Een van de voorgestelde mechanismen waarmee therapeutische anti-Tau-antilichamen pathologie bij de ziekte van Alzheimer verminderen, is opname in klaring van pathologische geaggregeerde voormalige Tau door microglia. Hier presenteren we de cel basis test om Tau opname te beoordelen door microglia. Deze test is een nuttig onderzoeksinstrument om het werkingsmechanisme van anti-Tau-antilichamen beter te karakteriseren.
Bereid op de eerste dag van het experiment de BV-2 cellen voor door ze eerst te wassen met 1x PBS in de kolf waarin ze zijn gekweekt. Vervolgens broeden ze met 05% trypsin EDTA op 37 graden Celsius en 5%C02 totdat ze loskomen van de kolf. Schort de cellen in cultuurmedium opnieuw op door drie tot vijf keer op en neer te pipetten.
Tel cellen en bereid een celsuspensie voor met een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter in kweekmedium met 200 microgram per milliliter heparine. Voeg 250 microliters van deze cel suspensie per put in een 96 goed weefsel cultuur platte bodemplaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius met 5%C02, 's nachts.
Na het ontdooien van eerder bereide pH-dye-Tau aggregaten op ijs, verdun ze in 65 microliter per aandoening van serumvrij medium, om een 500 nanomolar oplossing te maken. Verdun antilichamen in 65 microliter serumvrij medium om de gewenste concentratie te verdubbelen. Meng pH dye-Tau aggregaten en antilichamen in een 96 goed U-bodem plaat.
Verzegel deze verdunningsplaat en broed 's nachts uit op 37 graden Celsius. Op de volgende dag verwijder het medium van de 96 put plaat met BV-2 cellen. Was de cellen in elke put met 100 microliter kamertemperatuur 1x PBS.
Verwijder PBS van de BV-2 celplaat. Gebruik een multi-channel pipet om 125 microliter aminocomplexen van de verdunningsplaat over te brengen naar elke put van een 96 goed BV-2 celplaat, en ontcubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Na de incubatie verwijder de aminocomplexen uit de cellen en was de cellen in elke put met 100 microliters kamertemperatuur 1x PBS.
Voeg na het verwijderen van de 1x PBS 50 microliter van 25% trypsine EDTA toe en broed gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% CO2. Voeg daarna 200 microliter kweekmedium toe en hang de put opnieuw op door op en neer te pipetten om de cellen los te maken. Breng de cellen naar een 96 goed U-bodem plaat en centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten op 4 graden Celsius.
Leg de plaat op ijs en verwijder het medium. Voeg 150 microliters ijskoud 1x PBS toe en centrifuge opnieuw op 400 g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Leg de plaat op ijs en was opnieuw door eerder toegevoegde 1x PBS te verwijderen en 150 microliters ijskoude PBS per put toe te voegen.
Centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Leg de plaat op ijs en was de cellen door het verwijderen van de eerder toegevoegde PBS en het toevoegen van 150 microliters FACS buffer per put. Centrifuge opnieuw op 400 g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.
Plaats de plaat op ijs en verwijder de eerder toegevoegde FACS buffer en schort de cellen opnieuw op in 200 microliters FACS buffer per put. Onmiddellijk overgaan tot analyse door FACS tot 20.000 gebeurtenissen in de live cel poort te verwerven. Voor FACS-analyse gebruikt u het voorwaartse verspreidingsgebied of FSCA versus side scatter area of SSCA density plot to gate on live cells by excluding events with lower forward scatter levels, such as debris and dead cells.
Gebruik vervolgens binnen de live celpopulatie FSCA versus forward scatter height of FSCH om een singlet gate te maken en cel doubletten en aggregaten uit te sluiten. Gebruik vervolgens de gebeurtenissen in de singlet-poort om een pH-kleurstof te genereren met één parameter histogram. Gebruik het gegenereerde histogram om eerst de gemiddelde fluorescentieintensiteit te bepalen.
Daarna bepalen percentage van pH kleurstof-Tau positieve cellen door het uitsluiten van negatieve cellen zoals bepaald MET BV-2's enige controle. CBTau-28.1 antilichamen bevorderen een opname van Tau in BV-2 cellen op een dosisafhankelijke manier, zoals blijkt uit flow cytometrie. De hoge affiniteit dubbele mutant CBTau-28.1 antilichaam bemiddelde Tau opname in de BV-2 cellen in een hogere mate dan het wilde type antilichaam.
CBTau-28.1 Fab fragmenten niet verhogen basale Tau opname met vermelding van een FC receptor bemiddelde internalisatie mechanisme. Confocale microscopie bevestigde antilichaam bemiddelde toename van Tau opname. Groene pH-kleurstof gelabeld Tau aggregaten vaak co-gelokaliseerd met lysotracker rode kleurstof gekleurd zure organellen dus suggereren aanwezigheid van Tau aggregaten in een endolysosomale compartiment.
CBTau-28.1 Fab fragmenten niet verhogen Tau opname weer aangeeft dat de opname inderdaad FC bemiddeld. De test die we net beschreven stelt ons in staat om specifiek consequent kwantificeren antilichaam bemiddelde Tau opname door microglia. Gegevens gegenereerd met deze test kan helpen bij het ophelderen van het werkingsmechanisme van anti-Tau antilichamen dus vertegenwoordigen een nuttig instrument om anti-Tau antilichamen vooraf naar verdere stap in hun ontwikkeling als potentiële AD behandeling.