Name: a controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis at JoVE.com

خاص بفضل هاريسون كلير والحيوان رعاية مرفق في مستشفى بحوث المعهد (بكتشر كولومبيا البريطانية للأطفال) لدعمهم في أعمال الحيوان، وكذلك للدكتور بو-يان تشنغ على توجيهاتهم ومدخلات بشأن رصد الحيوان ورفاه.

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13,+with+projections+to+inform+post-2015+priorities:+an+updated+systematic+analysis.">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis.">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists.">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li><li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CXC+ligand+10/CXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis.">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li><li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis.">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li><li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates.">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li><li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1/11+ablation.">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18.">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li><li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis.">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).</li><li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates.">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li><li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation.">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li><li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis.">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).</li><li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis.">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li><li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model.">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li><li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats.">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).</li><li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice.">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li><li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats.">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li><li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response.">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li><li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models.">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li><li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , (1998).</li><li>Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humane+endpoints+in+shock+research.">Humane endpoints in shock research.</a> SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints.">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).</li></ol>

الدكتور جيمس ين يتلقى الدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)/الوطني معهد العلوم الطبية العامة (R01GM128452) وفي المعاهد الوطنية للصحة/الوطنيةيونيس كينيدي شرايفر معهد صحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) ( R01HD089939).

