Name: crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

Britta Weseloh ve Bettina Abel teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz de Arne Düsedau ve Jana Hennesen (akış sitometresi teknoloji platformu, Heinrich Pette Institut) Teknik destek için teşekkür ederiz.

1. Mühendislik ve vektör (tv) tasarımı hedefleyen genom için strateji hedefleme
Not: İlk adım genom mühendislik seçimi ve CRISPR-Cas9-aracılı hedefleme için gerekli araçları nesil içerir. Genomik tümleştirme sitesi locus yelpazesi, hedefleme için hücre tipi seçimi ve tasarım bir HIV kaynaklı muhabiri tümleştirme için bu adımı öncesinde. Bu iletişim kuralı bir HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA en az muhabir Jurkat hedef hücrelere hedefleme açıklar. CRISPR-C...

<ol>
	<li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence.">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li><li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells.">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).</li><li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection.">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li><li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4++T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy.">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li><li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection.">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li><li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro.">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li><li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression.">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li><li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li><li>CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013)</li><li>Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014)</li><li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/</a> (2013)</li><li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCTop:+An+intuitive,+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool.">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li><li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection.">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li><li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems.">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).</li><li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity.">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li><li>Jensen, K. T., Fl&#248;e, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency.">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li><li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+CD4+++T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo.">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li><li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+effects+influence+HIV+latency+reversal.">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li></ol>

Burada, CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik uygulama seçilen proviral tümleştirme sitelerle HIV-1-türetilmiş Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için bir protokol açıklayın.
İletişim kuralı birkaç puan planlama aşamasında dikkat gerektirir. Gibi bazı loci diğerlerinden daha hedef için daha kolay olabilir ilk olarak, var olmak hedef için odağı dikkatli seçilmelidir (örneğin, bölge ve hedef kromatin durumuna bağlı olarak kendisi sıra). Tekrarlayan diziler...

Ana bilgisayar genom enfeksiyon üzerine proviral DNA entegrasyonu insan immün yetmezlik virüsü (HIV) yaşam döngüsünün kritik bir adımdır. Tümleştirme, HIV uzun ömürlü CD4 + T hücre alt kümeleri bellek CD4 + T hücreleri gibi gecikme süresi kurarak devam ederse. HIV tümleştirme rasgele1,2gibi görünüyor. Akut ve kronik olarak enfekte bireylerin2,3,4 entegrasyon sitelerin nasıl yapılacağını aracılığıyla çeşitli çalışmalarda yerleştirilmiştir entegre proviral DNA ile genomik etkin noktaları bir dizi algılandı ,5,6,7,8. İlginçtir, entegrasyon sitelerin bazıları enfekte hücreleri, tekrarlayan sitelerin entegrasyon klonal genişleme1olumlu etkileyebilir fikir önde gelen büyük bir kısmını aynı locus algılandı.
Tekrarlayan tümleştirme siteleri önemi bizim anlayışı ilerletmek için proviral tümleştirme site seçim keşfedilmeyi gerekir. Ancak, birkaç teknik yönleri eğitim HIV tümleştirme engel site seçimi ve sonuçları. Geniş JLat hücre hatları klinik tekrarlayan tümleştirme siteleri9yansıtmıyor gibi hücre kültür modelleri HIV gecikme süresi için kullanılır. Çalışmalar birincil hasta elde edilen hücrelerde, bir yandan, entegrasyon sitesi peyzaj açıklaması sıralama tarafından etkinleştirir, ancak fonksiyonel analiz için izin vermez. Bilgimizi, yeterli bir deneysel model işlevsel olarak seçilen klinik entegrasyon siteleri analiz etmek kullanılabilir.
