Name: a controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis at JoVE.com

Speciellt tack till Claire Harrison och Animal Care anläggningen på British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) för deras stöd i djurens arbete samt Dr Po-Yan Cheng för deras vägledning och ingång på djur övervakning och välbefinnande.

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13,+with+projections+to+inform+post-2015+priorities:+an+updated+systematic+analysis.">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis.">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists.">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li><li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CXC+ligand+10/CXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis.">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li><li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis.">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li><li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates.">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li><li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1/11+ablation.">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li><li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18.">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li><li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis.">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).</li><li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates.">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li><li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation.">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li><li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis.">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).</li><li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis.">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li><li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model.">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li><li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats.">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).</li><li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice.">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li><li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats.">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li><li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure:+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response.">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li><li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models.">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li><li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , (1998).</li><li>Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humane+endpoints+in+shock+research.">Humane endpoints in shock research.</a> SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints.">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).</li></ol>

Dr. James Wynn får stöd från National Institutes of Health (NIH) / nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper (R01GM128452) och NIH /Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen (NICHD) () R01HD089939).

Postnatal neonatala möss har mycket begränsad rörlighet och misslyckas att rätta sig efter att ha placerats på ryggen, även när oemotsagda. Av DOL 7, åldern av möss utmanas i denna modell, ett utbud av rörelse som sträcker sig från rättigheter-Mobile till FTR-Mobile observerades i ohotad möss, med en viktig skillnad, nämligen att en ohotad mus vid denna ålder ingen visade FTR-slö beteende. Endast möss utmanas med polymikrobiella sepsis har observerats för att bli FTR-slöa; Detta svar kan därför vara en markör för sjukdomens svårighetsgrad. Att uppmärksamma brytpunkten på 90° vinkel från horisontell för hip rörelse tillåter för konsekventa och korrekta tilldelning av slö eller mobila hip rörelse hos möss. Tidsramen för 4 s för att se om en mus kan rätt själv valdes eftersom ohotad möss kunde konsekvent rätt sig inom denna tidsram. Upprepad mätning av samma mus undveks, medan tiden till höger själva och mätning av höft rörlighet begränsades till 4 s, undvika alltför tröttande musen, som annars kan påverka dess förmåga att få mat och värme och kan påverka dess prognosen att bli bättre. Rätande sig från både vänster och höger sida observerades och den högre av poängen användes för att avgöra om musen var på en human slutpunkt, eftersom vissa möss visade för att Visa FTR-Nonmobile på ena sidan ännu har en högre rörlighet på andra sida och b e kunna återhämta sig så småningom.
Det poängsystem som används till att utvärdera musen hälsan åberopade tillämpningen av kategoriska cutoffs på vad är ett spektrum av rörelse och därför kunde vara benägna att enskilda bias. Personalen utbildades tillsammans att säkerställa varje person gjorde mössen samma; Det kommer dock sannolikt att förbli en nivå av subjektivitet som leder till variation. Konsekvens av scoring utvärderades genom att ha sju forskare som inte hade tidigare utfört neonatal mus övervakning Läs kraven som anges i detta protokoll och video och sedan självständigt tilldela beteenden och bestämma humana slutpunkten. En 97% noggrannhet observerades med scoring utförs på 60 utmanade möss, vilket tyder på att enskilda bias inte spelar en betydande roll i de beteendemässiga uppdrag av denna modell. Presenterade beteendemässiga övervakning protokollet är baserat på observationer av djur utmanas på DOL 7, men möss som är yngre än 6 dagar i en ohotad felfritt tillstånd kan inte konsekvent just själva. Således kunde kriterierna som beskrivs humana slutpunkten inte appliceras direkt på yngre möss. Om yngre möss som används i denna experimentella modell eller om en annorlunda utmaning modell med olika sjukdomen kinetik används, måste sedan lämplig Human slutpunkt kriterier utvecklas och lotsade Undvik dödshjälpen av möss som skulle annars, så småningom, återställa. Poängsystem som visar en robust metod att förbättra humana slutpunkten klassificering som, med provning och bekräftelse, skulle potentiellt kunna tillämpas på andra modeller.
Varje beredning av cecal slam eller användning av en ny mus stam krävs retitration av cecal flytgödsel dosen att administrera för att uppnå en liknande dödlig dos. Varje gång sedan standardiserades av uppläsningen av intresse, nämligen överlevnad, snarare än att ge samma bakterie räkningen. Varje cecal flytgödsel beredningens livskraftig bakteriell koncentration varierade något, eventuellt på grund av skillnader i givarens kommensaler bakterier eller på grund av variationer i vikt kvar i cellen silen av den cecal flytgödsel lager postfiltration. Under titrering av cecal slam, de första två kullarna var indelade i två grupper och varje halva av kullen utmanades med en av de två doserna så att var och en av doserna som skulle testas i två kullar. Om den resulterande överlevnaden inte matchade nivån som krävs, sedan utmaningen dosen var antingen ökat eller minskat med 5% - 10% och experimentet upprepas. Flera kullar har använts för att redogöra för kull-till-kullen skillnader som kunde orsaka resistens eller ökad känslighet för sepsis över en kull. Det var viktigt att korrekt titer cecal flytgödsel beståndet med varje nytt preparat att säkerställa att nya titrering av cecal flytgödsel var jämförbar med föregående cecal flytgödsel preparat. Perioder av överflödigt buller och vibrationer, särskilt under den komprimering av asfalt och byggandet av en närliggande byggnad och road, observerades för att öka stress i dammarna. Detta korrelerade med ökad förekomst av cannibalization, och påverkade dödligheten hos de överlevnad experiment, även påverkar ohotad möss, vilket indikerar att det kan finnas ovidkommande påverkan på neonatal överlevnad som också behöver styras för.
Tidigare metoder för cecal flytgödsel lager förberedelsen ingår antingen användning av färska cecal flytgödsel eller beredning av frysta cecal flytgödsel, med hjälp av olika metoder, inklusive lagring i glycerol som oundvikligen skulle överföras under utmaningen. Även användningen av färska cecal flytgödsel ger fördelen av att ha en bakteriell sammansättning som är närmast original cecal innehållet, finns risken för variansen mellan enskilda givare möss på grund av kommensaler bakterier. Medan detta var minimeras genom att använda cecal givare från samma leverantör med minimal tid mellan ankomst och progression av experimentet, detta kunde bli en kostnad-oöverkomliga alternativ för vissa laboratorier och presenterade en annan timing logistik utmaning att ha åldersmatchade möss tillgängliga när vederbörande inleder en cecal slurry experimentera i neonatala möss som var 7 dagar gamla. En alternativ metod att använda färska cecal flytgödsel utnyttjades, där flera vuxna givarnas cecal innehållet var poolade, resuspended i D5W, fryst vid-80 ° C utan glycerol, och tinade en alikvot i taget för experiment. Utnyttjandet av vuxen donator cecal flytgödsel att studera neonatal sepsis kunde potentiellt överföra arter av bakterier som finns i den cecal flytgödsel som neonatal musen inte har utsatts för, men det är en strategi som möjliggör studier av sepsis hos neonatala möss och har använts för att studera neonatal mus biologi i den tidigare13,14,15. Cecal flytgödsel var utspädd i D5W att ge näring till bakterier, vilket möjliggjorde upprättandet av en aktiv infektion när bakterierna var injiceras, och gjordes för att efterlikna tillgången på näringsämnen i peritoneal hålighet under nekrotiserande enterokolit. Glycerol ingick inte som en stabiliserande agent i frysning bakterier på grund av de potentiella negativa biverkningar som kan uppstå från glycerol injektion ensam. Om glycerol hade inkluderats i cecal flytgödsel beredning, då den potentiella skadan att glycerol ensam kunde framkalla skulle behöver testas för genom att inkludera en glycerol-bara (saknar cecal slurry) injektion i möss, vilket skulle ha ökat mus användning. Bakterier livskraft cecal flytgödsel bestånden testades efter frysning cecal flytgödsel beståndet utan glycerol och befanns vara konstant, med ingen förändring i bakterier koncentration i separata portioner av samma cecal flytgödsel preparatet lagras vid-80 ° C över en 6 månadersperiod. Detta tyder på att lagring utan glycerol är genomförbart att tillhandahålla ett konsekvent biologiska resultat. Användningen av en bulk-beredd frysta cecal flytgödsel lager tillåtet också för användning av möss föds upp internt, minska kostnaden och därför utnyttja hanmöss som annars skulle vara överflödig från avel, minska slöseri med musen.
Identifiering av misslyckade utmaningar hos möss var viktigt att undvika att lägga extra buller till systemet. Efter att ha genomgått en intraperitoneal injektion cecal slurry, observerades möss för förekomsten av en utbuktning under huden, som indikerade en misslyckad injektion som var faktiskt subkutan. Möss observerades efter läckor på injektionsstället, både omedelbart efter nålen borttagning och ger dem möjlighet att ta ett steg efter injektionen, eftersom möss skulle ibland (sällan) läcka bara efter att ha flyttat delgrunden injektionsstället genom att ta ett steg. Förekomsten av en utbuktning eller läcka efter injektionen resulterade i att ta bort musen från analysen. Efter alla, kan endera av dessa leda till en annan utgång på grund av de felaktiga cecal flytgödsel injiceras som en 5% skillnad i utmaning dos har observerats påverka efterföljande överlevnad.
Cecal flytgödsel utmaning experimenterar ofta krävs varierande mål dödliga doser med varierande vikt justerade doser. På grund av detta, kan injektionsvolymer variera från så lite som 20 µL och upp till 100 µL. Den proportionella experimentella fel i samband med döda nål volym ändras också tillsammans med injektionsvolymen, ökar svårigheten för att direkt jämföra olika doser. Med enkel ändring av standardisera injektionsvolymen, tas denna källa av variansen bort från experimentet.
Musens neonatal beteendemässiga övervakningssystem, som används i detta protokoll är först i sitt slag. Forskare avsikt att bedriva etisk forskning med nyfödda möss ställs ofta inför utmanande bristen på resurser att bedöma djurens välbefinnande vid denna ålder. Presenterade intuitivt och konsekvent övervakningssystemet börjar att åtgärda bristen på denna kunskap. Allt detta bevis-driven strategi inte bara ökar kvaliteten på den experimentella data som erhållits men, samtidigt, också minskar lidandet för försöksdjuren.

