Name: cell-based assay to study antibody-mediated tau clearance by microglia
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia at JoVE.com

ברצוננו להודות אלברטו Carpinteiro סוארש לסיוע טכני יקר שלו.

1. BV-2 תאים תרבות
הערה: ידית BV-2 תאים תחת בלימה אבטחה ברמה 2. שורת התאים BV-2 מייצרת של רטרווירוס (מסוגלים להדביק תאים מאתר בלבד) מעטפת ecotropic רקומביננטי12; כגון וירוסים ידועים שלהם במבחנה צורה של יכולת ופוטנציאל ויוו tumorigenic.
<ol><li>התרבות התאים BV-2 בגלוקוז גבוהות Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין (המכונה בינוני culturing מעתה ואילך) על-ידי זריעת תאי-4 x 104 תאים למ"ל.</li>
	<li>לשמור על תרבויות באווירה humidified של 5% CO2 ב 37 º C. הערה: התאים גדלים באופן רופף המצורפת, ההשעיה.</li>
</ol>2. תווית אגרגטים טאו רקומביננטי עם pH רגיש הפלורסנט
הערה: טאו אגרגטים הוכנו כפי שמתואר Apetri. et al. 13 עם הבדל כי אין Thioflavin T (ThT) נוספה למאגר התגובה. צבור דגימות נאספו 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. קרינה פלואורסצנטית הסופי אות שנבדקה על ידי ערבוב µL 118 המדגם בריכה עם µL 12 של פתרון ThT 50 מיקרומטר. אגרגטים היו מופרדים על ידי צריך שתוציאו את תערובת התגובה צבירת ב x 20,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. תגובת שיקוע נותחה על ידי שניה-MALS כדי לוודא כי כל טאו monomeric הוסב אגרגטים. כדורי (טאו אגרגטים) היו הצמד קפוא ומאוחסנים במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס.
<ol><li>Resuspend טאו אגרגטים במאגר סודיום ביקרבונט (NaHCO3) של 0.1 M ב- pH 8.5 על ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (~ 20 מיקרומטר). הערה: ריכוז של טאו אגרגטים מבוסס על ריכוז מונומרים הראשונית כפי לאומדן את הספיגה של מונומרים טאו-280 ננומטר באמצעות מקדם של הכחדה של 0.31 mLmg-1ס מ-1.</li>
	<li>Sonicate מצרפי resuspended באמצעות sonicator של המכשיר תוך שמירה על קרח כדי למנוע חימום יתר.<ol>
<li>השתמש של משרעת של 65% (עם sonicator של כוח 250 ואט).</li>
		<li>לבצע 8 פולסים של 3 s עם הפסקות של 15 s בין פולסים כדי למנוע התחממות יתר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון מניות מ מ 8.9 של pH הרגישים לצבע (מעתה התייחסות כמו צבע pH) דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) בעקבות ההוראה של היצרן. הערה: תמיד להכין פתרון טריים ולהשתמש בו רק ביום שזה מוכן.</li>
	<li>להוסיף 10 שומות של צבע לכל השומה של חלבון ריכוז לצבוע הסופי של 0.2 מ מ.</li>
	<li>מערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>דגירה התערובת תגובה 45 – 60 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.</li>
	<li>בינתיים, להרכיב ג'ל לתוספי צולבים desalting עמודה ההוראות של היצרן.</li>
	<li>Equilibrate את העמודה עם 25 מ של 0.1 M NaHCO3 מאגר pH 8.5 המכיל 3% דימתיל סולפוקסיד. למחוק את הזרימה.</li>
	<li>הוסף את המוצר של הנוסעים טאו תיוג תגובה העמודה הנפח הכולל של 2.5 מ. אם המדגם הוא פחות מ 2.5 מ ל, להוסיף מאגר עד הנפח הכולל של 2.5 מ ל מושגת.</li>
	<li>תן את הדגימה להזין את הג'ל ארוז לגמרי, למחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>Elute עם 3.5 מ של 0.1 M NaHCO3 מאגר pH 8.5 המכיל 3% דימתיל סולפוקסיד ולאסוף את eluate בחלקים שוות ערך 4 צינורות 2 מ"ל.</li>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון של שברים 4 על ידי assay (BCA) חומצה bicinchoninic.</li>
	<li>אחסן את החלבון שכותרתו במקפיא-20 ° C.</li>
</ol>3. ספיגת Assay עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) Read-out