Burada CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak HIV enfeksiyonu için roman modelleri oluşturmak için ayrıntılı bir iş akışı mevcut. Burada açıklanan iş akışı HIV enfeksiyonu, genomically entegre proviral muhabir seçilen tümleştirme sitesinde taşıyan model T hücre kaynaklı muhabiri hücre satırlarını oluşturmak için kullanılabilir. Böylece proviral tümleştirme sitesi HIV biyoloji nasıl etkileyebilir ve provirus farklı tedavi stratejileri (örneğin, inducibility gecikme süresi ters kayıt ajanları tarafından) nasıl yanıt vereceğini keşfetmek için yeni araçları olarak hizmet vermekteyiz. Bizim Yöntem CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik, muhabir hangi Wuppertal'de sırası Homolog rekombinasyon tarafından bir Cas9 nükleaz kaynaklı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırdı avantajları kullanır. Hedef siteleri tümleştirme için HIV enfekte bireylerin ve Cas9-aracılı genom Mühendisliği için uygun PAM motifleri varlığı üzerine çalışmalar açıklanan tekrarlayan tümleştirme sitelere yakınlık göre seçilir.
Örnek sonuçlarımızda BACH2 gen odağı, BTB ve CNC Homoloji transkripsiyon regülatör 2 için hangi kodları üzerinde odaklanmıştır. Kronik olarak HIV enfekte bireylerin antiretroviral tedavi, BACH2 zenginleştirme entegre HIV-1 dizileri3,6,7,8,10gösterilen loci biridir. Uzun terminal tekrar (LTR) HIV-1-türetilmiş, tdTomato kodlama dizisi ve sığır büyüme hormonu (BGH) Poliadenilasyon sinyal (PA), biz BACH2 intron 5 iki belirli sitelere hedef içeren en az bir HIV kaynaklı muhabir seçtik. Sunulan Protokolü Jurkat hücreleri, bir insan CD4 + T hücre kaynaklı süspansiyon hücre kültürünü, ama diğer hücre hatları kullanılabilir ve buna göre uyarlanmış protokolü için optimize edilmiştir. Biz hedef site, inşaat hedef vektörünün Homoloji silah, CRISPR-Cas9-aracılı seçilen genomik, üretimi ve site seçimi klonal satırlarının muhabir hedefleme ve kapsamlı ile seçim için ayrıntılı bir iş akışı mevcut doğrulama Yeni oluşturulan, hedeflenen muhabiri hücre satırı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>vector for expression of SpCas9 and gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK</td>
			<td>GeneArt</td>
			<td></td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA3.1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V79020</td>
			<td>mammalian expression vector for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5520S</td>
			<td>Assembly cloning kit used for target vector generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPlus Precision PCR System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600210</td>
			<td>DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate (round-bottom)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>tissue culture plates for dilution plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530 L</td>
			<td>DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td>dimethyl sulfoxide as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2) Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9021S</td>
			<td>MgCl2 solution as PCR additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME HotMasterMix</td>
			<td>5PRIME</td>
			<td>2200400</td>
			<td>ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA blood mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51106</td>
			<td>DNA isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South Africa Charge</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P123002</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 &#181;g/ml</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2212</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-Jurkat</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR2125</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634-1MG</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>filter unit for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026280</td>
			<td>tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amershan Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1520B</td>
			<td>positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Prime</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585592001</td>
			<td>kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td>chromatography spin-columns for purification of labeled DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9-based genome engineering to generate jurkat reporter models for hiv-1 infection with selected proviral integration sites

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) proviral DNA'sının ana hücre genomu tekrarlayan siteleri ve genomik etkin noktaları olmayan rasgele tümleştirir. Burada ayrıntılı bir protokol roman tüp bebek modelleri üretimi için HIV enfeksiyonu için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak seçilen genomik tümleştirme siteleri ile mevcut. Bu yöntemle, seçim bir muhabir dizi bir hedefli, seçilen genomik locus klinik entegrasyon siteleri yansıtan entegre edilebilir.
İletişim kuralında, HIV kaynaklı bir muhabir tasarımı ve bir hedef site ve gRNA dizi seçme açıklanmıştır. Hedefleme vektör Homoloji silah ile inşa edilmiştir ve Jurkat T hücre içine transfected. Muhabir sıra Homolog rekombinasyon bir Cas9-aracılı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırılmış tarafından seçilen genomik siteye hedeflenmektedir. Tek hücre klonlar oluşturulan ve olaylar hedefleme için ekranlı akış sitometresi ve PCR tarafından. Seçili klonlar sonra genişletilir ve doğru hedefleyen PCR, sıralama ve Southern Blot tarafından doğrulanır. CRISPR-Cas9-aracılı genom mühendislik potansiyel hedef kapalı olayları analiz edilir.