لقد الفئران حديثي الولادة بعد الولادة جداً محدودة التنقل وتفشل في حق أنفسهم بعد وضعها على ظهورهم، حتى عندما النمسوية. من 7 دول، سن الفئران الطعن في هذا النموذج، مجموعة من حركة تمتد من حقوق موبايل موبايل تقارير المعاملات المالية وقد لوحظ في الفئران دون منازع، مع فارق هام، إلا وهي أن ماوس دون منازع في هذا العمر لم يتم عرض السلوك السبات العميق تقارير المعاملات المالية. إلا الفئران وتحدي مع الانتان أنه لوحظ أن تصبح السبات العميق تقارير المعاملات المالية؛ ولذلك، يمكن أن تكون هذه الاستجابة علامة على شدة المرض. يجري منتبهة لقطع من زاوية 90 درجة من الأفقي لحركة الورك يسمح للتعيين متسقة ودقيقة من حركة الورك عدم المبالاة أو المتنقلة في الفئران. الإطار الزمني ل 4 s لترى إذا كان ماوس يمكن الحق نفسه اختير للفئران دون منازع كانت قادرة على الدوام حق أنفسهم داخل هذا الإطار الزمني. المتكررة تجنب القياس الماوس نفسها، بينما الوقت حق أنفسهم وقياس حركة الورك واقتصر على 4 s، لتجنب تعب مفرطة الماوس، وخلاف ذلك يمكن أن يؤثر على قدرتها على الحصول على الغذاء والدفء ويمكن أن تؤثر به التشخيص للحصول على أفضل. تصحيح نفسها من اليسار واليمين ولوحظت، وأعلى درجات واستخدمت لتحديد ما إذا كان الماوس على نقطة نهاية إنسانية، لأنه تم العثور على بعض أجهزة الماوس لعرض تقارير المعاملات المالية--نونموبيلي على جانب واحد حتى الآن تنقل أعلى على الجانب الأخرى وب (ه) قادراً على استرداد في نهاية المطاف.
سجل النظام المستخدمة لتقييم صحة الماوس تعتمد على تطبيق قطع القاطع لما هو مجموعة حركة، وعليه، يمكن أن تكون عرضه للتحيز الفردية. وكان تدريب الموظفين معا لضمان كل شخص سجل الفئران نفسها؛ ومع ذلك، ستبقى هناك يرجح أن مستوى الذاتية مما يؤدي إلى تباين. وتم تقييم اتساق التهديف بوجود سبعة الباحثين الذين لم يجر سابقا رصد الماوس الولدان تعلم الشروط المبينة في هذا البروتوكول، والفيديو، ثم، بشكل مستقل تعيين السلوكيات وتحديد إنسانية نقطة النهاية. ولوحظ دقة 97% مع التهديف أجريت على الفئران تحدي 60، مما يوحي بأن التحيز الفردية لا تلعب دوراً كبيرا في التعيينات السلوكية من هذا الطراز. بروتوكول الرصد السلوكي قدم يستند إلى الملاحظات للحيوانات التي طعنت في 7 دول، ولكن الفئران الذين تقل أعمارهم عن 6 أيام في حالة صحية دون منازع لا يمكن استمرار الحق أنفسهم. وبالتالي، تعذر تطبيق معايير وصف نقطة النهاية إنسانية مباشرة للفئران الأصغر سنا. إذا استخدمت فئران أصغر سنا في هذا النموذج التجريبي أو إذا تم تطبيق نموذج تحدي مختلفة مع حركية مختلف الأمراض، ثم نقطة النهاية إنسانية مناسبة يجب أن تكون معايير وضعت وتجريبها لتجنب القتل الرحيم للفئران التي بخلاف ذلك، وفي نهاية المطاف، استرداد. يعرض سجل النظام وسيلة قوية لتحسين تصنيف إنسانية نقطة النهاية، باختبار وتأكيد، يمكن أن يحتمل أن تطبق على نماذج أخرى.
إعداد كل من الملاط سيكال أو استخدام سلالة جديدة من الماوس المطلوبة ريتيتراتيون الجرعة الملاط سيكال لإدارة تحقيق جرعة مميتة مماثلة. توحيد كل إعداد بقراءات الاهتمام، إلا وهي البقاء على قيد الحياة، بدلاً من إعطاء نفس العد الجرثومي. ترك تركيز كل إعداد الملاط سيكال البكتيرية قابلة للحياة تختلف قليلاً، ويحتمل أن تكون بسبب الاختلافات في البكتيريا commensal الجهة المانحة أو بسبب الفروق في الوزن في مصفاة خلية من بوستفيلتريشن الأسهم الملاط سيكال. أثناء معايرة الملاط سيكل، ليتر الأول والثاني تم تقسيمها إلى مجموعتين وطعن كل نصف من القمامة مع أحد جرعتين حيث أن كل من الجرعات سيتم اختبارها في اثنين ليتر. إذا لم يتطابق مع معدل البقاء على قيد الحياة الناتجة عن المستوى المطلوب، ثم جرعة التحدي كان أما تزيد أو تنقص بنسبة 5%-10% وتكرار هذه التجربة. واستخدمت ليتر متعددة لمراعاة الاختلافات القمامة للقمامة التي يمكن أن تسبب المقاومة أو زيادة القابلية للانتان عبر القمامة. من المهم لدقة عيار الأسهم الملاط سيكال مع كل إعداد جديدة لضمان أن المعايرة الجديدة من الملاط سيكال مماثلة للسابقة الملاط سيكال الاستعدادات. ولوحظت فترات الزائدة الضوضاء والاهتزاز، وعلى وجه التحديد أثناء ضغط الأسفلت، وتشييد مبنى مجاور والطريق، زيادة التوتر في السدود. وهذا يرتبط بزيادة معدلات الإبدال، وتتأثر وفيات التجارب البقاء على قيد الحياة، حتى تؤثر على الفئران دون منازع، مما يشير إلى أن يمكن أن يكون هناك تأثيرات دخيلة على بقاء المواليد التي تحتاج أيضا إلى مراقبة ل.
وشملت الأساليب السابقة لإعداد المخزون الملاط سيكل استخدام ملاط سيكل جديدة أو إعداد الملاط سيكل المجمدة، باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك التخزين في الجلسرين التي ستحول لا محالة خلال التحدي. بينما يوفر استخدام ملاط سيكل جديدة ميزة وجود تركيبة بكتيرية أقرب إلى محتويات سيكل الأصلي، هناك الخطر الفرق بين الفئران فرادى المانحين بسبب اختلاف البكتيريا كومينسال. بينما تم تصغير هذا باستخدام الجهات المانحة سيكال من نفس البائع مع الحد الأدنى من الوقت بين وصول وتطور التجربة، هذا يمكن أن تصبح خياراً تكلفة باهظة لبعض المختبرات وتوقيت النقل والإمداد تحديا آخر في وجود تجربة الفئران مطابقة سن متاح عند ابتداء من ملاط سيكل في الفئران حديثي الولادة التي كانت 7 أيام. واستخدمت طريقة بديلة لاستخدام ملاط سيكال جديدة، حيث تم تجميع محتويات متعددة المانحين الكبار سيكال وحراكه في D5W، المجمدة في-80 درجة مئوية دون والغليسيرول، وإذابة قاسمة واحد في وقت واحد للتجارب. يمكن تحويل استخدام ملاط سيكل المانحين الكبار لدراسة الانتان الوليدي يحتمل أن تكون نوعا من البكتيريا الموجودة في الطين سيكل أن الماوس الولدان لم يتعرض ل، إلا أنها استراتيجية تسمح لدراسة الانتان الوليدي الفئران و وقد استخدمت لدراسة البيولوجيا الماوس الولدان في14،،من1315الماضية. وقد تضعف الملاط سيكل في D5W لتوفير التغذية للبكتيريا، مما سمح بإنشاء العدوى النشطة بمجرد تم حقن البكتيريا، وأنجز لتقليد توافر المغذيات في التجويف الصفاقى أثناء التهاب الأمعاء والقولون النّاخر. والغليسيرول لم يدرج كعامل استقرار في تجميد البكتيريا بسبب الآثار الجانبية السلبية المحتملة التي يمكن أن تنشأ من حقن والغليسيرول وحدها. إذا كان قد أدرج والغليسيرول في إعداد الملاط سيكل، ثم الضرر المحتمل أن والغليسيرول وحدها يمكن حمل سوف تحتاج لفحصها لجانب بما في ذلك الجلسرين فقط (تفتقر سيكل ملاط) حقنه في الفئران، مما سيزيد من الماوس الاستخدام. صلاحية البكتيريا مخزون الملاط سيكال تم اختباره بعد تجميد الأسهم الملاط سيكال دون والغليسيرول ووجد أن تكون ثابتة، بدون أي تغيير في تركيز البكتيريا في مختبرين منفصلة من نفس إعداد الملاط سيكال المخزنة في-80 درجة مئوية أكثر 6 فترة شهر. هذا يوحي بأن التخزين دون والغليسيرول عمليا في تقديم نتيجة البيولوجي متسقة. كما يسمح باستخدام الجزء الأكبر--أعد تجميد الأسهم الملاط سيكل لاستخدام الفئران التي ولدت داخل المنظمة، خفض التكلفة، والاستفادة من الفئران الذكور التي يمكن أن الفائض من تربية، وبالتالي تقليل الهدر الماوس.
من المهم تحديد التحديات الفاشلة في الفئران تجنب إضافة الضوضاء الإضافية للنظام. بعد أن خضع لحقنه داخل من الملاط سيكال، لوحظت الفئران لوجود انتفاخ تحت الجلد، مما يدل حقن فاشلة التي تمت فعلا تحت الجلد. لوحظت الفئران لتسرب في موقع الحقن، سواء مباشرة بعد إزالة الإبرة وبعد السماح لهم باتخاذ خطوة بعد الحقن، نظراً لأن الفئران في بعض الأحيان تسرب (نادراً) إلا بعد تحريك الطرف المصاب موقع الحقن باتخاذ خطوة. وجود انتفاخ أو تسرب عقب الحقن أدى إلى إزالة الماوس من التحليل. بعد كل شيء، أما هذه يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة نظراً لكمية غير صحيحة من الملاط سيكال حقن بفارق 5% بجرعة التحدي وقد لوحظ أن تؤثر على بقاء اللاحقة.
التحدي الملاط سيكل تجارب غالباً ما يلزم متفاوتة الهدف جرعات مميتة مع اختلاف جرعات معدلة حسب الوزن. ونتيجة لهذا، يمكن أن تتراوح أحجام حقن من قدر ضئيل من 20 ميليلتر وتصل إلى 100 ميليلتر. متناسباً مع الخطأ التجريبية المرتبطة بإبرة الميت يتغير حجم أيضا جنبا إلى جنب مع حجم الحقن وزيادة صعوبة مباشرة مقارنة جرعات مختلفة. مع تعديل بسيط لتوحيد حجم الحقن، يتم إزالة مصدر هذا الفرق من التجربة.
نظام الرصد السلوكي للماوس الولدان المستخدمة في هذا البروتوكول هو أول نوعه. القصد الباحثين على إجراء البحوث الأخلاقية مع الفئران حديثي الولادة غالباً ما يواجهون تحديات نقص الموارد لتقييم رفاه الحيوان في هذا العصر. ويبدأ نظام الرصد المقدمة بديهية ومتسقة لمعالجة هذه الفجوة في المعرفة. الأهم من ذلك، هذا النهج القائم على الأدلة ليس فقط يزيد من جودة البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها ولكن، في الوقت نفسه، كما يقلل من معاناة الحيوانات التجريبية.

