южном анализе помарки и гетерозигно интегрировала репортера, показывая, что важно проверить результаты ПЦР по южной помарке. Клоны были также проанализированы с помощью секвенирования для дальнейшего подтверждения положительных одноклеточных клонов. Секвенирование целевого сайта: гомологичный аллель, были репортер не интегрированы, показали Cas9-индуцированных мутаций.После освоения, генерация ВИЧ-репортер линий может быть достигнуто в течение двух-трех месяцев. До таргетинга важно тратить достаточно времени на выбор интеграционного сайта и соответствующего репортера, в зависимости от исследовательского вопроса, который вы хотели бы решить. Репортеры могут, например, при желании включать различные нормативные элементы в связи с ВИЧ.Следуя этой процедуре, клеточные линии могут, например, использоваться для проверки влияния различных агентов роста задержки на транскрипционную активность репортера LTR, в зависимости от места его интеграции. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать интеграцию-сайт конкретных ВИЧ-репортер-линий для разработки руководства РНК и ориентации вектор, выполняя CRISPR / Cas9 основе генома инженерных в jurkat клеток, производство одноклеточных клонов и выбор для правильно целевых клонов FACS и PCR скрининга. Не забывайте, что если вы решили работать с репликацией компетентных ВИЧ-репортер, вы должны работать в условиях безопасности BSL3.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Прогнозирование ВИЧ-1 корецепторов использования (тропизм) анализом последовательности использования Генотипическая подход

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Новые методы для расширения регуляторных Т-клеток от ВИЧ-1-инфицированных

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Визуализация ВИЧ-1 Gag Связывание с Giant однослойные везикулы (ГУВ) Мембраны

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...