<ol><li>
יום 1 – הזרע התאים
	<ol>
<li>שטיפת BV-2 תאים הבקבוק על-ידי הסרת culturing בינוני והוספת 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). הערה: נטילת אמצעי האחסון משתנים בהתאם לגודל של הבקבוק התא המשמש. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, לשטוף עם 10 מ"ל של PBS 1 x.</li>
		<li>להסיר הבקבוקון PBS ולנתק תאים על-ידי המקננת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) 0.05%-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד התאים לנתק מן הבקבוק (כ- 5 דקות). הערה: נפח של טריפסין-EDTA 0.05% תלוי בגודל של הבקבוק תא בשימוש. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, השתמש 2 מ של טריפסין-EDTA 0.05%.</li>
		<li>Resuspend בתאים culturing בינוני על-ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. הערה: נפח culturing בינוני משתנה בהתבסס על גודל הבקבוק תא בשימוש ולכן המספר הכולל של התאים הבקבוקון. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, השתמש 8 מ ל culturing בינוני.</li>
		<li>לספור תאים וליצור השעיה תא עם ריכוז סופי של עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל במדיום תרבות המכיל 200 הפארין μg/mL.</li>
		<li>צלחת µL 250 תאים השעיה (2.5 x 104 תאים) לכל טוב בצלחת בתחתית שטוח תרביות רקמה 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה צלחת בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום 1 – הכנת Immunocomplexes
	<ol>
<li>הפשרת pH לצבוע-טאו על קרח.</li>
		<li>להכין μl 65 לכל תנאי של 500 ננומטר פתרון של pH לצבוע-טאו אגרגטים במדיום נטול סרום (SFM) (גלוקוז גבוהה DMEM בתוספת 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 200 µg/mL של הפארין).</li>
		<li>להכין נוגדן דילולים ב 65 µl SFM, ריכוז כפול אחד הסופי. מערבבים pH לצבוע-טאו אגרגטים נוגדנים בצלחת 96-ובכן u-התחתון. נפח סופי לכל תנאי הוא עכשיו 130 µl והוא הריכוז אגרגטים של צבע-טאו pH 250 ננומטר. לאטום את הצלחת דילול, דגירה במשך הלילה ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום 2 – ספיגת Immunocomplexes
	<ol>
<li>הסר בינוני culturing BV-2 תאים. רחץ תאים פעם אחת עם 100 µL בטמפרטורת החדר 1 x PBS.</li>
		<li>העברת µL 125 של immunocomplexes על התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה התאים עם immunocomplexes עבור 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>הסר המדיום דגירה של התאים ולמחוק את זה. רחץ תאים פעם אחת עם 100 µL בטמפרטורת החדר 1 x PBS.</li>
		<li>להסיר 1 x PBS ולטפל תאים עם 50 µL טריפסין-EDTA 0.25% במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2-
</li>
		<li>להוסיף 200 µL culturing בינוני, resuspend היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. להעביר תאים 96-ובכן U-תחתון צלחת. הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לשים את הצלחת על קרח, להסיר culturing בינוני ותאי תשטוף פעמיים על-ידי resuspending כדורי תא ב- 150 µL קרח קר 1 x PBS. הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לשים תאים על קרח, להסיר 1 נוסף-PBS ולשטוף אותם על-ידי resuspending תאים כדורי במאגר 150 µL קר FACS (1 x PBS, 0.5% שור אלבומין (BSA), 2 מ מ EDTA). הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לשים תאים על קרח, להסיר את מאגר FACS הוסיף, resuspend תאים במאגר 200 µL קר FACS.</li>
		<li>לנתח דגימות מיד על ידי FACS רכישת 2 x 104 אירועים בשער תאים חיים (ראה שלב 4.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. FACS ניתוח
הערה: עיין באיור 1 אסטרטגיה חסימה.