الانتان أسباب الرئيسية للوفيات البشرية المعدية حديثي الولادة1. لأن الانتان حديثي الولادة هو غير مفهومة، وقد أحرز تقدم ضئيل في تحديد المواليد المعرضين للخطر مبكرا أثناء المرض وتطوير علاجات فعالة أو الحقنات. وهذا يتطلب استخدام نماذج حيوانية للانتان فهم أفضل للعملية واختبار التدخلات الممكنة. وعلاوة على ذلك، القوارض الكبار تستجيب بشكل مختلف للانتان، مع فروق معتد بها إحصائيا في العدد من البكتيريا إدارة للحصول على نفس الجرعة القاتلة (LD) والاختلافات في الاستجابة المضيف الناتج مقارنة بالأطفال حديثي الولادة2. وهكذا، قد الانتان الوليدي دراستها في حديثي الولادة. وقد استخدمت العديد من النماذج الانتان الكبار في البحوث الانتان. وتشمل هذه المعايير تحدي عن طريق الحقن الوريدي الكائنات محددة متورطة في الانتان البشرية الكبار أو ربط سيكل وثقب (قوانين وسياسات المنافسة). قوانين وسياسات المنافسة هو نموذج تحدي ذاتية حيث الأعور هو جراحيا معزولة ومتصلة وثقب للسماح بتسرب محتويات الأمعاء في الصفاق، مما يؤدي في النهاية إلى منهجية نشر الميكروبات وهذه المنتجات3. ومع ذلك، العملية الجراحية اللازمة لوضع قوانين وسياسات المنافسة القاتلة للحيوانات حديثي الولادة؛ ولذلك، أسلوب بديل ضروري لتقليد أنه التحدي المتمثل في قوانين وسياسات المنافسة للحث على الانتان الوليدي. تم تطوير نموذج الملاط سيكل للانتان الوليدي أنه تلبية لهذه الحاجة، حيث تحصد سيكل محتويات الحيوانات وعلقت في سكر العنب العقيمة 5% في الماء (D5W) وإينترابيريتونيلي حقن الفئران حديثي الولادة2. وهذا أصبح، منذ ذلك الحين، نموذج شعبية متزايدة لدراسة الانتان في الحيوانات حديثي الولادة والكبار على حد سواء وتقدماً جوهريا رؤى الميكانيكية في هذا المرض عملية4،،من56،7 ،،من89،10،11،12،13،،من1415.
ونظرا لتزايد استخدام هذا النموذج ورغبة الباحثين في مقارنة النتائج مباشرة عبر المنشورات، هناك حاجة للجوانب التقنية يكون وصف جيد وموحدة عبر الدراسات. توحيد ينطبق على ثلاثة جوانب لهذا النموذج، إلا وهي ط) إعداد المخزون الملاط سيكل، ثانيا) إعداد مختبرين التحدي للحقن في الحيوانات التجريبية، وثالثاً) تعريف نقطة النهاية إنسانية حيث الحيوانات وتعتبر نونسورفيفورس في تجارب التحدي. على وجه التحديد، أساليب إعداد المخزون الملاط سيكل غالباً المشار إليها المادة الأصلية الأخذ بنموذج2. ملخص موجز لهذا النموذج هو أن محتويات سيكل من الفئران الكبار كان حصادها، علقت في D5W العقيمة إلى تركيز 80 ملغ/مل، وتستخدم ضمن ح 2 لحقن الحيوانات التجريبية. يستخدم هذا النموذج الأصلي الفئران من نفس الفئة العمرية، من نفس الموقع البائع، الذي كانوا يسكنون في مرافقها البحثية الخاصة بكل منها لأقل من 2 أسابيع قبل الحصاد محتويات سيكل. أيضا بشكل كبير زيادة استخدام الفئران المولدة داخليا، على الرغم من تخفيض التكلفة من تسليم البائع العادية، ويسمح باستخدام فئران الزائدة من طائفة أوسع من الجنس والعمر، مانح إلى التغير. وهذا الدافع وراء تطوير أسلوب بديل، حيث تم تجميع محتويات سيكل من الفئران متعددة معا لإعداد مخزون كبير، الذي كان آنذاك الكوتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية13. تم تكييف هذا الأسلوب البديل من عدة مجموعات14،15. بيد أن التكيف مع أسفرت عن بعض الاختلافات التقنية، سواء في وسائط التخزين المستخدمة (والغليسيرول 10% أو 15% أو D5W وحدها)، وفي استراتيجية للترشيح لإزالة الجسيمات (الترشيح متعدد المراحل عن طريق مكم 860، ومن ثم، مكم 190 التصفية، أو الفرد تصفيات من خلال 100 ميكرومتر أو 70 ميكرون المرشحات)13،،من1415. حقن والغليسيرول وحدها يمكن أن يسبب الضرر، نظراً لأن الحقن والغليسيرول 25-50% وقد استخدمت كنموذج القوارض من الإصابة الكلوية16،17،،من1819، 20. لتجنب الآثار الجانبية غير المقصودة الجلسرين، يتم تجميد إعداد المخزون الملاط سيكل للفئران في هذه الدراسة في D5W دون والغليسيرول، ويتم إجراء الاختبارات لبقاء البكتيرية من مخزن في-80 درجة مئوية. أن استراتيجية الترشيح المستخدمة في هذه الدراسة هي مرور واحد من خلال عامل تصفية ميكرومتر 70، الذي لا يقارن مباشرة باستراتيجيات الترشيح الأخرى المذكورة.
قد تختلف من منشأة إلى منشأة الجرعات المميتة المعدلة حسب الوزن من الملاط سيكال حقن وينبغي أن يكون تيتيريد بها للفتك المرجوة لمجموعات الأفراد. بجرعات مختلفة من التحدي، تغيير حجم التحدي المصاحبة لها بالضرورة. ومع ذلك، أبلغ هذا التفصيل المنهجي لا قبل. وعلاوة على ذلك، استراتيجيات للإجراءات القياسية، مثل حقن داخل، نادراً ما توضع في حدود الأدب، ولكن التقنيات الفردية قد تؤثر على ما إذا كان التسرب عند حقن الفئران حديثي الولادة وتؤثر نتائجها النهائية.
الرفق بالحيوان، بما في ذلك تعريف نقطة النهاية إنسانية، جانبا أساسيا من هذا النموذج، وفي أي نموذج للعدوى والتهاب في القوارض21. في عام 1998، نشر "المجلس الكندي" على الحيوان الرعاية (ككاك) مبادئ توجيهية واسعة النطاق لتحديد نقطة النهاية إنسانية، تحديد نقطة النهاية إنسانية كما "أي ألم الفعلية أو المحتملة أو الشدة أو عدم الراحة ينبغي التقليل إلى أدنى حد أو التخفيف منها عن طريق اختيار أقرب وقت نقطة النهاية التي متوافقة مع أهداف البحوث العلمية "22. آخرون أيضا الحذر أن النهاية إنسانية يجب أن ينشأ على أساس المبررات العلمية ليس على تفسير ذاتي للحيوان الدولة وحدها21. بينما هناك ثروة موارد السريرية، والسلوكية، والمعايير المستندة إلى علامة على حالة الجسم لنقطة النهاية إنسانية، حتى في سياق العدوى والتهاب تحديداً21،،من2324، أيا من هذه ، بما في ذلك المبادئ التوجيهية ككاك لنقطة النهاية إنسانية22، أذكر الفئران حديثي الولادة. وهكذا، نقاط النهاية إنسانية لها ما يبررها موضوعيا وعلميا أصعب بكثير إقامة الحيوانات الوليدة، نظراً لقدراتها المحدودة على السلوكية وعدم وجود أدلة من المعايير مثل فقدان الوزن، الذي يستخدم عادة للكبار الفئران. في الوقت الراهن، المعايير لنقطة النهاية إنسانية المستخدمة للفئران حديثي الولادة 5 إلى 12 يوم-عمرها في الأدب الملاط سيكل كل الإشارة مرة أخرى إلى المخطوطة الأصلية التي أدخلت على نموذج2. في هذه الورقة الأصلية، يستند إلى تعريف نقطة النهاية إنسانية للحيوانات الوليدة معيارين؛ إلا وهي موقع الماوس خارج العش (نثر) وعدم وجود بقع الحليب شوهدوا لتؤدي إلى الوفاة في غضون ساعة. مسألة تعقيد في تعيين نقطة نهاية إنسانية ما أن بقع الحليب يصبح من الصعب أن نرى في سلالات الماوس مع الفراء المظلمة، مثل سلالة C57BL/6J العاملين عموما، بعد الأسبوع الأول من الحياة، بينما تراقب الحيوانات المريضة حتى اليوم الرابع عشر من الحياة (DOL). الحيوانات ميتة أخرى، ويمكن الاطلاع على بوستشالينجي عند تطبيق هذه المعايير (تملك المراقبة غير منشورة)؛ وهكذا، تعريف أكثر دقة لنقطة النهاية إنسانية اللازمة للتخفيف من معاناة الحيوانات التجريبية وتجنب وفيات في حالات حيث النتائج يمكن أن تكون دقة تلمس في وقت سابق.