Sepsis är en ledande orsak till nyfödda smittsamma dödsfall1. Eftersom nyfödda sepsis är dåligt känd, har få framsteg gjorts i båda identifiering av at-risk nyfödda tidigt under sjukdomen och utveckling av effektiva behandlingar eller profylax. Detta kräver användning av djurmodeller av sepsis att bättre förstå de process och testa eventuella interventionerna. Dessutom reagerar vuxna gnagare olika på sepsis, med statistiskt signifikanta skillnader i antalet bakterier att administrera för att erhålla samma dödlig dos (LD) och skillnader i den resulterande värd Svaren jämfört med nyfödda2. Neonatal sepsis har således, att studeras hos nyfödda. Flera vuxna sepsis modeller har använts i sepsis forskning. Dessa inkluderar en intravenös utmaning med specifika organismer inblandad i vuxen människa sepsis eller cecal ligering och punktering (CLP). CLP är en endogen utmaning modell där blindtarmen är kirurgiskt isolerade, sammanskrivna och punkteras så att läckage av tarminnehållet i bukhinnan, så småningom leder till systemisk spridning av mikroorganismer och deras produkter3. Men är det kirurgiska ingreppet som krävs för att fastställa CLP dödliga för nyfödda djur; Därför behövs en alternativ metod att efterlikna polymikrobiella utmaningen att CLP att inducera neonatal sepsis. Cecal flytgödsel modellen för neonatal polymikrobiella sepsis utvecklades för att tillgodose det behovet, whereby cecal innehållet i djur skördas, upphängd i sterila glukos 5% i vatten (D5W) och injiceras intraperitonealt i nyfödda möss2. Detta har sedan, blivit en alltmer populär modell att studera sepsis i både nyfödda och vuxna djur och har väsentligen avancerade mekanistiska insikter i sjukdomens process4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Med tanke på den ökande användningen av denna modell och önskan av forskare att direkt jämföra resultaten över publikationer, finns det ett behov för de tekniska aspekterna vara väl beskrivna och standardiserat i studier. Standardisering gäller tre aspekter av modellen, nämligen i) utarbetandet av cecal flytgödsel beståndet, ii) utarbetandet av de utmaning alikvoter för injektion i försöksdjuren, och iii) definitionen av humana slutpunkten whereby djur anses nonsurvivors i utmaning experiment. Specifikt, refereras metoder för att förbereda cecal flytgödsel beståndet ofta till den ursprungliga artikeln att införa den modell2. En kort sammanfattning av denna modell är att cecal innehållet från vuxna möss var skördas, upphängd i sterila D5W till en koncentration på 80 mg/mL, och används inom 2 h för att injicera försöksdjuren. Denna ursprungliga modell används möss i samma ålder, från samma leverantör plats, som var inrymt i deras respektive forskningsanläggningar för mindre än 2 veckor före skörd cecal innehållet. Användningen av interna Förädlat möss, ökat trots att minska kostnaden från vanliga leverantör leverans och möjliggör användning av överskott möss av ett bredare spektrum av kön och ålder, också väsentligt givare-till-givare variabilitet. Detta motiverade utvecklingen av en alternativ teknik, whereby cecal innehållet från flera möss var poolade tillsammans för att förbereda ett stort lager, som då var aliquoted och lagras vid-80 ° C13. Denna alternativa metod har anpassats av flera grupper14,15. Att anpassningen resulterade dock i vissa tekniska variationer, både i de lagringsmedia som används (10% eller 15% glycerol eller D5W ensam) och i strategin för filtrering ta bort partiklar (flerstegs filtrering genom en 860 µm och, sedan, en 190 µm filter eller individ filtreringar genom 100 µm eller 70 µm filter)13,14,15. Injektion av glycerol ensam kan potentiellt skada, med tanke på att 25-50% glycerol injektioner har använts som en gnagare modell av njurskada16,17,18,19, 20. För att undvika oavsiktliga biverkningar av glycerol, cecal flytgödsel lager förberedelserna för möss i denna studie är frysta i D5W utan glycerol, och tester av bakteriell livskraft från lagring vid-80 ° C utförs. Den filtrering strategi som används i denna studie är en passera genom en 70 µm filter, som inte direkt har jämförts med de andra strategier för filtrering som anges.
Dödliga vikt justerade doser injiceras cecal slurry kan variera från anläggning till anläggning och bör titrerade ut till önskad dödlighet för enskilda grupper. Med olika utmaning doser ändra de medföljande utmaning volymerna av nödvändighet. Detta metodologiska uppgifter har dock inte rapporterats före. Dessutom strategier för standardiserade förfaranden, såsom intraperitoneal injektion, är sällan utarbetas på inom litteraturen, men enskilda tekniker kan påverka huruvida nyfödda möss läcka när injiceras och påverka deras slutliga resultat.
Djurskydd, inklusive en definition av Human slutpunkt, är en central aspekt av denna modell och i någon modell av infektion och inflammation i gnagare21. 1998 offentliggjort kanadensiska rådet på Animal Care (CCAC) omfattande riktlinjer för Human slutpunkt urval, definiera humana slutpunkten som ”alla faktiska eller potentiella smärta, ångest eller obehag ska minimeras eller lindras genom att välja de tidigaste slutpunkten som är kompatibel med vetenskapliga målen för forskningen ”22. Andra också försiktighet att humana slutpunkter måste fastställas baserat på vetenskaplig motivering snarare än på en subjektiv tolkning av djurets tillstånd enbart21. Medan det finns en mängd resurser för klinisk, beteendemässiga, och kroppskondition tecken-baserade kriterier för humana slutpunkten, även i samband med infektion och inflammation specifikt21,23,24, ingen av dessa , inklusive CCAC riktlinjerna för humana slutpunkten22, nämna nyfödda möss. Således, objektivt och vetenskapligt motiverade humana slutpunkter är mycket svårare att fastställa för nyfödda djur, både möjligheterna begränsade beteende och bristen på bevis från kriterier som viktminskning, som vanligtvis används för vuxen möss. För närvarande kriterierna för humana slutpunkten används för 5-12 dag-gamla neonatala möss i cecal flytgödsel litteraturen allt referera tillbaka till den original-manuskript som introducerade den modell2. I detta ursprungliga papper baserades definitionen av Human slutpunkt för nyfödda djur på två kriterier. nämligen, platsen för en mus utanför boet (spridning) och bristen på mjölk ställen hade setts att leda till döden inom timmar. En komplicerande fråga i tilldela en human slutpunkt är att mjölk fläckar blir svåra att se i mus stammar med mörk päls, såsom vanligen anställd C57BL/6J stam, efter den första veckan i livet, medan sjuka djur övervakas tills den 14: e dagen i livet (DOL). Ytterligare, döda djur kan hittas postchallenge vid tillämpningen av dessa kriterier (egen observation, opublicerade); Således krävs en strängare definition av humana slutpunkten att lindra lidande försöksdjur och undvika dödlighet i situationer där resultatet kunde noggrant urskiljas tidigare.