<ol><li>תוך שימוש בשטח פיזור קדמי (FSC-A) לעומת הצד פיזור אזור צפיפות (האס-A) העלילה, שער על תאים חיים על ידי למעט אירועים עם פיזור קדימה רמות נמוכות יותר (קרי, פסולת, תאים מתים).</li>
	<li>בתוך האוכלוסייה תא חי, השתמש FSC-A לעומת פיזור קדימה גובה (FSC-H) כדי לא לכלול תא doublets, אגרגטים. . זה השער גופיה...</li>
	<li>באמצעות האירועים בשער גופיה, ליצור היסטוגרמה פרמטר יחיד לצבוע pH.</li>
	<li>לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע. לקבוע אחוז pH לצבוע-טאו תאים חיוביים על ידי למעט תאים שלילי נקבע באמצעות השליטה היחידה BV-2.</li>
</ol>5. Immunocomplexes ספיגה עם מיקרוסקופ Read-out
<ol><li>
יום 1 – הזרע התאים
	<ol>
<li>להכין BV-2 תאים כפי שמתואר שלבים 3.1.1, 3.1.2 ו- 3.1.3.</li>
		<li>לספור תאים, resuspend אותם ב culturing בינוניים עד ריכוז סופי של תאים4 10/mL....</li>
		<li>צלחת µL 150 תא השעיה (1.5 x 103) לכל טוב בפולי-D-ליזין מצופה צלחת 96-ובכן שחור עם תחתית שטוחה ברור.</li>
		<li>דגירה צלחת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 48 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום 3 – להכין Immunocomplexes הערה: sonication מתון של טאו שכותרתה אגרגטים לפני הדגירה עם נוגדן, בוצעה לשיפור תוצאות מיקרוסקופיה.<ol>
<li>הפשרת pH לצבוע-טאו על קרח, sonicate באמצעות sonicator של המכשיר תוך שמירה על קרח. השתמש של משרעת של 15% (sonicator כוח של 250 ואט). לבצע-30 פולסים של 2 s ו- s חכה 20 בין פולסים.</li>
		<li>להכין μl 65 לכל תנאי של 500 ננומטר פתרון של אגרגטים לצבוע-טאו pH SFM.</li>
		<li>לדלל נוגדני µl 65 של SFM כדי ריכוז כפול אחד הסופי. מערבבים pH לצבוע-טאו אגרגטים נוגדנים בצלחת 96-ובכן u-התחתון. נפח סופי לכל תנאי הוא עכשיו 130 µl והוא הריכוז אגרגטים של צבע-טאו pH 250 ננומטר. לאטום את הצלחת דילול, דגירה במשך הלילה ב 37 º C.</li>
		<li>הסר בינוני תא צלחת והחלף 150 µL culturing בינוני בתוספת 200 הפארין µg/mL. דגירה צלחת בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום 4 – ספיגת Immunocomplexes
	<ol>
<li>הסר בינוני culturing התאים BV-2. העברת µL 125 של immunocomplexes על התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצי.</li>
		<li>דגירה התאים עם immunocomplexes עבור 1 h ו- 45 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2. כתם תא גרעינים עם צבע מסוים DNA ו organelles חומצי עם מכשיר בדיקה אשר באופן סלקטיבי את כתמי תאים סלולריים pH נמוך. דגירה התאים 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2. הערה: לדלל את צבעי ב- SFM.</li>
		<li>לבצע באמצעות הדמיה לחיות תאים תכולה גבוהה קונאפוקלית מערכת הסינון. להגדיר טמפרטורה CO 37 ° C ו-5%2. לתמונות באיכות גבוהה, להשתמש מטרה טבילה 63 X מים ולרכוש מטוסים מיקרומטר 0.5 (20 לכל Z-מחסנית) לכל שדה תמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+soluble+A&#946;+oligomers+as+a+drug+target+in+Alzheimer's+disease.">The case for soluble A&#946; oligomers as a drug target in Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).</li><li>Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+aggregates+as+immunotherapeutic+targets.">Tau aggregates as immunotherapeutic targets.</a> Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).</li><li>Martin, L., Latypova, X., Terro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+tau+protein:+Implications+for+Alzheimer's+disease.">Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease.</a> Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+The+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Giacobini, E., Gold, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease+therapy--moving+from+amyloid-beta+to+tau.">Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).</li><li>Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+targeting+pathological+tau+conformers+in+a+tangle+mouse+model+reduces+brain+pathology+with+associated+functional+improvements.">Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements.</a> Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).</li><li>Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+immunization+targeting+pathological+phospho-tau+protein+in+a+mouse+model+reduces+functional+decline+and+clears+tau+aggregates+from+the+brain.">Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain.</a> Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).