تعرض جميع الجوانب المنهجية الثلاث من طراز الملاط سيكل في إجراءات تشغيل موحدة تفاصيل إعداد مخزون الملاط سيكل، طريقة لحقن الحيوانات التجريبية التي تحافظ على حقن حجم ثابت بين الجرعات و يقلل من خطر تسرب، وتعريفاً لنقطة النهاية إنسانية للفئران 7 إلى 12 يوم-عاماً استناداً إلى نظام النمذجة السلوكية. وكان جمع المعلومات السلوكية الماوس الصحة عشرات من أكثر من 240 الحيوانات التجريبية ومجمعة حسب نتائج النهائي البقاء على قيد الحياة، مما يدل على تعريف تستند إلى الأدلة لنقطة النهاية إنسانية. يتم تقليل معاناة الحيوانات التجريبية بتحديد مرحلة سبات الفئران حديثي الولادة في أقرب وقت ممكن النقطة، بينما يمكن استنتاج نتائج هامة بيولوجيا البقاء على قيد الحياة عن طريق مراقبة المتغيرات الرئيسية. التمثيل المرئي لإعداد الملاط سيكال وسلوك الماوس الولدان ستكون بمثابة مصدر ممتاز لأي مجموعة دراسة الانتان أو الحيوانات نموذج التحدي حديثي الولادة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:609px;" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">0.1 - 20 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0799</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">1.8 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3621</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">100 - 1000 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0801</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:222px;">1 - 200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0800</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:123px;">TB15-25</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:222px;">23G1 needles</td>
			<td style="width:95px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">305145</td>
			<td style="width:171px;">only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">28G 0.5 mL Insulin syringe</td>
			<td style="width:95px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">329461</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">2 mL Cryogenic vial</td>
			<td style="width:95px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430488</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-432-22</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">5 mL pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">6 - 10 week old C57BL/6J adult mice</td>
			<td style="width:95px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">664</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">7 + day old C57BL/6J neonatal mice</td>
			<td style="width:95px;">Bred in house</td>
			<td style="width:123px;">n.a</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td style="width:95px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">352350</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Defibrinated Sheep&#39;s Blood</td>
			<td style="width:95px;">Dalynn</td>
			<td style="width:123px;">HS30-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dextrose 5% Water (D5W)</td>
			<td style="width:95px;">Baxter</td>
			<td style="width:123px;">JB0080</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">&#160;82027-386</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dissecting Scissors, Sharp Tip</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">&#160;82027-592</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">82027-594</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol)</td>
			<td style="width:95px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">HC11001GL</td>
			<td style="width:171px;">diluted to 70% with double distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Ethanol-proof marker; Lab marker</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">EZ Anesthesia Vaporizer</td>
			<td style="width:95px;">EZ Anesthesia</td>
			<td style="width:123px;">EZ-155</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:222px;">Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer)</td>
			<td style="width:95px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:123px;">GER 5287-120V</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:95px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:123px;">CP0406V2</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Micro Spatula</td>
			<td style="width:95px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1983-12</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Pipette-Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td style="width:123px;">4-000-100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-1000</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008653</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-20</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008650</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-200</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008652</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Scale</td>
			<td style="width:95px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">BL 150 S</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Specimen forceps</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">82027-440 / 82027-442</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Square 1000 mL Storage Bottle</td>
			<td style="width:95px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">431433</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Styrofoam board</td>
			<td style="width:95px;">Any</td>
			<td style="width:123px;">n.a</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber</td>
			<td style="width:95px;">Euthanex</td>
			<td style="width:123px;">EZ-178</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Tryptic Soy Agar</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">22091-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:222px;">VX-200 Lab Vortex Mixer</td>
			<td style="width:95px;">Labnet International</td>
			<td style="width:123px;">S0200</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">weigh paper</td>
			<td style="width:95px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">09-898-12B</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis

ويظل الانتان الوليدي عبء عالمي. هناك حاجة إلى نموذج الإكلينيكية للتدخلات الوقائية أو العلاجية الفعالة الشاشة. يمكن الناجم عن الانتان الوليدي الماوس أنه بحقن الملاط سيكل إينترابيريتونيلي في اليوم من الحياة 7 الفئران ورصدها للأسبوع التالي. المقدمة هنا هي الخطوات التفصيلية اللازمة لتنفيذ هذا النموذج الانتان الوليدي. وهذا يشمل جعل أسهم ملاط سيكل متجانسة، إذابته لجرعة ضبط الوزن والقمامة، ومخططا لجدول الرصد، وتعريفاً لصحة الملاحظة الفئات المستخدمة لتحديد نقاط النهاية إنسانية. الجيل من مخزون الملاط سيكل متجانسة من المانحين المجمعة يسمح للإدارة في كثير من ليتر مع مرور الوقت، الحد من التفاوت بين الجهات المانحة، ومنع استخدام والغليسيرول سمية. استراتيجية الرصد المستخدمة تسمح لتوقع نتائج البقاء على قيد الحياة، وتحديد الفئران التي سوف تقدم لاحقاً حتى الموت، مما يسمح لتحديد نقطة النهاية إنسانية سابقة. اثنين من الميزات السلوكية الرئيسية تستخدم لتعريف عشرات الصحة، إلا وهي قدرة الفئران حديثي الولادة حق أنفسهم عند وضعه على ظهورهم، ومستوى الحراك. يمكن أن يحتمل أن تطبق هذه المعايير على عنوان النهاية إنسانية في الدراسات الأخرى المتعلقة بأمراض الأطفال حديثي الولادة في الفئران، طالما يتم إجراء دراسة تجريبية للتأكد من دقتها. وفي الختام، يقدم هذا النهج أسلوب موحد لنموذج الانتان الوليد في الفئران، مع توفير الموارد اللازمة لرعاية الحيوانات المستخدمة لتحديد نقاط النهاية إنسانية مبكرة للحيوانات تحدي تقييم.

