Name: cell-based assay to study antibody-mediated tau clearance by microglia
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00
Duration: 7 min 18 s
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हम अपने बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए अल्बर्टो Carpinteiro सोरेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

<ol>
	<li>Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+soluble+A&#946;+oligomers+as+a+drug+target+in+Alzheimer's+disease.">The case for soluble A&#946; oligomers as a drug target in Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).</li><li>Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+aggregates+as+immunotherapeutic+targets.">Tau aggregates as immunotherapeutic targets.</a> Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).</li><li>Martin, L., Latypova, X., Terro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+tau+protein:+Implications+for+Alzheimer's+disease.">Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease.</a> Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+targeting+pathological+tau+conformers+in+a+tangle+mouse+model+reduces+brain+pathology+with+associated+functional+improvements.">Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements.</a> Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).</li><li>Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+internalization+and+degradation+of+pathological+tau+is+enhanced+by+an+anti-tau+monoclonal+antibody.">Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody.</a> Scientific Reports. 5, 11161 (2015).</li><li>Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. 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E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+uptake+into+neurons+occurs+primarily+via+clathrin-dependent+Fcgamma+receptor+endocytosis+and+is+a+prerequisite+for+acute+tau+protein+clearance.">Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).</li><li>Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Koenigsknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Phagocytosis+of+Fibrillar+&#x3B2;-Amyloid+through+a+&#x3B2;1+Integrin-Dependent+Mechanism.">Microglial Phagocytosis of Fibrillar &#x3B2;-Amyloid through a &#x3B2;1 Integrin-Dependent Mechanism.</a> Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).</li><li>Kopec, K. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Microglia, निवासी है मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं, हाल ही में एंटीबॉडी में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में पहचान की गई है-tauopathies10,11के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण मध्यस्थता । एंटीबॉडी-मध्यस्थता ताऊ microglia द्वारा मंजूरी, एक साथ न्यूरॉन्स के ऊपर के अवरुद्ध के साथ9, अवरोध या फाइब्रिल गठन के स्थिरीकरण13,14 और तंतुओं के माध्यम से intraneuronal lysosomal की मंजूरी 15मार्ग, सभी विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभावकारिता में योगदान हो सकता है tauopathy5,6,7,8,9के माउस मॉडल में मनाया ।
हम यहां वर्णित एक सेल परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन ।
यह परख, दुर्गंध एट अल से अनुकूलित । 11, वी. बी.-2 कोशिकाओं का उपयोग करता है, जो murine microglial कोशिकाओं अमर हैं । जबकि वे पूरी तरह से प्राथमिक microglial कोशिकाओं की तुलना नहीं की जा सकती, वे प्राथमिक microglia की विशेषताओं के कई विशेषता, मजबूती phagocytose की क्षमता सहित दोनों Aβ और ताऊ तंतुओं11,16,17 ,18,19. इसके अलावा, वे इन विट्रो जो उंहें उच्च परख विकास और मात्रात्मक अध्ययन, जो ंयूनतम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की आवश्यकता के लिए उपयुक्त बनाया में एक reproducible व्यवहार दिखाया । इस के अलावा, अमर सेल लाइनों उच्च परख प्रवाह की अनुमति और प्राथमिक microglia के उपयोग की तुलना में पशु बलि के लिए जरूरत को खत्म ।
ताऊ समुच्चय हम इस परख में इस्तेमाल किया गया अत्यधिक reproducible इन विट्रो एकत्रीकरण प्रक्रिया है कि हम हाल ही में 13वर्णित का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे, और समान आकृति विज्ञान के लिए युग्मित पेचदार रेशा (PHFs) विज्ञापन के दिमाग से अलग दिखा रोगियों. जब तक हम किसी भी अप्रत्याशित परिणाम है कि ताऊ समुच्चय प्लास्टिक या कांच सतहों के लिए पालन की वजह से किया गया है पर गौर नहीं किया, स्थिर और अच्छी तरह से विशेषता ताऊ समुच्चय का उपयोग इस परख के reproducibility में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