</li><li>Chai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+immunization+with+anti-Tau+antibodies+in+two+transgenic+models:+reduction+of+Tau+pathology+and+delay+of+disease+progression.">Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).</li><li>Yanamandra, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tau+antibodies+that+block+tau+aggregate+seeding+in+vitro+markedly+decrease+pathology+and+improve+cognition+in+vivo.">Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).</li><li>Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+internalization+and+degradation+of+pathological+tau+is+enhanced+by+an+anti-tau+monoclonal+antibody.">Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody.</a> Scientific Reports. 5, 11161 (2015).</li><li>Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Therapeutic+Mechanisms+of+Tau+Antibodies:+Promoting+Microglial+Clearance+Versus+Blocking+Neuronal+Uptake.">Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf/v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Schneider, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-based+treatment+strategies+in+neurodegenerative+diseases.">Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases.</a> Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).</li><li>Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+uptake+into+neurons+occurs+primarily+via+clathrin-dependent+Fcgamma+receptor+endocytosis+and+is+a+prerequisite+for+acute+tau+protein+clearance.">Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).</li><li>Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Koenigsknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Phagocytosis+of+Fibrillar+&#x3B2;-Amyloid+through+a+&#x3B2;1+Integrin-Dependent+Mechanism.">Microglial Phagocytosis of Fibrillar &#x3B2;-Amyloid through a &#x3B2;1 Integrin-Dependent Mechanism.</a> Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).</li><li>Kopec, K. K., Carroll, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Peptide+1-42+Induces+a+Phagocytic+Response+in+Murine+Microglia.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+immune+system+restrains+Alzheimer's+disease+pathogenesis+by+modulating+microglial+function.">The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרוגלייה, תאי מערכת החיסון של המוח תושב, זוהו לאחרונה כמו שחקנים חשוב בתיווך נוגדנים גישות טיפוליות עבור10,tauopathies11. טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה, יחד עם חסימת ספיגת עצביים9, עיכוב או הקשורה fibril היווצרות13,14 ואישור של הסיבים intraneuronal ויה lysosomal מסלול15, אולי כל מה לתרום היעילות נוגדן אנטי-טאו נצפתה במודל עכבר של tauopathy5,6,7,8,9.
אנו המתואר כאן וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.
זה וזמינותו, מ פאנק. et al. 11, משתמשת BV-2 תאים, אשר הם תאים מונצחים מאתר microglial. בעוד הם לחלוטין שלא להתפלא לתאים microglial העיקרי, הם כוללים רבים של מאפייני מיקרוגלייה הראשי, כולל את היכולת של robustly phagocytose Aβ וגם טאו הסיבים11,16,17 ,18,19. יתר על כן, הם הראו על התנהגות לשחזור במבחנה שהפך אותם המתאים מאוד לצרכי assay ופיתוח מחקרים כמותיים, אשר דורשים השתנות ניסיוני מינימלי. לצד זה, שורות תאים מונצחים מאפשרות תפוקה גבוהה יותר assay, לבטל את הצורך להקריב חיה לעומת השימוש מיקרוגלייה העיקרי.
מצרפי טאו שהשתמשנו ב- assay זו התקבלו באמצעות מאוד לשחזור במבחנה צבירת ההליך כי אנו המתואר לאחרונהבת 13, ואת הצג המורפולוגיה דומה כדי לזווג חוטים לוליינית (PHFs) מבודד מן המוח של AD מטופלים. אמנם לא נתבונן כל תוצאה לא צפויה אולי נגרמו על-ידי דבקות אגרגטים טאו משטחי פלסטיק או זכוכית, השימוש של טאו טוב מאופיין ויציבה אגרגטים שיחק תפקיד מכריע הפארמצבטית של זה וזמינותו.
היבט נוסף שלא תרמה בצורה משמעותית assay הפארמצבטית הייתה צפיפות התאים. המספרים של תאים לכל באר תיאר בפרוטוקול מייצגים את צפיפות תא אופטימלית בתנאים המתוארים.
באופן שונה ממה הפאנק et al. 11 תיאר, אנחנו כאנטי אגרגטים טאו עם צבע רגיש pH אשר מגביר באופן משמעותי את זריחה על הפנמה של organelles חומצי, ובכך מאפשר על כימות תאיים. זה, יחד עם טריפסין העיכול של השטח מאוגדים immunocomplexes ו/או טאו, ערבויות שאותות פלורסצנטיות נמדדת cytometry זרימה הוא התוצאה של טאו ספיגת ולא מחייב השטח הסלולר. יתר על כן, השימוש מקל על צבען רגיש pH גילוי של טאו למביטה אגרגטים בניסויים מיקרוסקופ ללא צורך לעכל משטח מאוגד אגרגטים immunocomplexes/טאו אשר היה אז דורש תא ציפוי מחדש ושחזור.