Watch this Scientific Journal Video about A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis at JoVE.com

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

يوفر هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء وتقييم الانتان الوليدي في الفئران عمره 7 أيام.

نموذج التحكم ماوس لأنه الانتان الوليدي

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

نموذج الطين cecal لتعفن الدم المتعدد الميكروبات هو أداة قوية لتشريح من فريدة من نوعها حديثي الولادة فيزيولوجيا المرض. يمكن أن يكون متغيرًا ، ولا يتم وصف نقاط النهاية الإنسانية بشكل جيد. هنا نقدم لدينا إجراء موحدة للغاية لإعداد الطين cecal وحقن في الحيوانات التجريبية.وعلاوة على ذلك، نستخدم نهج البيانات المدفوعة لتحديد الجراء المحتضرة في أقرب وقت ممكن. لنبدأ بإعداد مخزون من الطين المجمدة cecal. ويتم ذلك عن طريق تجميع التشنج cecal من خمسة فئران الكبار على الأقل، وتعليق في الماء دكستروز العقيمة، وتخزينها في ناقص 80 للاستخدام في وقت لاحق.يمكنك استخدام الذكور أو الإناث، ولكن يجب الحفاظ على جنس الفئران وعمرها وخلفيتها في تجاربك ثابتة. أولاً، لنعد أدواتنا للتشريح. وتشمل هذه مجموعة من مقص والملقط للجلد ومجموعة ثانية للأعضاء الداخلية.بدوره على خرز الساخنة تعقيم 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تراجع الأدوات في 70٪ الإيثانول ومن ثم غمرها في خرز الساخنة تعقيم لمدة دقيقة واحدة على الأقل. رش حصيرة من المناشف الورقية مع الإيثانول 70٪ ، ثم إزالة الأدوات من التعقيم دون لمس الجزء المعقم من الأداة إلى مقابض غير معقمة من أدوات أخرى.وضعها على منشفة ورقية لتهدئة. تشريح الفئران في خزانة السلامة البيولوجية. دبوس الساقين من الماوس إلى لوحة الستايروفوم باستخدام 23 الإبر قياس حتى الماوس هو البطن.رش البطن مع 70٪ الإيثانول. باستخدام ملقط معقم ومقص، وقطع من خلال الجلد، وتخفيف الجلد من بطانة الصفاق مع مقص، وقطع فتح منطقة مستطيلة من الفخذ إلى القص والجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن. إزالة أي الفراء حول الصفاق.التبديل إلى زوج جديد من الأدوات العقيمة لقطع من خلال الصفاق، مما يجعل أيضا فتحة مستطيلة. تحديد cecum، والتي ينبغي أن يكون تشغيل الجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن عبر الجسم. تعطيل النسيج الضام لتحديد فروع cecum من الأمعاء وقطع cecum بعيدا عن الأمعاء.وضعه على ورقة معقمة من وزن ورقة. باستخدام أدوات عقيمة، وقطع من خلال طرفي cecum. عقد منتصف cecum مع ملقط واستخدام ملعقة معدنية مسطحة لدفع بلطف محتويات cecal من الغايات باستخدام حركة المتداول.جمع المحتوى ووضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي وزنها قبل 15 ملليلتر. محتويات cecal بركة من خمسة فئران كحد أقصى في نفس الأنبوب. وزن الأنبوب مرة أخرى مرة واحدة وقد تم إضافة جميع المحتويات.لحساب حجم الماء دكستروز لإضافة إلى محتويات cecal في كل أنبوب، وتقسيم وزن محتويات cecal في أنبوب من التركيز المطلوب في ملليغرام لكل ملليلتر. الحفاظ على aliquot من الماء dextrose على الجليد لإعادة تعليق محتويات cecal. إضافة الكمية المطلوبة من المياه dextrose إلى 15 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على محتويات cecal.دوامة الأنبوب عموديا وأفقيا لمدة 30 ثانية تقريبا. مراقبة لوجود الجسيمات أكثر من بضعة ملليمترات في القطر، وإذا كان حاضرا، والاستمرار في دوامة حتى اختفت جميع الجسيمات بشكل واضح. ضع أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر على الجليد لجمع الترشيحات وتثبيت مصفاة خلية 70 ميكرومتر معقمة فوق القمة.Pipette أربعة ملليلتر من الطين إعادة تعليق من أنبوب واحد 15 ملليلتر على مصفاة الخلية وإلى أنبوب جمع. إعادة تعليق الجسيمات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات. فقاعات البثق بلطف لزيادة سرعة التصفية مع اثارة محتويات مع تلميح ماصة حتى لا يكون هناك المزيد من السائل يجري تصفيتها.هذا يجب أن يستغرق حوالي 30 ثانية. تغيير مصافي الخلايا بين كل أنبوب من الطين cecal، ولكن تجمع جميع المحتويات في نفس أنبوب جمع 50 ملليلتر. إذا كان المخزون الخاص بك يتجاوز 40 ملليلتر، ثم دوامة لمدة 15 ثانية، ووضع 20 ملليلتر في أنبوب جديد الطرد المركزي.تقسيم الطين إلى قوارير التبريد من 500 ميكرولتر aliquots لكل من. دوامة الطين بين كل قوارير ثلاث. حافظ على المخزون الرئيسي في قارورة على الجليد.عن طريق تخزين aliquots في ناقص 80، مستعمرة الهوائية تشكيل وحدة التركيز في إعداد الطين cecal لا يتغير على مدى فترة ستة أشهر. الآن بعد أن تم إعداد الطين cecal، يمكننا استخدامه لتحدي القمامة من الفئران من العمر سبعة إلى ثمانية أيام مع جرعة معدلة الوزن من الطين cecal. فتاك الطين يعتمد على الجرعة.