Alla tre metodologiska aspekter av cecal flytgödsel modellen presenteras i ett normalförfarande detailing utarbetandet av cecal flytgödsel lager, en metod för att injicera försöksdjur som håller den injektion volym konstanten mellan doserna och minskar risken för läckor, och en definition av humana slutpunkten för 7 - 12 dag-gamla möss baserat på ett system av beteendemässiga modellering. Beteendemässiga information av mus hälsa noter från över 240 experimentella djur samlades in och grupperade efter sista överlevnad utfall, visar en bevis-driven definition av humana slutpunkten. Lidande av försöksdjur minskas genom att identifiera döende neonatala möss den tidigaste möjliga tidpunkt, medan biologiskt signifikanta överlevnad utfall kan härledas genom att observera nyckelvariabler. En visuell representation av både cecal flytgödsel förberedelse och neonatal mus beteenden kommer att fungera som en utmärkt resurs till någon grupp studera sepsis eller nyfödda utmaning modell djur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:609px;" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">0.1 - 20 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0799</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">1.8 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3621</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">100 - 1000 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0801</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:222px;">1 - 200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">732-0800</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:123px;">TB15-25</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:222px;">23G1 needles</td>
			<td style="width:95px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">305145</td>
			<td style="width:171px;">only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">28G 0.5 mL Insulin syringe</td>
			<td style="width:95px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">329461</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">2 mL Cryogenic vial</td>
			<td style="width:95px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430488</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:95px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-432-22</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">5 mL pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">6 - 10 week old C57BL/6J adult mice</td>
			<td style="width:95px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">664</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">7 + day old C57BL/6J neonatal mice</td>
			<td style="width:95px;">Bred in house</td>
			<td style="width:123px;">n.a</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td style="width:95px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">352350</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Defibrinated Sheep&#39;s Blood</td>
			<td style="width:95px;">Dalynn</td>
			<td style="width:123px;">HS30-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dextrose 5% Water (D5W)</td>
			<td style="width:95px;">Baxter</td>
			<td style="width:123px;">JB0080</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">&#160;82027-386</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Dissecting Scissors, Sharp Tip</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">&#160;82027-592</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">82027-594</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol)</td>
			<td style="width:95px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">HC11001GL</td>
			<td style="width:171px;">diluted to 70% with double distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Ethanol-proof marker; Lab marker</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">EZ Anesthesia Vaporizer</td>
			<td style="width:95px;">EZ Anesthesia</td>
			<td style="width:123px;">EZ-155</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:222px;">Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer)</td>
			<td style="width:95px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:123px;">GER 5287-120V</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:95px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:123px;">CP0406V2</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Micro Spatula</td>
			<td style="width:95px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1983-12</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Pipette-Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td style="width:123px;">4-000-100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-1000</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008653</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-20</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008650</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Rainin Classic Pipette PR-200</td>
			<td style="width:95px;">Rainin</td>
			<td style="width:123px;">17008652</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Scale</td>
			<td style="width:95px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">BL 150 S</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Specimen forceps</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">82027-440 / 82027-442</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Square 1000 mL Storage Bottle</td>
			<td style="width:95px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">431433</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Styrofoam board</td>
			<td style="width:95px;">Any</td>
			<td style="width:123px;">n.a</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber</td>
			<td style="width:95px;">Euthanex</td>
			<td style="width:123px;">EZ-178</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:222px;">Tryptic Soy Agar</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">22091-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:222px;">VX-200 Lab Vortex Mixer</td>
			<td style="width:95px;">Labnet International</td>
			<td style="width:123px;">S0200</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">weigh paper</td>
			<td style="width:95px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">09-898-12B</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis

Neonatal sepsis är fortfarande en global börda. En preklinisk modell till skärmen effektiva förebyggande eller terapeutiska insatser behövs. Neonatal mus polymikrobiella sepsis kan induceras av injicera cecal flytgödsel intraperitonealt i dag av livet 7 möss och övervaka dem för följande vecka. Här presenteras de detaljerade steg som är nödvändiga för genomförandet av denna neonatal sepsis modell. Detta inkluderar att göra en homogen cecal flytgödsel lager, späda ut den till en vikt - och skräp-justerade dos, en disposition av övervakningsschema, och en definition av observerade hälsa kategorier används för att definiera humana slutpunkter. Generering av en homogen cecal flytgödsel lager från poolade givare tillåter förvaltning till många kullar över tid, att minska variationen mellan givare och förhindrar användning av potentiellt toxiska glycerol. Övervakningsstrategin används möjliggör föregripande av överlevnad utfall och identifiering av möss som senare skulle utvecklas till döds, vilket möjliggör en tidigare identifiering av humana slutpunkten. Två huvudsakliga beteendemässiga egenskaper används för att definiera hälsa poängen, nämligen de neonatala möss förmåga att just själva när den placeras på ryggen och deras nivå av rörlighet. Dessa kriterier skulle potentiellt kunna tillämpas på adress humana slutpunkter i andra studier av neonatal sjukdom hos möss, så länge som en pilot studie utförs för att bekräfta riktigheten. Sammanfattningsvis ger denna metod en standardiserad metod modell nyfödda sepsis hos möss, samtidigt som resurser för att bedöma djurens välbefinnande används för att definiera tidig humana slutpunkter för utmanade djur.