אנחנו גם הלאה ממוטב את read-out מיקרוסקופיה של שלנו assay, לעומת מה שהיה בעבר תיאר11, באמצעות צבע סלקטיבי מאוד עבור organelles חומצי בניסויים שלנו-מיקרוסקופיה אשר אפשרה לנו לא רק כדי לאשר נוגדן בתיווך ספיגת טאו, אך גם לוקליזציה של טאו אגרגטים בתוך התא endolysosomal.
וזמינותו שפיתחנו, יש ירידה לפרטים אופטימלי אשר התוצאות בחלון ניסיוני טוב המאפשר הפרדה חזק בין דגימות חיוביות ושליליות. מעניין, וזמינותו בעקיפין מזהה הבדלים זיקה נוגדן ובכך מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד נוגדן אנטי-טאו אפקטור פונקציות.

מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת המאופיינת על ידי השינוי הסתגלותי, הרכבה עצמית של חלבון עמילואיד β פפטיד, טאו לתוך אגרגטים פתולוגי. פפטיד נורמלי β עמילואיד מסיסים מומר β עמילואיד oligomeric ו- fibrillar, בעוד טאו phosphorylated בצורה חריגה מצטברת oligomers ואת הישבן neurofibrillary1,2. אלה אגרגטים חלבון לגרום מוות עצביים המוביל לאובדן זיכרון לאחר מכן ירידה קוגניטיבית מתקדמת. גורמים אחרים, כולל neuroinflammation לא פרודוקטיביים ויכולת מופחתת כדי לנקות חלבונים misfolded, עשוי להחריף ולהאיץ את המחלה. כיום, אסטרטגיות התערבות נגד לספירה לספק הקלה סימפטומטי במידה רבה, אבל אין מחלות שינוי תרופה או מניעה.
הוכחה גוברת מרמזת על תפקיד מפתח של hyperphosphorylated טאו אגרגטים הפתולוגיה של המודעה. במצב שאינם פתולוגיים, טאו הוא מקורי פרש חלבון נקשר microtubules ומקדם את ההרכבה שלהם לתוך שלד התא עצביים. כאשר טאו הופך hyperphosphorylated, הוא מתנתק מן שלד התא, אשכולות לתוך אגרגטים טאו הנוירון, שלפי הסברה כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה3. המצטברים טאו מתחיל לצבור קודם intracellularly, אבל התקדמות המחלה, ההנחה היא להשתחרר מן הנוירונים המושפעת לחלל חוץ-תאית, שממנו זה שאפשר לקחת על ידי נוירונים בריא סמוכות או synaptically מחוברים ב " פריון, כמו אופן". ברגע הפנימו, טאו שסך כל גורם נוסף טאו צבירה באמצעות שינוי בתבניות הסתגלותי4.
על פי השערה זו, טיפולים מסוגל להפריע טאו זריעה עלול להאט או להפוך את הקורס של מחלות ניווניות בתיווך טאו. לתמיכה, להראות עכברים רגישים tauopathy מתוצרת מוטציה גנטית והזריקו פסיבי נוגדנים אנטי-טאו טאו מופחתת פתולוגיה ו פונקציה קוגניטיבית משופרת5,6,7,8 ,9. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה. עדיין נשארים חמקמקים.
אחד המנגנונים המוצע הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח. פרסומים אחרונים מראים כי מיקרוגלייה יכול ביעילות להפנים לבזות את טאו פתולוגיים מינים, יכולת זו מועצמת על ידי נוגדנים אנטי-טאו ויה תלויי-Fc מנגנון מעורבים קולטנים Fc באה לידי ביטוי על פני השטח של מיקרוגלייה, קולטן בתיווך מצרי phagocytosis10,11. נתונים אלה לזהות מיקרוגלייה effectors פוטנציאל חשוב של נוגדנים טיפולית.