سيكون لديك لتحديد الجرعة القاتلة المطلوبة في مرفق الخاص بك لكل مخزون جديد مع جرعة جديدة المعايرة. يتم إعداد حقن الطين cecal واحد aliquot لكل القمامة. نحن تطبيع inoculum إلى حجم 100 ميكرولتر، التقريب إلى أقرب 10 ميكرولترات لكل في القمامة.إعداد التحدي aliquot يتطلب ثلاث حسابات، وحجم مخزون الطين المطلوبة، وحجم إضافي من المياه دكستروز، وحجم مدورة لكل جرو في القمامة. يمكن الاطلاع على تفاصيل حول كيفية تنفيذ كل عملية حسابية في القسم الثالث من البروتوكول. تنفيذ هذه الحسابات باليد لكل تجربة يمكن أن يكون مضيعة للوقت وسوف تسهم في خطأ تجريبي، وبالتالي يمكن تحميل جدول البيانات جنبا إلى جنب مع البروتوكول حيث يمكنك إدخال تركيز الأسهم الخاصة بك، والجرعة المطلوبة، ووزن القمامة الخاصة بك، وكمية من مخزون الطين، وحجم المياه dextrose، ويتم إرجاع تلقائيا الحجم الفعلي لكل جرو.يمكنك طباعة هذه الورقة وأخذها معك عندما تكون مستعدًا لتحدي حيواناتك. إعداد aliquot حقن في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية والاحتفاظ بها على الجليد. قبل تحميل الحقنة، اخلط أنبوب microcenterrifuge عن طريق الخفق 20 مرة.يتم تحدي الجراء مع حقنة الأنسولين قياس 28. قبل رسم الطين، وخلط aliquot عن طريق الملهم وإخراج 300 إلى 500 ميكرولترات من aliquot التحدي داخل وخارج أنبوب microcentrifuge. ثم، رسم ما يقرب من 150 ميكرولترات من التحدي aliquot.هذا ينبغي أن يكون أكبر من حجم الحقن لأي الجرو من العمر سبعة إلى ثمانية أيام. نفض الغبار في حقنة لطرد فقاعات من المكبس والسحب قليلا على حقنة لطرد أي فقاعات الهواء. لا تلمس الإبرة أو رمح المكبس خلال هذه العملية.الاستغناء عن الطين cecal الزائدة مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge حتى يتم تحميل كمية محسوبة من الطين cecal للماوس في الحقنة. يتم إعطاء الطين Cecal مع حقن داخل الصفاق. قم بإجراء هذا وفقا للبروتوكول في مؤسسة رعاية الحيوان الخاصة بك.لتقليل التسريبات، قم بإمالة الجرو إلى الأسفل وأدخل الإبرة بين الساق والأعضاء التناسلية، مع الحفاظ على الإبرة الضحلة وتحت الجلد. بعد إدخال الإبرة حوالي سنتيمتر واحد ، اضغط على الأسفل وإلى الأمام حتى تشعر بالإبرة تثقل الصفاق ، ثم اخفض ببطء المكبس. سحب بعناية الإبرة التالية نفس الطريق كما ذهبت في، والاسترخاء إصبعك الأوسط كما تفعل ذلك.لاحظ أي تسرب في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك والنظر في حذف الحيوانات مع تسرب كبيرة من النتيجة النهائية. في هذا القسم سوف نحدد مستويات مختلفة من الصحة التي نلاحظها في الفئران التي تحدى مع تعفن الدم متعدد الميكروبات ونقطة النهاية الإنسانية المقابلة. بالنسبة لأي إجراءات تشمل فئران حديثي الولادة، ننقل مواد الفراش إلى قفص جديد.هذا ينقل رائحة السيدة على قفازاتك ويقلل من الضغط على السيدة من الدخول المتكرر إلى قفصها. نحن جعل عش ثان في القفص الجديد لعقد الجراء رصدها حتى نهاية الإجراء أو الرصد عندما تكون القمامة كلها جاهزة للعودة إلى قفص السيدة. ضع فأرة على ظهرها وراقب القدرة على الحق في غضون أربع ثوان.إذا كان يمكن أن الحق، ثم الانتظار ثماني ثوان أخرى لتحديد مستوى التنقل. الماوس غير المطعون أو استرداد غالباً ما تكون قادرة على الحق واستكشاف بيئتها عن طريق اتخاذ خطوات متعددة في صف واحد. إعادة تجميع الفئران الذين هم قادرون على اليمين واتخاذ بضع خطوات لاستكشاف بيئتها كحقوق الخمول.قد تسقط هذه الفئران أثناء اتخاذ خطوة وتبدو مهتزة على أقدامهم. الماوس الذي هو غير قادر على الحق وحركة الورك التي تتجاوز 90 درجة من الأفقي ونحن مجموعة كما تفشل في حق المحمول. هذا الماوس في نهاية المطاف الحق ولكن لا يمكن في غضون أربع ثوان.بسبب حركات الورك، يتم تجميعها على أنها تفشل في حق المحمول. الجراء التي لم تتمكن من الحق ولها حركة الورك أقل من 90 درجة من الأفقي يتم تجميعها على أنها تفشل في الخمول الأيمن. وهذا مثال آخر على الفأرة التي لا تتجاوز أردافها 90 درجة من الأفقي ويتم تجميعها على أنها تفشل في الخمول الأيمن.وسوف تفشل في الجرو غير المحمول الحق يكون الساقين التي قد تهتز أو تهتز ولكن ليس لديها حركة الورك. قد تمتد الأطراف وتتراجع ولكن لن يكون لها حركة الطرفين الجانبي. الجرو هو مرض واضح ووصلت إلى نقطة النهاية الإنسانية.هذا مثال آخر على فشل الجرو غير المحمول الأيمن. الوركين لا يهز من اليسار إلى اليمين، ولكن الكفوف لا تهتز. عند التعامل مع قفص السيدة، يمكن سحب الجراء من العش إذا كانت سيدة التمريض يعمل.نستبدل هذه ثم نتحقق من وجود الجراء المتناثرة الأخرى التي هي بعيدة عن عشها. إذا فشلت تلك الجراء المتناثرة في الخمول الأيمن ، فهي في نقطة نهاية إنسانية. هنا منحنى بقاء كابلان ماير من نموذج الإنتان لدينا.