Cecal flytgödsel livskraft lagras vid-80 ° C kan testas med tiden genom seriellt späda och plätering alikvoter av cecal flytgödsel lager på 5% fårmjölk blod tryptic soy agar följt av 24 h aerob inkubation vid 37 ° C. Efterföljande rösträkningen odlingsbara kolonibildande enhet (CFU) innehåll cecal flytgödsel preparats hittades inte för att ändra under en 6 månaders period och lönsamhet påverkades inte av långvarig lagring vid-80 ° C (figur 2). Varje givare mus medförde, i genomsnitt tillräckligt cecal flytgödsel att utmana tre till fyra kullar (inga data anges).
Möss som utmanade vid DOL 7 med cecal flytgödsel inducera polymikrobiella sepsis började nå humana slutpunkten inom 12 h av utmaningen och polymikrobiella sepsis löstes mestadels genom 48 h postchallenge, som observerades i en Kaplan-Meier överlevnad kurva kombineras från data från över 200 utmanade möss (figur 1A). Dödlighet var beroende på utmaning dos, med en 5% förändring av utmaning dos vilket resulterar i en ungefär 15% skillnad i överlevnad (figur 1B). Musen kroppsvikt mättes vid varje uppföljning besök. Viktminskning observerades i alla utmanade djur, att vara icke-diskriminerande mellan möss som hamnade överlever och de som inte under första 24 h postchallenge (figur 1 c). Efter 24 h började mest överlevande djuren återfå sin vikt, medan alla nonsurvivors fortsatte att gå ner i vikt och flyttade till sin humana slutpunkten. Dock en liten andel överlevande djur som hade behållit sin rätande reflex fortsatte också att gå ner i vikt eller misslyckats att vinna vikt, fram till slutet av experimentet, även förlora så mycket som 20% av sin initiala kroppsvikt inom 40 h av utmaningen. Det var en överlappning av viktminskning mellan möss som hamnade överlever och de som gjorde det inte, förändringen i vikt eller ett tröskelvärde på viktminskning kan inte användas som ett kriterium för humana slutpunkten samtidigt bibehålla målet med korrekt dividera överlevande från nonsurvivors.
Beteendet hos möss var övervakas som beskrivs i protokollet och i tabell 2. Ögonblicksbilder av hälsa kategorier visas (figur 3A-C). Dessa bilder visar de olika hälsa kategorierna av möss som misslyckades att rätt sig efter att ha placerats på ryggen och beskriva skillnaden mellan FTR-Mobile och FTR-slö, vilket är en viktig distinktion. Ohotad friska möss i denna ålder visar inte FTR-slö aktivitet; Därför är denna hälsa kategori en markör av sjukdom och ett svar att utmana. Sjuka möss visas FTR-slö symtom (figur 3B) och kan regrediera mot FTR-Nonmobile (figur 3 c), där det övre benet fortfarande parallellt med det nedre benet, med liten eller noll hip vaggande rörelse, som är ett av kriterierna för humana slutpunkten. Möss kan också återställa, vinner ökad hip rörelse och bli FTR-Mobile (figur 3A). Den rätande reflex och rörlighet noter bestämdes för både vänster och höger sida av varje mus och högsta poäng utnyttjades för att avgöra om musen hade nått en human slutpunkt. Beteendemässiga information samlades in från över 240 djur utmanas med en dödlig dos 60 (LD60) cecal flytgödsel, och 144 humana slutpunkter observerades (figur 3D-F och tabell 1). Detta bevis-driven strategi användes för att definiera och förfina den humana slutpunkten investeringsfaser fyra sjukdom, kategoriseras genom de praktiker utgångspunkt i både beteendemässiga skillnader mellan överlevande och nonsurvivors och fraktionen av humana slutpunkter nått under varje tidsperiod. Under tidiga experiment visade FTR-Nonmobile möss som hade ingen hip rörelse genomgående döda inom 4-6 h i detta beteende observeras. I samlingen av det presenterade informationen användes en FTR-Nonmobile hälsa poäng som kriterium för en human slutpunkt. Från 12-21 h postchallenge, medan FTR-Nonmobile möss var euthanized, både överlevande och nonsurviving djur visas mycket liknande beteendemönster och kunde inte urskiljas på något annat sätt (figur 3D). Från 21-48 h postchallenge, flesta överlevande möss återfick sin rätande reflex, medan färre än 1% av FTR beteenden observerade var i djur som skulle gå på att överleva experimentet (figur 3E). Möss som misslyckats med att just själva från båda sidor blev således, ytterligare ett kriterium för humana slutpunkten under denna tid. Mellan 12 och 20 h postchallenge observerades 12,5% av det totala antalet humana slutpunkter, kontra 80,5 procent mellan 20 och 48 timmar och 7 procent efter 48 h (tabell 1). Ett utmärkande drag mellan möss som hamnade överlevande och som så småningom förvärrades till en human slutpunkt var förlusten av den rätande reflexen, oberoende av hip rörlighet (figur 3F). Ja, mellan 20 och 48 h efter utmaningen, sammanlagt 121 möss hade inte rätt sig från båda sidor, med 116 i dessa möss så småningom utvecklas till en human slutpunkt (som representerar en 96% noggrannhet identifiera möss som inte skulle få tillbaka). Bortom 48 h efter utmaningen observerades 11 möss misslyckas till höger sig från båda sidor, och 10 av dessa kommit till en human slutpunkt (en 91% noggrannhet). Utöver 20 h efter utmaningen förutspår antalet möss som förlorat den rätande reflexen för båda sidor slutresultatet med en noggrannhet på mer än 90%. Detta har därför lagts till humana slutpunkten kriterierna, att identifiera nonrecovering möss tidigare och minska mus lidande (tabell 1).
Frekvensen att möss behöver övervakning ändras över tid, på grund av olika priser för döden postchallenge, och beskrivs i tabell 1. En mus ansågs vara i dess humana slutpunkten när som helst om det inte hade till höger sig själv och visas nonmobile hip rörelse på båda sidor, eller om musen hittades utspridda i boet, gick inte till höger sig själv, och hade slö hip rörelse. Möss med något av dessa villkor inte förväntades kunna återförenas med kullen och har observerats för att vara FTR-Nonmobile inom 4-6 h. start 20 h efter utmaningen, lades en ny Human slutpunkt eftersom den presenterade informationen visar att den stora majoriteten av möss som FTR från båda sidor hamnar duka under till sjukdom.