נתאר בזאת וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה. נתונים שנוצרו עם assay הזה יכול לעזור שחקרתי את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו ובכך מייצג כלי שימושי כדי להתקדם נוגדנים אנטי-טאו נוספת שלבי התפתחותם כטיפול לספירה פוטנציאליים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BV-2 cells</td>
			<td style="width:212px;">ICLC Interlab Cell Line Collection</td>
			<td style="width:344px;">ATL03001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5 g/dl glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasYFlask</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156499 / 159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pHrodo Green STP ester</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P35369&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD10 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 96-Well Assay Plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA 0.5M, pH8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Canto II</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Helmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay to study antibody-mediated tau clearance by microglia

מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת שבה מצטברים טאו ולצבור חלבונים עמילואיד במוח גורם בתפקוד עצביים, מה שמוביל בסופו של דבר ירידה קוגניטיבית. Hyperphosphorylated טאו אגרגטים הנוירון הם האמין כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה. אגרגטים אלה הניחו להשתחרר לתוך תא חוץ-תאית, נלקח על ידי נוירונים סמוכים בריא איפה הם זירוז נוסף צבירת טאו. זה מתפשט "פריון כמו" יכול שתיקטע על-ידי נוגדנים מסוגל מחייב "נטרול" טאו חוץ-תאית אגרגטים כמוצג במודלים פרה העכבר של המודעה. אחד מנגנוני המוצעת שבו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה. כאן, אנו מתארים כמותיים מבוססת תא הנועד להעריך טאו ספיגת מאת מיקרוגלייה. זה וזמינותו ישתמש בשורת תא microglial העכבר BV-2, מאפשר ירידה לפרטים גבוה, נמוך השתנות של תפוקה בינונית. נתונים שנוצרו עם assay זה יכול לתרום אפיון טוב יותר של פונקציות אפקטור נוגדן אנטי-טאו.

טאו רקומביננטי צבורים היה covalently בלוחיות צבע ירוק pH-רגיש. צבע זה מגדיל באופן דרמטי את זריחה על הפנמה שלה ב organelles חומצי, ובכך לאפשר על כימות תאיים. טאו שכותרתו אגרגטים היו מודגרות עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-טאו. בפרט, השתמשנו גרסה chimeric (אזור IgG1 Fc העכבר) של CBTAU-28.1. נוגדן האנושי הזה נקשר לאזור הוספה N-מסוף של טאו, והוא מסוגל לקשור במבחנה שנוצר טאו הסיבים13. ב הזה assay, בדקנו גם גירסה זיקה-משופרת של CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1. Fab שברי CBTAU-28.1, ב החשבונאי הורים ואהדה גבוהה עיצוב ולאחר עכבר IgG1 שימשו השליטה isotype שולט.
BV-2 תאים היו מודגרות עם immunocomplexes הקבועים מראש או מצטברים לבד במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן תלויית טאו טאו. לאחר דגירה, התאים היו trypsinized כדי להסיר את טאו מאוגדים קרום חוץ-תאית, נותחו עבור ספיגת טאו מאת cytometry זרימה. כפי שהסברנו לאחרונה13, הבחנו כי ספיגת גרסאות קידום CBTAU-28.1 של טאו BV-2 תאים באופן תלוי מינון. תפיסה היה Fc מתווכת מאז CBTAU-28.1 Fab קטעים לא להגביר ספיגת טאו הבזליים (איור 2). יתר על כן, הנוגדן dmCBTAU-28.1 זיקה גבוהה מתווכת טאו ספיגת לתאים BV-2 במידה גבוהה יותר מאשר פראי-סוג נוגדן (איור 2).