Bu iletişim kuralı, roman hücre kültür sistemleri kullanarak bu modeli HIV enfeksiyonu klinik entegrasyon sitelerde oluşturulabilir. Tek hücre klonlar oluşturma ve doğrulama doğru muhabir sıra entegrasyon zaman alıcı olsa da, elde edilen klonal satırları işlevsel olarak proviral tümleştirme site seçim analiz etmek için güçlü araçlardır.

Temsilcisi bu deneyde LTR, tdTomato kodlama dizisi ve iki loci intron 5 BACH2 gen17dizisine polyA-sinyal oluşan en az bir HIV-1-türetilmiş muhabir hedeflemek seçtiniz. Hedefleme için loci yayımlanmış tekrarlayan tümleştirme yerler HIV infekte hastaların2,4,5,6birincil T hücreleri üzerinde farklı çalışmalarda bulundu ...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites at JoVE.com

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Bu yöntem, HIV provirüs entegrasyonunun androjen gen ekspresyonunu nasıl etkilediği ve son zamanlarda HIV ile enfekte olmuş hücrelerde bazı genomik entegrasyon alanlarının neden seçildiği sorusunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği kullanılarak seçilmiş entegrasyon bölgelerine yönelik pro-viral muhabirleri taşıyan HIV enfeksiyonu için in-vitro modellerin üretilebiliyor olmasıdır. Prosedürü gösteren Thomas Walther, bir doktora öğrencisi ve Julia Bialek, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır.UcSC Genom Tarayıcısı kullanarak hedef alınması istenen genomik lokus genomik dizisini in-silico-ayıklamak için başlayın. Seçilen genomik lokus hedeflemeiçin 20 nükleotit kılavuzu RNA'larını seçmek için E-CRISP web aracını kullanın. Sonra seçin, Homo Sapiens Genom Referans Konsorsiyumu İnsan Genomu:Build 38.Organizma olarak referans genom ve daha önce çıkarılan istenilen genomik lokusu kapsayan genomik dizinin 2,000 baz çiftini girin. Herhangi bir PAM, herhangi bir beş asal taban, off-targets uyumsuzlukları tolere ve dışlanmış introns ve CPG adaları ile orta uygulama ayarlarını kullanarak bir rehber-RNA arama başlatın. Görünen olası kılavuz-RNA tasarımları ile listeden, hedeflenen istenilen genomik lokus mümkün olduğunca yakın özgüllük ve verimlilik için yüksek puan ile bir rehber RNA seçin.Seçilen kılavuz-RNA dizisini referans genomuna karşı patlatmak için NCBI Blast tarayıcısını açın. Seçili kılavuz-RNA bağlama alanının benzersizliğini kontrol etmek için, önce genom olarak insan seçin ve ardından kılavuz-RNA dizisini sorgu sırası olarak girin. Ardından, kılavuz-RNA dizisinin benzersiz olduğundan emin olmak için program olarak son derece benzer dizileri veya Mega Blast'ı seçin.Bundan sonra, başlangıçta çıkarılan genomik diziden in-silico 1, 000 baz çiftlerini, kılavuz-RNA dizisini yukarı ve aşağı doğru seçin. Bu seçilen 1.000 baz çifti, yukarı ve aşağı akım vektör yapımı ve bitişik muhabir dizisi hedef için hedef için beş asal ve üç-prime homoloji silah olarak kullanın hedeflenecek. Jurkat T-hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat önce, tek bir hedefleme deneyi için hücrelerin tam 6 kuyulu bir plakasını hazırlayın.Başlamak için, plaka 1, 250, 000 hücreleri RPMI 2.5 mililitre 1640 takviyeleri ile ve antibiyotik olmadan, başına. Ertesi gün, dairesel hedefleme vektörü ve iki mikrogram Cas9 ve kılavuz-RNA ekspresyonu plazmidini, transfeksiyon için optimize edilmiş 250 mikrolitre ticari RPMI ortamına, bir reaksiyon tüpünde ekleyin ve girdap ile iyice karıştırın. Daha sonra tüp duvarına dokunmadan DNA ortamına yavaş yavaş 12 mikrolitre transfeksiyon maddesi ekleyin.Tüp ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka flick. Karışımı bir hücre kuyusuna damlayla ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Transfeksiyondan 