De videor, tabeller och resurser som presenteras i detta manuskript är en effektiv undervisning resurs för rätt beteende tilldelningen av utmanade möss. Sju praktiker ombads att titta på utbildningsvideo och läsa både protokollet och tabellerna innan du tilldelar beteenden till 60 utmanade djur. Identifiering av humana slutpunkten uppdrag var korrekt både för särskiljande FTR-Nonmobile möss från möss som visas de andra beteenden (figur 4A) och FTR möss från möss som kunde rätt sig inom den tillåtna tidsram ( Figur 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Figur 1 : Kaplan-Meier överlevnad kurva, cecal flytgödsel dostitrering och förändring i kroppsvikt efter utmaningen cecal flytgödsel. (A) överlevnad resultatet av neonatal C57BL/6J möss utmanas med en intraperitoneal cecal flytgödsel injektion vid DOL 7. Data för denna siffra kombinerades från oberoende experiment med flera utmaning doser, från 0,7 till 1,3 mg cecal slurry per gram kroppsvikt administrerades till dessa möss. (B) neonatala möss utmanas med 0,80 till 0,95 mg cecal flytgödsel per gram kroppsvikt från ett cecal flytgödsel preparat visar en dosberoende relation mellan mängden cecal flytgödsel tanke och andelen överlevnad. ()C) procentuella förändringen i vikt jämfört med utmaning vikt, med den streckade linjen som betecknar en 20% förlust av vikt från tiden av utmaningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Figur 2 : CFU koncentration i cecal flytgödsel lager lagras vid-80 ° C inte ändras över en 6 månadersperiod. Effekten av cecal flytgödsel ålder på CFU koncentration testades med linjär regression. Varje punkt representerar en alikvot av samma cecal flytgödsel preparatet, seriellt spädas och klädd under en 6 månaders period. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Figur 3 : Höft rörlighet kategorier av möss som misslyckas med att just själva och djurs beteenden vid olika tillfällen postchallenge. Möss som har ifrågasatts och sepsis, när den placeras på ryggen, kommer att visa tecken på sjuklighet som kan mätas av graden av hip rörelse. (A) A misslyckas till höger (FTR)-mobil mus visar hip vaggande rörelsen av deras övre benet överstiger 90 ° vinkel från horisontalplanet. (B) en FTR-slö mus visar HipHop gungande rörelse men inte överstiger 90 ° vinkel från horisontellt vid någon punkt under 4 s av övervakning. (C) vissa FTR-Nonmobile möss kommer att förlänga deras ben, böja på knäet, men visar mycket liten (mindre än 10 ° vinklar) till noll hip gungande rörelse, och benen kvar parallellt med varandra. (D) djurens beteenden 12-21 h postchallenge visar att endast FTR-Nonmobile beteenden separata överlevande från nonsurvivors. (E) från 21 till 48 h postchallenge, endast 4 av 592 observerade FTR beteenden (0,67%) tillhör överlevande, tillåter den rätande reflex att förutsäga slutresultatet och användas som ett nytt kriterium för humana slutpunkten. (F), utöver 48 h angripen, 6 av 131 möss (4,55%) som hade en rätande reflex kom att bli en del av gruppen FTR och offrades i slutet av experimentet, motiverar fortsatt övervakning under återhämtning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Figur 4 : Instruktions resurser resultera i korrekt beteendemässiga klassificering av oberoende praktiker. Praktiker som tränas av vaktande video åtföljer detta protokoll kategoriseras videor av 60 neonatala möss i olika hälso grupper. (A), förmågan att skilja en human slutpunkt bestämdes och 97% av beteenden i genomsnitt var korrekt Kategoriserad som FTR-Nonmobile eller inte, medan endast 1% av FTR-Nonmobile möss var felidentifierad. Två procent av mössen var felaktigt identifieras som FTR-Nonmobile. (B) identifiering av den andra humana slutpunkten criterium korrekt skilja mellan FTR möss eller dem som har förmågan att rätt sig inom 4 s placeras på ryggen har angetts korrekt i 97% av menyövergångar, medan endast 0,96% av mössen var felaktigt tilldelade som rätande själva och 2% av möss var felaktigt tilldelade som FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sjukdom Stadium</td>
			<td>A: hög sjuklighet, ingen mortalitet</td>
			<td>B: hög sjuklighet, låg mortalitet</td>
			<td>C: hög sjuklighet, hög dödlighet</td>
			<td>D: låg morbiditet, låg dödlighet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Timmar efter utmaning</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>> 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Övervakning frekvens</td>
			<td>2 h post utmaning</td>
			<td>varje 4−6 h</td>
			<td>Varje 4−6 h, 8 h, obevakad under natten</td>
			<td>1−2 gånger dagligen, mer om det behövs</td>
		</tr>
<tr>
<td>Andel av totala humana slutpunkter som observerats</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Procentandel av humana slutpunkter observerade</td>
			<td>0%</td>
			<td>12,5%</td>
			<td>80,5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Humana slutpunkten kriterier</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile på båda sidor</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile på båda sidor</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. spridda från boet och är FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">2. spridda från boet och är FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR på både vänster och höger sida (med någon rörlighet Poäng)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: frekvens av övervakning och humana slutpunkten kriterier i de olika stadierna av sjukdom. Övervakning frekvens, humana slutpunkter observerats, procentandelen av humana slutpunkter och humana slutpunkten kriterier under olika skeden av sjukdomen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rätande Reflex</td>
			<td>Rörlighet</td>
			<td>Tidsfristen till höger efter att ha placerats på rygg</td>
			<td>Tidsgräns för att mäta mängden rörelse (mobil / slö / nonmobile)</td>
			<td>Rörlighet poängkriterier</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Rättigheter</td>
			<td>Mobile</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Ytterligare 8 s</td>
			<td>Musen tar flera steg i rad, att upprätthålla drivkraft, och utforskar sin omgivning. Valpen kommer inte att falla.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slö</td>
			<td>Musen kan ta ett steg men stoppar och pausar innan du tar en annan. PUP kan falla.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>Musen vidtar inte några åtgärder efter rätande själv. PUP kan falla.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Misslyckas till höger</td>
			<td>Mobila höfter</td>
			<td rowspan="3">Den samma 4 s används för att mäta rätande reflex</td>
			<td>Har energisk hip rörelse med det övre benet roterande utöver 90° från horisontell minst en gång inom 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slö höfter</td>
			<td>Hip rörelse upp till men inte längre än 90° från horisontalplanet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile höfter</td>
			<td>Lemmar kan flytta genom att utvidga och infällbara men höfterna roterar inte. Valpen ser mycket sjuklig.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: övervakning av tabell och kriterier för att fastställa den hälsa poängen av möss. De medföljande kriterierna användes för att definiera hälsa kategorigrupper till möss, och att minska individuella varians i tilldela hälsa noter.