טאו בתיווך נוגדנים ספיגת ולוקליזציה של טאו אגרגטים בתא endolysosomal אושר ע י מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 3) איפה תא הסלולר חומצי היתה מוכתמת באמצעות בדיקה סלקטיבית עבור pH נמוך organelles. Puncta תאיים של צבע ירוק pH כאנטי אגרגטים נצפו בתוך התאים היו מודגרות עם CBTAU-28.1 טאו. יתר על כן, אגרגטים טאו תאיים colocalized לעיתים קרובות עם pH נמוך תא סלקטיבי צבע אדום שהציעה נוכחות של אגרגטים טאו organelles חומצי. CBTAU-28.1 Fab קטעים לא גדלה ספיגת טאו שוב המציין מנגנון הפנמה Fc-קולטן בתיווך מצרי (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg"> איור 1: Gating אסטרטגיה להשתמש בניתוח cytometry זרימה כדי לזהות טאו הפנמה מאת BV-2 תאים. דגום נתונים השליטה היחידה BV-2 (A-C), שליטה isotype (D-F), dmCBTAU-28.1 (G-אני) מוצגים. אוכלוסיית תאים BV-2 היה פיקוח על מגרש האס-A צפיפות לעומת FSC-A, למעט פסולת ותאים מתים (A, D, G). BV-2 תאים היו אז עוד יותר פיקוח על מגרש צפיפות FSC-A vs FSC-H כדי לא לכלול תא doublets, אגרגטים (B, E, H). שער תא בודד שימש כדי ליצור היסטוגרמה פרמטר יחיד צבען (FITC בתוצאות אלה נציג) pH (C, F, אני) קובעים את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגיאומטרי. לחלופין, אחוז תאים חיוביים של צבען-טאו pH מחושב למעט תאי שלילי כפי שנקבע על-ידי שימוש השליטה היחידה BV-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg"> איור 2: CBTAU-28.1 שמתווכת ספיגת של טאו אגרגטים לתאים microglial BV-2- טאו רקומביננטי צבורים covalently בלוחיות לצבוע pH תלויית קרינה פלואורסצנטית ירוק, מודגרות עם העכבר גירסה chimeric של הנוגדן אנטי-טאו האנושי CBTAU-28.1, שלו זיקה עיצוב משופר, dmCBTAU-28.1, קטעים Fab המתאימים, עכבר IgG1 isotype שליטה נוגדן או אין נוגדנים (אגרגטים טאו לבד). Immunocomplexes היו לאחר מכן מודגרות עם BV-2 תאים במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן תלויית טאו. קליטת immunocomplexes הוערכה על ידי cytometry זרימה, המבוטא הממוצע הגאומטרי (GM) של עוצמת קרינה פלואורסצנטית (A) או אחוז חיובי טאו (טאו +) תאים (B). קווי שגיאה ב- (א) מציינות סטיית התקן של שני ניסויים עצמאית, תוך כדי (ב) מראה ניסוי יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg"> איור 3: טאו הם הפנימו מאת BV-2 תאים אגרגטים לשפה ב הסלולר organelles חומצי. טאו preformed-נוגדן immunocomplexes היו מודגרות עם BV-2 תאים במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן עצמאית. לאחר דגירה, גרעינים היו מוכתמים DNA ספציפיים הצבע הכחול, תא הסלולר חומצי עם pH נמוך תא סלקטיבי אדום צבע. הדמיה לחיות תאים חשף puncta תאיים של אגרגטים שכותרתו טאו (ירוק) בתוך התאים היו מתפשט CBTAU-28.1 ו- dmCBTAU-28.1, אבל לא עם הפקד isotype. יתר על כן, אגרגטים טאו תאיים colocalized לעיתים קרובות עם האדום לצבוע (צהוב) ובכך רומז נוכחות של טאו אגרגטים בתא הסלולר חומצי. CBTAU-28.1 Fab קטעים לא גדלה ספיגת טאו המציינת את מנגנון הפנמה Fc-קולטן בתיווך מצרי. תמונות מייצגות תחזיות העוצמה המקסימלית מטוסים 20 Z-מחסנית (0.5 מיקרומטר מטוסים) רכשה עם יעד טבילה 63 X מים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia at JoVE.com

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

כאן נתאר וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

אחד המנגנונים המוצעים לפיו נוגדנים טיפוליים נגד טאו מפחיתים את הפתולוגיה במחלת האלצהיימר הוא ספיגה בסיווג של טאו לשעבר מצטבר פתולוגי על ידי microglia. כאן, אנו מציגים את ההערכה בסיס התא כדי להעריך את ספיגת טאו על ידי microglia. חקירה זו מייצגת כלי חקירה שימושי כדי לאפיין טוב יותר את מנגנון הפעולה של נוגדנים נגד טאו.ביום הראשון של הניסוי, להכין את התאים BV-2 על ידי שטיפת אותם תחילה עם 1x PBS בבקבוק שבו הם כבר מתורבתים. ואז דגירה אותם עם 05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% C02 עד שהם מתנתקים מן הבקבוק. להשעות מחדש את התאים במדיום תרבות על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.לספור תאים ולהכין השעיית תא עם ריכוז סופי של 100, 000 תאים למיליליטר בינוני תרבות המכיל 200 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר. הוסף 250 microliters של ההשעיה תא זה ל הבאר ב 96 גם רקמת רקמה צלחת תחתונה שטוחה. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% C02, לילה.לאחר הפשרת צבירות צבע-טאו pH שהוכנו בעבר על קרח, לדלל אותם 65 microliters לכל מצב של מדיום ללא סרום, כדי להפוך את פתרון 500 nanomolar. לדלל נוגדנים ב 65 microliters של מדיום ללא סרום כדי להשיג כפול הריכוז הרצוי. מערבבים צבירות צבע-טאו pH ונוגדנים בצלחת 96 גם U-התחתון.לאטום את צלחת דילול זה דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחר להסיר את המדיום מצלחת 96 באר עם תאים BV-2. לשטוף את התאים בכל באר עם 100 microliters של טמפרטורת החדר 1x PBS.הסר PBS מצלחת התא BV-2. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 125 microliters של קומפלקסים אמינו מצלחת הדילול לכל באר של 96 גם צלחת תא BV-2, ו דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר הדגירה להסיר את קומפלקסים אמינו מן התאים לשטוף את התאים בכל באר עם 100 microliters של טמפרטורת החדר 1x PBS.לאחר הסרת PBS 1x להוסיף 50 microliters של 25% טריפסין EDTA ודגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של מדיום culturing מחדש להשעות את באר על ידי צינור למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. מעבירים את התאים לצלחת U-bottom 96 היטב וצנטריפוגה אותו ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.מניחים את הצלחת על קרח, ומסירים את המדיום. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של קרח קר 1x PBS וצנטריפוגה שוב ב 400 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על קרח ולשטוף שוב על ידי הסרת PBS 1x הוסיף בעבר והוספת 150 microliters של קרח קר PBS לגם.צנטריפוגה שוב באותם תנאים. מניחים את הצלחת על קרח ולשטוף את התאים על ידי הסרת PBS שנוספו בעבר והוספת 150 מאגר FACS microliters ל הבאר. צנטריפוגה שוב ב 400 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.מניחים את הלוח על הקרח ולהסיר את מאגר FACS שנוסף בעבר מחדש להשעות את התאים ב 200 מאגר FACS microliters לכל באר. מיד להמשיך לנתח על ידי FACS לרכוש 20, 000 אירועים בשער התא החי. לניתוח FACS השתמש באזור הפיזור קדימה או באזור פיזור FSCA לעומת צד או בעלילת צפיפות SSCA לשער בתאים חיים על-ידי אי-הכללת אירועים עם רמות פיזור קדמיות נמוכות יותר, כגון פסולת ותאים מתים.לאחר מכן, בתוך אוכלוסיית התאים החיים, השתמש בגובה פיזור FSCA לעומת גובה פיזור קדימה או FSCH כדי ליצור שער יחיד ולא לכלול כפילויות וצבירה של תאים. לאחר מכן השתמש באירועים בשער singlet כדי ליצור היסטוגרמה של פרמטר יחיד לצבוע pH. השתמש בהיסטוגרמה שנוצרה כדי לקבוע תחילה את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.לאחר מכן לקבוע אחוז של תאים חיוביים pH לצבוע-טאו על ידי אי הכללת תאים שליליים כפי שנקבע באמצעות הפקד היחיד של BV-2. נוגדנים CBTau-28.1 לקדם ספיגה של טאו בתאי BV-2 באופן תלוי מינון כפי שמוצג על ידי ציטומטריה זרימה. הנוגדן בעל הזיקה הגבוהה הכפולה CBTau-28.1 תיווך את ספיגת טאו בתאי BV-2 במידה גבוהה יותר מהנוגדן מסוג הבר.שברי CBTau-28.1 Fab לא להגדיל את ספיגת טאו הבסיסית המציין מנגנון הפנמה מתווך קולטן FC. מיקרוסקופ קונפוקל אישר נוגדן מתווך עלייה של ספיגת טאו. צבע pH ירוק שכותרתו אגרגטים טאו לעתים קרובות במשותף עם lysotracker צבע אדום מוכתם אורגנים חומציים ובכך מציע נוכחות של אגרגטים טאו בתא אנדוליזומלי.שברי CBTau-28.1 Fab לא להגדיל את ספיגת טאו שוב המציין כי ספיגת אכן היה FC מתווך. ההתראה שתיארנו זה הרגע מאפשרת לנו לכמת באופן עקבי באופן עקבי את ספיגת הנוגדנים של טאו על ידי מיקרוגליה. נתונים שנוצרו עם בדיקה זו יכולים לעזור להבהר את מנגנון הפעולה של נוגדנים אנטי טאו ובכך מייצג כלי שימושי כדי לקדם נוגדנים אנטי טאו לשלב נוסף בפיתוח שלהם כטיפול פוטנציאלי לספירה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Microglia בתור biosensor סרוגייט לקביעת Nanoparticle neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...