72 saat sonra transfected hücreleri çekin, sayılayın ve FACS ile zenginleştirmeye hazırlanın. Karışık hedefli hücre popülasyonundaki hedefleme olaylarını doğruladıktan sonra, sağlıklı, tedavi edilmemiş jurkat T-hücrelerinden alınan antibiyotiklerle RPMI'yi toplayarak, jurkat koşullu ortamı önceden hazırlayarak tek hücreli klonlar üretmeye başlayın. Tüpleri 300 G'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni, 50 mililitrelik konik tüplere 0,22 mikrometre filtre kullanarak 25 mililitrelik şırıngayla filtreleyin.Daha önce FACS tarafından zenginleştirilmiş hedeflenen hücreleri sayın, genişlemeden 10 ila 14 gün sonra, ve sonra rpmi antibiyotik ile seyreltmek 100, mililitre başına 000 hücre. Seyreltmek 100 mikrolitre bu hücre seyreltme ile 9.9 mililitre orta mililitre ulaşmak için 1,000 mililitre başına. Sonra mililitre başına 100 hücre konsantrasyonu için orta dokuz mililitre ile bu seyreltme bir mililitre seyreltin.Plaka 96 iyi plakalar iyi başına bir hücre içeren, hafifçe bir mililitre 100 hücre başına mililitre çözelti silikat beş mililitre orta ve dört mililitre taze orta ile karıştırın, steril bir reaktif rezervuar. Daha sonra, iyi seyreltme başına bir ve iki hücre elde etmek için yeni 96-iyi yuvarlak alt plakalar kuyu başına ilgili hücre seyreltme 100 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. 96 kuyu plakasını istifleyin ve her desteyi her kuyubaşına üç mililitre PBS içeren altı kuyulu bir plakayla kaplayın.Plakaları 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksitle üç hafta kuluçkaya yatırın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, dört kat büyütme ile ışık mikroskobu kullanarak yetiştirilen kolonilerin varlığını görsel olarak doğrulayın ve yetiştirilen koloniler ile kuyuları işaretleyin. Borulama ile iyi işaretlenmiş bir hücreyi yavaşça yeniden askıya alın.Bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini, 100 mikrolitre RPMI'nin 100 mikrolitresini antibiyotiklerle birlikte yeni hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın, her iyi ve işaretli tüm kuyular için tekrarlayın, pipetleme ile hafifçe karıştırın. Plakayı çoğaltmak için, bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ikinci bir boş, 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın ve bu işlemi işaretli tüm kuyular için tekrarlayın. Son olarak, antibiyotikler ile RPMI 200 mikrolitre ile boş kuyuları doldurun.Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Yinelenen plaka 24 ila 48 saat boyunca kuluçkaya yattıktan sonra her kuyuya 100 mikrolitre RPMI antibiyotik ekleyerek tekrar kopyalanır. Yavaşça karıştırmak ve yeni bir 96-kuyu yuvarlak alt plaka her kuyuya 100 mikrolitre aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.Bu iki plakadan birini kuvöze yerleştirin. Hücreleri uyarmak için, ilk pma / Ionomycin Master Mix beş mikrolitre ekleyerek, akış sitometri için yeni yinelenen plakalar ikinci kullanın. 24 saat kuluçka ya da metinde açıklandığı gibi akış sitometrisi için hücreleri hazırlayın.İleri ve yan dağılımboyutuna göre herhangi bir canlı tek hücre kapısı. Floresan muhabir gen ekspresyonunu akış sitometrisi ile analiz edin. PCR tarafından tek hücreli klonları taramak için, seçilen muhabir sırasına göre PCR tarama için p5 ve P6 tasarım astarları, muhabir dizisinin 500 ila 800 baz çiftleri yükseltmek için.Pozitif kontrol PCR için, p7 ve P8 tasarım astarları bir vahşi tip, hedefsiz genomik lokus 630 baz çiftleri güçlendirir. Hedefleme vektör omurga dizilerinin spesifik olmayan entegrasyonu için bir kontrol olarak hedefleme vektör