एक अंय पहलू है कि काफी परख reproducibility में योगदान सेल घनत्व था । अच्छी तरह से प्रोटोकॉल में वर्णित प्रति कोशिकाओं की संख्या वर्णित स्थितियों में इष्टतम कोशिका घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
अलग से क्या दुर्गंध एट अल । 11 वर्णित है, हम एक पीएच संवेदनशील डाई जो काफी अंलीय organelles में internalization पर अपनी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, इस प्रकार intracellular ठहराव के लिए अनुमति के साथ ताऊ समुच्चय लेबल । यह, सतह बाध्य immunocomplexes और/या ताऊ के trypsin पाचन के साथ साथ, गारंटी देता है कि प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometry द्वारा मापा संकेत के बजाय सेलुलर सतह के लिए बाध्यकारी ताऊ का नतीजा है । इसके अलावा, एक पीएच संवेदनशील डाई का उपयोग सतह बंधे immunocomplexes/ताऊ समुच्चय जो तब सेल फिर से चढ़ाना और वसूली की आवश्यकता होती है पचाने की आवश्यकता के बिना सूक्ष्म प्रयोगों में आंतरिक ताऊ समुच्चय का पता लगाने में आसानी ।
हम भी आगे माइक्रोस्कोपी पढ़ने के लिए अनुकूलित हमारे परख के बाहर, जो पहले11वर्णित किया गया है की तुलना में, हमारे सूक्ष्म प्रयोगों में अंलीय organelles के लिए एक उच्च चयनात्मक डाई का उपयोग करके जो हमें न केवल एंटीबॉडी की पुष्टि करने के लिए मध्यस्थता की अनुमति दी ताऊ जी, लेकिन यह भी endolysosomal डिब्बे में ताऊ समुच्चय का स्थानीयकरण ।
परख हम विकसित की है, इष्टतम विशिष्टता है जो एक अच्छा प्रयोगात्मक सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच एक मजबूत जुदाई की अनुमति खिड़की में परिणाम है । दिलचस्प है, परख परोक्ष रूप से एंटीबॉडी संबंध में मतभेदों का पता लगाता है इस प्रकार एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों का अध्ययन ।

अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative हालत amyloid β पेप्टाइड और ताऊ प्रोटीन के रोग समुच्चय में गठन परिवर्तन और स्व-विधानसभा द्वारा विशेषता है । सामान्य घुलनशील amyloid β पेप्टाइड oligomeric और fibrillar amyloid β में कनवर्ट किया जाता है, जबकि असामान्य रूप से phosphorylated ताऊ oligomers और neurofibrillary पेचीदा1,2के रूप में जम जाता है । इन प्रोटीन समुच्चय कारण ंयूरॉन मौत स्मृति हानि और बाद में प्रगतिशील संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी । गैर-उत्पादक neuroinflammation और एक कम क्षमता वाले प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए, सहित अन्य कारकों, ख़राब हो सकता है और रोग में तेजी लाने के. वर्तमान में, विज्ञापन के खिलाफ हस्तक्षेप रणनीतियों मोटे तौर पर रोगसूचक राहत प्रदान करते हैं, लेकिन कोई बीमारी है-इलाज या रोकथाम को संशोधित ।
सबूत बढ़ाने से विज्ञापन की विकृति में hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय की एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है । अपने गैर रोग राज्य में, ताऊ एक देशी प्रोटीन है कि microtubules के लिए बांध और न्यूरॉन cytoskeleton में अपने विधानसभा को बढ़ावा देता है । जब ताऊ hyperphosphorylated हो जाता है, यह cytoskeleton और समूहों से अलग ंयूरॉन में ताऊ समुच्चय, जो3विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति के सबसे कारण माना जाता है । समुच्चय तौ पहले intracellularly जमा शुरू होता है, लेकिन के रूप में रोग की प्रगति, यह प्रभावित ंयूरॉंस से extracellular अंतरिक्ष में जारी किया है, जहां से यह एक में आसंन या synaptically जुड़ा स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जा सकता है माना जाता है " prion तरह से "। एक बार आंतरिक रूप से, ताऊ समग्र टेंपलेट गठन परिवर्तन4 के माध्यम से आगे ताऊ एकत्रीकरण लाती है ।
इस परिकल्पना के अनुसार ताऊ सीडिंग में रूकावट डालने में सक्षम उपचारों से ताऊ-मध्यस्थ neurodegenerative रोग का पाठ्यक्रम धीमा या उल्टा हो सकता है । इस के समर्थन में, चूहों आनुवंशिक उत्परिवर्तन द्वारा tauopathy के लिए अतिसंवेदनशील और निष्क्रिय विरोधी ताऊ एंटीबॉडी दिखाने के साथ इंजेक्शन कम ताऊ पैथोलॉजी और बेहतर संज्ञानात्मक समारोह5,6,7,8 ,9. हालांकि, तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सकीय एंटीबॉडी कम विकृति अभी भी मायावी रहते हैं ।
प्रस्तावित तंत्रों में से एक है एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी, मस्तिष्क के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं. हाल के प्रकाशनों सुझाव है कि microglia कुशलतापूर्वक internalize और रोग ताऊ प्रजातियों को नीचा कर सकते है और इस क्षमता को एक एफसी पर निर्भर तंत्र के माध्यम से विरोधी ताऊ एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया एफसी रिसेप्टर्स की सतह पर व्यक्त शामिल microglia और रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis10,11. इन आंकड़ों चिकित्सीय एंटीबॉडी के संभावित महत्वपूर्ण प्रभाव के रूप में microglia की पहचान ।