Watch this Scientific Journal Video about A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis at JoVE.com

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Detta protokoll innehåller nödvändiga steg för att upprätta och utvärdera neonatal sepsis i 7 dagar gamla möss.

En kontrollerad musmodell för Neonatal polymikrobiella Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Cecal slurry modellen för polymikrobiell sepsis är ett kraftfullt verktyg för att dissekera ut unika neonatal patofysiologi. Det kan vara varierande, och humana ändpunkter är inte väl beskrivna. Här presenterar vi vårt mycket standardiserade förfarande för att förbereda en cecal slurry och injicera i försöksdjur.Dessutom använder vi en datadriven metod för att identifiera döende ungar vid en så tidig tidpunkt som möjligt. Låt oss börja med att förbereda en frusen cecal slurry lager. Detta görs genom att slå samman cecal concent från minst fem vuxna möss, upphängning i sterilt dextrosvatten och lagring vid minus 80 för senare användning.Du kan använda hanar eller honor, men kön, ålder och bakgrund av möss för dina experiment bör hållas konstant. Först, låt oss förbereda våra verktyg för dissektion. Dessa inkluderar en uppsättning saxar och tuten för huden och en andra uppsättning för de inre organen.Sätt på den heta pärlautoklaven minst 30 minuter före användning. Doppa verktygen i 70%etanol och sedan doppa dem i den varma pärla sterilisator i minst en minut. Spraya en matta av pappershanddukar med 70%etanol, ta sedan bort verktygen från sterilisatorn utan att vidröra den steriliserade delen av verktyget till de icke-sterila handtagen av andra verktyg.Placera dem på pappershandduken för att svalna. Dissekera mössen i ett biologiskt säkerhetsskåp. Pin benen på musen till en styrofoam styrelse med hjälp av 23 gauge nålar så musen är buken upp.Spraya buken med 70%etanol. Använda sterila tärningar och saxar, skär genom huden, lossa huden från peritoneal foder med saxen, och skär upp en rektangulär region från ljumsken till bröstbenet och vänster sida till höger sida. Ta bort eventuell päls runt peritoneum.Byt till ett nytt par sterila verktyg för att skära igenom peritoneum, också göra en rektangulär öppning. Identifiera cecum, som bör köra vänster sida till höger sida över kroppen. Störa bindväv för att identifiera cecum grenarna från tarmarna och skär cecum bort från tarmarna.Placera den på ett steriliserat blad av väga papper. Använda sterila verktyg, skär genom båda ändarna av cecum. Håll mitten av cecum med tänjningar och använd en platt metallspatel för att försiktigt trycka cecalinnehållet ur ändarna med hjälp av en rullande rörelse.Samla in innehållet och placera dem i en förvägd 15 milliliter centrifugrör. Poolcecal innehåll från högst fem möss i samma rör. Vikt röret igen när allt innehåll har lagts till.För att beräkna volymen av dextros vatten för att lägga till cecal innehållet i varje rör, dela vikten av cecal innehållet i röret genom din önskade koncentration i milligram per milliliter. Håll en alikvot av dextrosvatten på is för återupphängning av cecalinnehåll. Tillsätt den erforderliga mängden dextrosvatten till centrifugeringsröret på 15 milliliter som innehåller cekalinnehåll.Vortexa röret vertikalt och horisontellt i ungefär 30 sekunder. Observera för närvaron av partiklar över några millimeter i diameter, och om det finns, fortsätt vortexa tills alla partiklar har synbart försvunnit. Placera ett centrifugeringsrör på 50 milliliter på is för att samla filtratet och installera en steril 70 mikrometercellsil över toppen.Pipett fyra milliliter återupphängd slurry från ett 15 milliliter rör över cellsilen och in i uppsamlingsröret. Åter avbryta partikelformen genom pipettering upp och ner två till tre gånger. Försiktigt extrudera bubblor för att öka filtreringshastigheten under omrörning av innehållet med pipettspetsen tills det inte finns någon mer vätska som filtreras.Detta bör ta ungefär 30 sekunder. Byt cellsil mellan varje rör av cecalslam, men poola allt innehåll i samma 50 milliliter uppsamlingsrör. Om ditt lager överstiger 40 milliliter, sedan virvel det i 15 sekunder, och placera 20 milliliter i ett nytt centrifugrör.Dela uppslamning i kryogena injektionsflaska på 500 mikroliter alikvoter vardera. Vortexa slam mellan var tredje injektionsflaska. Håll masterstocken i injektionsflaska på is.Genom att lagra alikvoter vid minus 80 ändras inte den aeroba kolonin som bildar enhetskoncentration i en cekal slurry-beredning under en sexmånadersperiod. Nu när cekalslammen är förberedd kan vi använda den för att utmana en kull på sju till åtta dagar gamla möss med en viktjusterad dos av cekalslam. Gödselgödselns dödlighet är dosberoende.Du kommer att behöva bestämma önskad dödlig dos i din anläggning för varje nytt bestånd med en ny dos titrering. En cecal slurry injektion alikvot är beredd per kull. Vi normaliserar inokulat till en 100 mikrolitervolym, avrundning till närmaste 10 mikroliter för varje djur i kullen.Förbereda utmaningen alikvot kräver tre beräkningar, volymen av slam lager krävs, ytterligare volym av dextros vatten, och den rundade volymen för varje valp i kullen. Detaljer om hur varje beräkning ska utföras finns i avsnitt tre i protokollet. Utföra de här beräkningen vid hand för var experiment kanna bli tid förbrukande och vilja bidra till experimentell misstag, sålunda en spreadsheet kanna bli dataöverföring längs med det protokoll var du matar in din lager koncentration, önskat dos, och vikten av din skräp, och beloppen av slurry stock, volym av dextros vatten, och faktisk volym per pup är automatisk returnerat.Du kan skriva ut det här arket och ta med dig det när du är redo att utmana dina djur. Förbered injektionen alikvot i ett biologiskt säkerhetsskåp och håll den på is. Innan du laddar sprutan, blanda mikrocentrifugröret genom att snärta 20 gånger.Pups är utmanat med en 28 mätare insulin spruta. Innan du utarbetar slurry, blanda alikvoten genom att inspirera och mata ut 300 till 500 mikroliter av utmaningen alikvoten in och ut ur mikrocentrifugröret. Sedan, utarbeta ungefär 150 mikroliter av utmaningen aliquot.Den här skulle bli storer än injektionen volym för någon sjua till åtta dag gammal pup. Snärta mot sprutan för att rubba bubblor från kolven och dra tillbaka något på sprutan för att driva ut eventuella luftbubblor. Rör inte nålen eller kolvaxeln under denna process.Dispensera tillbaka överskottet av cekalslammning i mikrocentrifugröret tills den beräknade mängden cecalslammning för musen laddas i sprutan. Cecals uppslamning administreras med en intraperitoneal injektion. Utför detta enligt protokollet på din djurvårdsinstitution.För att minimera läckor, luta valpen att vända nedåt och stick in nålen mellan benet och könsorganen, hålla nålen grund och subkutan. Efter att ha satt in nålen ungefär en centimeter, tryck nedåt och framåt tills du känner nålen punktera peritoneum, sedan långsamt trycka ner kolven. Dra försiktigt tillbaka nålen efter samma väg som du gick in, koppla av långfingret när du gör det.Notera eventuella läckor i din lab anteckningsbok och överväga att utelämna djur med betydande läckor från ditt slutliga resultat. I detta avsnitt kommer vi att beskriva de olika nivåer av hälsa som vi observerar hos möss utmanas med polymikrobiell sepsis och