omurgasının 500 ila 600 baz çiftini güçlendiren üçüncü bir astar çifti tasarla. İkinci yinelenen plakadaki klonlar yeterince büyüdükten sonra, oda sıcaklığında 300-G'de plakayı 10 dakika santrifüj ederek PCR taraması için hazırlayın.Dikkatlice supernatant çıkarmak, hücre pelet rahatsız değil emin olun. Hücreleri 100 mikrolitre PBS ile hafif pipetleme ile yıkayın ve tabağı oda sıcaklığında 300 G'da beş dakika santrifüj edin. PBS çıkarın ve kuyu başına lysis tampon 200 mikrolitre ekleyin.Pipet yavaşça karıştırın ve süspansiyonu yeni bir PCR plakasına aktarın. Plakayı parafin filmle kapatın ve bir termocycler içinde 55 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Hücre enkazını maksimum hızda 10 dakika santrifüj ettikten sonra, supernatant'ı yeni bir PCR plakasına aktarın.Her kuyuda 110 mikrolitre distile H2O ile dolu 96 kuyulu PCR plakanın her kuyuya bu hücreli lysate'den 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra bir termocycler 99 derece santigrat 10 dakika kuluçka, proteinaz K.Use 2 mikrolitre bu hücre lizat bir şablon olarak inaktive ve tarama, kontrol ve omurga PCR için ticari bir PCR ana karışımı kullanın. PCR'yi 96-iyi formatta 38 ila 40 devir PCR amplifikasyonu için çalıştırın.PCR ürünleri beş mikrolitre kullanın ve analiz etmek ve akış sitometri ve PCR sonuçlarını birleştirmek için% 1.5 agarose TAE jel üzerinde çalıştırın, tek hücreli klonlar onaylamak için. PMA/İonomisin indüksiyonu sonrası muhabir gen ekspresyonu, entegrasyon bölgesine bağlı olarak hücrelerin %4-12'sinde hem akış sitometrisi hem de PCR ile doğrulandı. Beş-prime ve üç-prime entegrasyon kavşak için astar kullanarak genomik DNA PCR analizi, hedefleme olayları meydana geldiğini doğrular.Akış sitometrisi ile doğru hedefleme için tek hücreli klonların taranması ndan sonra, yüksek, düşük ve floresan muhabir gen ekspresyonu olmayan klonlar gözlendi. Tek hücreli klonlar da PCR tarafından muhabire özgü astarlar ve kontrol astarları kullanılarak doğrulandı. Klonlar tarama PCR pozitif doğruladı harcanan ve daha güney leke tarafından doğru hedefleme için analiz, bir muhabir özel prob ve muhabir dışında bir genomik sonda bağlayıcı kullanarak.Sadece bir kısmı Güney leke analizinde doğru bant boyutları gösterdi ve heterozigously muhabiri entegre vardı, Güney leke tarafından PCR sonuçlarını doğrulamak için önemli olduğunu gösteren. Klonlar da daha pozitif tek hücreli klonlar onaylamak için sıralama ile analiz edildi. Hedef alanın dizilimi: homolog alel, muhabirentegre değildi, Cas9 kaynaklı mutasyonlar ortaya.Bir kez hakim, HIV muhabir hatları nesil iki ila üç ay içinde gerçekleştirilebilir. Hedeflemeden önce, uğraşmak istediğiniz araştırma sorusuna bağlı olarak, bir entegrasyon sitesi ve uygun bir muhabir seçmek için yeterli zaman harcamak önemlidir. Muhabirler örneğin, istenirse farklı HIV düzenleyici unsurlar içerebilir.Bu yordamı takiben, hücre hatları, örneğin, entegrasyon sitesine bağlı olarak, muhabir LTR transkripsiyonel etkinliği üzerinde farklı gecikme yükselen ajanların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kılavuz RNA'lar ve hedefleme vektörü tasarlamak, jurkat hücrelerinde CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği yapmak, tek hücreli klonlar üretmek ve FACS ve PCR taraması ile doğru hedeflenmiş klonlar için seçim yapmak için entegrasyon sitesine özgü HIV muhabiri hatlarının nasıl oluşturacağınızı iyi anlamanız gerekir. Unutmayın, eğer bir çoğaltma-yetkili HIV muhabiri ile çalışmayı seçerseniz, BSL3 güvenlik koşulları altında çalışmak gerekir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...