ويمكن العثور على نقاط الرصد الزمنية في النظام اُستوبِل. في أي نقطة على طول منحنى البقاء على قيد الحياة إذا تم العثور على الماوس أن تفشل في عدم الحركة اليمنى، هو في نقطة النهاية الإنسانية والقتل الرحيم. بين 12 و 21 ساعة بعد التحدي، سوف الفئران تبدو مريضة وحوالي نصف الفئران سوف تكون قادرة على الحق على جانب واحد، في حين أن النصف الآخر تفشل الحق على أي من الجانبين.هذا هو الإطار الزمني حيث الفئران سوف تبدأ في الاستطراد في درجة الصحة والوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية من تفشل في عدم حق. هذه هي النتائج التمثيلية لعشرات الصحة لوحظ في هذا الإطار الزمني. ولا يمكن التمييز بين الناجين وغير الناجين في هذه المرحلة استناداً إلى درجاتهم الصحية.في هذه المرحلة من المرض، 21 إلى 48 ساعة بعد التحدي، نلاحظ أعلى نسبة من النقاط النهائية الإنسانية. كما لاحظنا أن الغالبية العظمى من أي فئران غير قادرة على الحق على كلا الجانبين لن ينتهي بها المطاف بالتعافي من المرض، الذي يصبح بالتالي معايير جديدة لنقطة النهاية الإنسانية بالإضافة إلى الفشل في معايير عدم الحركة. وأسفرت النتائج الصحية التي لوحظت خلال هذه المرحلة من المرض عن فصل الناجين عن غير الناجين.الغالبية العظمى من الفئران التي لم تكن قادرة على الحق على كلا الجانبين لم يتعافى من المرض. تدعم هذه البيانات أن المعايير الجديدة لنقطة النهاية الإنسانية التي تبدأ في 21 ساعة بعد التحدي يجب أن تكون القتل الرحيم لأي فئران تفشل في الحق على كلا الجانبين. على مدى 48 ساعة بعد التحدي العديد من الفئران سوف تبدأ في عرض المزيد من النشاط ومنعكس أفضل الحق.على الرغم من أن نسبة النقاط النهائية الإنسانية أقل في هذه الفترة ، يمكن للفئران الاستطراد وتصبح أكثر مرضا ، وأنها لا تزال تتطلب الرصد لنقطة نهاية إنسانية. وخلال هذا الإطار الزمني، أظهرت بعض الفئران التي تم تجميعها في نهاية المطاف على أنها غير ناجية زيادة في النشاط في مرحلة ما ولكنها فعلت ما هو أسوأ في وقت لاحق ووصلت إلى نقطة نهاية إنسانية. وهذا يتطلب استمرار رصد الحيوانات المريضة مع زيادة وتيرة إذا بدأت في إظهار نتائج صحية أسوأ.تم اختبار المجربين المستقلين الذين لم يتلقوا تدريبًا شخصيًا ويراقبون هذا الفيديو التعليمي فقط في قدرتهم على تعيين نفس النتيجة التي حصل عليها المحققون باستخدام مقاطع فيديو اختبار مسجلة. هذا الفيديو التعليمية النتائج في تصنيف سلوكي دقيق. تم تحديد القدرة على تعيين النتيجة الصحيحة للفشل في الفئران الوليدية غير المتحركة ، وهي مقياس لنقطة النهاية الإنسانية ، من أصل 60 فأرًا حديثي الولادة ، وتم تمييز 97٪ من السلوكيات بدقة ، مع عدم تحديد سوى 3٪ منها.بعد ذلك، تم اختبار القدرة على التمييز بين الفئران حديثي الولادة التي فشلت في الحق أو التي كانت قادرة على الحق في غضون أربع ثوان. هذا هو مقياس آخر من نقطة النهاية الإنسانية وتم تعيينه بدقة في 97٪ من الفئران حديثي الولادة ، في حين تم تعيين 3٪ من الجراء بشكل غير صحيح كحق. هنا هي نتائج تمثيلية لتغيير الوزن في المئة من الفئران مقارنة مع وقت التحدي.بدأ متوسط تغير الوزن بين الناجين وغير الناجين في الانفصال في 24 ساعة بعد التحدي، ولكن هناك الكثير من التداخل بين المجموعات. كان هناك بعض الناجين الذين فقدوا أكثر من 20٪ الوزن ولكن لا يزال يتعافى من المرض. ولم يكن تغير الوزن فعالاً في التنبؤ بالنتائج مقارنة بالاختلافات في الدرجات الصحية، وهذا هو السبب في أنه لا يستخدم كمعيار في تحديد ما إذا كانت الفئران في نقطة نهاية إنسانية.في الختام، يجب أن تكون الآن قادرة على إعداد مخزون من الطين cecal المجمدة، وحساب الجرعة المعدلة الوزن. وحقن ورصد الفئران حديثي الولادة لنقاط النهاية الإنسانية. نأمل أن يكون هذا موردا قيما لأبحاث الماوس.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

القولون الصاعد ستينت الصفاق (CASP) -- نموذج موحد لالإنتان البطن متعدد المكروبات

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

الأعور ربط والبزل التي يسببها تعفن الدم نموذجا لدراسة الالتهام الذاتي في الفئران

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibody Binding Specificity for Kappa VÃƒÅ½Ã‚Âº Light Chain-containing Human IgM Antibodies: Polysialic Acid PSA Attached to NCAM as a Case Study

الأجسام المضادة ملزم خصوصية لكابا (Vκ) ضوء الإنسان (الغلوبولين المناعي) الأجسام المضادة التي تحتوي على سلسلة: Polysialic حمض (PSA) المرفقة لNCAM كدراسة حالة

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

آثار تعرض فورمالدهايد لنموذج الفئران الاستشرائية الناجمة عن معاملة الأطفال حديثي الولادة كبخاخات

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

تصميم ربط الدقّة النسّية والثقب والعدوى داخل الأنف نموذج مزدوج للكبت المناعي الناجم عن الإنتان

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...