deras motsvarande humana endpoint. För alla procedurer som involverar neonatalmöss överför vi sängklädernas material till en ny bur.Detta överför damens lukt på dina handskar och minskar stressen på damen från upprepat inträde i hennes bur. Vi gör ett andra bo i den nya buren för att hålla de övervakade ungarna till slutet av proceduren eller övervakningen när hela kullen är redo att återföras till dame's bur. Placera en mus på ryggen och övervaka för möjligheten att rätt inom fyra sekunder.Om det kan rätt, sedan vänta åtta sekunder för att bestämma graden av rörlighet. En obestridd eller återhämta mus är oftast kunna rätt och utforska sin miljö genom att ta flera steg i rad. Omgruppera möss som kan rätta sig och ta några steg för att utforska sin miljö som rättighetsslöande.Dessa möss kan falla över medan du tar ett steg och ser skakig på fötterna. En mus som inte kan höger och har höftrörelse som överstiger 90 grader från horisontella vi grupp som misslyckas med att höger-mobil. Den här musen kommer så småningom rätt men kan inte inom fyra sekunder.På grund av dess höft förehavanden grupperas det som underkänt till rätt-mobilt. Pups så där var inte kunna rätt och har höft rörelse nedan 90 graden från horisontal de/vi/du/ni är grupperat så misslyckas till rätt- slö. Detta är ett annat exempel på en mus vars höfter inte överstiger 90 grader från horisontella och är grupperade som misslyckas med att höger-slö.En misslyckas med att rätt-nonmobile pup kommer att ha ben som kan skaka eller vibrera men har ingen höftrörelse. Lemmar kan förlänga och dra tillbaka men kommer inte att ha laterala rörelse. Valpen är synbart sjuk och har nått den humana slutpunkten.Den här är en annan exempel av en stranda till rätt- nonmobile pup. Höfterna skakar inte från vänster till höger, men tassarna vibrerar. När du hanterar dame's bur, kan valpar dras ut ur boet om ammande dame körs.Vi ersätter dessa och sedan kontrollera andra spridda valpar som är borta från sina nestmates. Om de skingrat pups de/vi/du/ni är misslyckas till rätt- slö, de er på en human slutpunkt. Här är en Kaplan-Meier överlevnadskurva av vår sepsismodell.Övervakningstidpunkterna finns i bifogade SOP. Vid varje punkt längs överlevnadskurvan om en mus befinns misslyckas med att rätt-nonmobile, det är på sin humana ändpunkt och avlivas. Mellan 12 och 21 timmar efter utmaningen kommer möss att verka sjuka och ungefär hälften av mössen kommer att kunna höger på ena sidan, medan den andra hälften misslyckas med att höger på någon av sina sidor.Detta är den tidsram där mössen kommer att börja avvika i hälsa poäng och nå den humana slutpunkten för att misslyckas med att rätt-nonmobile. Dessa är representativa resultat av hälsopoäng som observerats i denna tidsram. De efterlevande och icke-överlevande grupperna kan inte differentieras på denna punkt baserat på deras hälsopoäng.I detta stadium av sjukdom, 21 till 48 timmar post-challenge, observerar vi den högsta andelen humana ändpunkter. Vi har också observerat att den stora majoriteten av alla möss som inte klarar av att rätta till på båda sidor inte kommer att återhämta sig från sjukdom, vilket därför blir ett nytt kriterier för human endpoint utöver underlåta att rätt-nonmobile kriterier. Den observerade hälsopoäng under detta stadium av sjukdomen resulterade i en separation av överlevande från icke-överlevande.De allra flesta möss som inte kunde höger på båda sidor återhämtade sig inte från sjukdom. Dessa data stöder att ett nytt kriterier för human endpoint börjar på 21 timmar efter utmaningen bör vara att avliva alla möss som misslyckas med att rätt på båda sidor. Över 48 timmar efter utmaningen många möss kommer att börja visa mer aktivitet och en bättre righting reflex.Även om andelen humana effektmått är lägre under denna period, kan mössen fortfarande avvika och bli sjukare, och de kräver fortfarande övervakning för human endpoint. Under denna tidsram, några av de möss som så småningom grupperades som icke-överlevande hade visat ökad aktivitet vid ett tillfälle men senare gjorde värre och nådde en human slutpunkt. Detta kräver fortsatt övervakning av sjuka djur med ökad frekvens om de börjar visa sämre hälsoresultat.Oberoende experimentörer som inte har fått personlig utbildning och som bara observerar denna instruktionsvideo testades i deras förmåga att tilldela samma poäng som utredarna med hjälp av inspelade testvideor. Denna instruktionsvideo resulterar i korrekt beteendeklassificering. Möjligheten att tilldela rätt poäng för att misslyckas till höger-nonmobile neonatal möss, vilket är ett mått på humana slutpunkt, fastställdes av 60 neonatal möss, och i genomsnitt 97% av beteenden var exakt särskiljas, med endast 3% är felidentifierade.Därefter testades förmågan att skilja neonatalmöss som inte hade rätt eller som kunde rätt inom fyra sekunder. Detta är ett annat mått på human endpoint och tilldelades korrekt i 97% av neonatal möss, medan 3% av valparna felaktigt tilldelades som rättning. Här är representativa resultat för procent viktförändring av möss jämfört med deras tid av utmaning.Den genomsnittliga viktförändringen mellan överlevande och icke-överlevande började separera vid 24 timmar efter utmaningen, men det finns en hel del överlappning mellan grupperna. Det fanns några överlevande som förlorat över 20% vikt men ändå återhämtat sig från sjukdom. Viktförändring var inte lika effektivt för att förutsäga resultatet jämfört med skillnaderna i hälsoresultat varför det inte används som ett villkor för att avgöra om möss är på en human endpoint.Som avslutning bör du nu kunna förbereda ett lager av fryst cekalslam, beräkna den viktjusterade dosen. Och injicera och övervaka nyfödda möss för humana ändpunkter. Vi hoppas att detta kommer att bli en värdefull resurs för din mus forskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon ascendens Stent peritonit (Casp) - en standardiserad modell för polymikrobiella buken Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal Ligation och Punktering-inducerad Sepsis som en modell för att studera Autophagy i möss

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

En musmodell för patogen-inducerad Kronisk inflammation vid lokala och system webbplatser

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Icke-invasiv Modell av Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibody Binding Specificity for Kappa VÃƒÅ½Ã‚Âº Light Chain-containing Human IgM Antibodies: Polysialic Acid PSA Attached to NCAM as a Case Study

Antikroppsbindande specificitet för Kappa (Vk) Lätt kedja som innehåller mänskliga (IgM) Antikroppar: polysialinsyra (PSA) Bifogat till NCAM som en fallstudie

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazon behandlade musmodell av kliniskt relevanta<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Stam R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Effekterna av exponering av formaldehyd för en råtta modell av atopisk dermatit orsakas av Neonatal Capsaicin behandling

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Design av cecal ligation och punktering och intranasal infektion Dual Model av sepsis-inducerad immunsuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

En neonatal bildmodell av gramnegativ bakteriell sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...