हम वर्णन करवायी एक सेल परख के लिए मात्रात्मक microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन । इस परख के साथ उत्पंन डेटा elucidating विरोधी की कार्रवाई के तंत्र-ताऊ एंटीबॉडी इस प्रकार एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए अग्रिम विरोधी ताऊ एंटीबॉडी संभावित विज्ञापन उपचार के रूप में उनके विकास के आगे कदम के लिए मदद कर सकते हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BV-2 cells</td>
			<td style="width:212px;">ICLC Interlab Cell Line Collection</td>
			<td style="width:344px;">ATL03001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5 g/dl glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasYFlask</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156499 / 159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pHrodo Green STP ester</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P35369&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD10 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 96-Well Assay Plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H3393-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA 0.5M, pH8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Canto II</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Deep Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Helmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay to study antibody-mediated tau clearance by microglia

अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative शर्त है जिसमें एग्रीगेटेड ताऊ और amyloid प्रोटीन मस्तिष्क में संचित होते हैं जिससे न्यूरॉन्स में शिथिलता आती है जो अंततः संज्ञानात्मक गिरावट की ओर ले जाती है. न्यूरॉन में Hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति का सबसे कारण माना जाता है । इन समुच्चय को extracellular डिब्बे में जारी किया और आसंन स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जहां वे आगे ताऊ एकत्रीकरण प्रेरित ग्रहण कर रहे हैं । इस "prion की तरह" फैल बाध्यकारी में सक्षम एंटीबॉडी द्वारा बाधित किया जा सकता है और "बेअसर" extracellular ताऊ समुच्चय के रूप में विज्ञापन के नैदानिक माउस मॉडल में दिखाया गया है । प्रस्तावित तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सीय एंटीबॉडी विकृति को कम करने का एक एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी है । यहां, हम एक मात्रात्मक कोशिका का वर्णन करने के लिए microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन परख आधारित है । यह परख माउस microglial सेल लाइन बी. वी.-2 का उपयोग करता है, उच्च विशिष्टता, कम परिवर्तनशीलता और मध्यम प्रवाह के लिए अनुमति देता है । इस परख के साथ उत्पंन डेटा विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों के एक बेहतर लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।

कुल मिलाकर रिकॉमबिनेंट तौ एक पीएच के प्रति संवेदनशील ग्रीन डाई के साथ covalently बला था । यह डाई नाटकीय रूप से अम्लीय organelles में अपनी internalization पर अपनी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, जिससे intracellular ठहराव के लिए अनुमति देता है । लेबल ताऊ समुच्चय विरोधी ताऊ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ मशीन थे । विशेष रूप से, हम CBTAU-२८.१ के एक chimeric संस्करण (माउस IgG1 एफसी क्षेत्र) का उपयोग किया । यह मानव एंटीबॉडी ताऊ के एन-टर्मिनल सम्मिलित क्षेत्र को बाँधता है और इन विट्रो में उत्पन्न तौ तंतुओं१३को बाँधने में सक्षम है. इस परख में, हम भी एक संबंध का परीक्षण-CBTAU-२८.१-dmCBTAU-२८.१ के संस्करण में सुधार । CBTAU के फैब टुकड़े-२८.१, माता पिता और उच्च संबध उत्परिवर्ती प्रारूप में, और एक माउस IgG1 isotype नियंत्रण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
वी. बी.-2 कोशिकाओं को पहले से बनाई immunocomplexes या एकीकृत तौ अकेले हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-निर्दलीय ताऊ के रूप में । गर्मी के बाद, कोशिकाओं को extracellular झिल्ली से बंधे ताऊ को दूर trypsinized थे और ताऊ के लिए विश्लेषण किया गया था प्रवाह cytometry द्वारा तेज । जैसा कि हमने हाल ही में13का वर्णन किया है, हमने देखा कि CBTAU-२८.१ वेरिएंट ने एक खुराक-निर्भर तरीके से बी. वी.-2 कोशिकाओं में ताऊ की अधिकता को बढ़ावा दिया । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़ों में वृद्धि नहीं हुई बेसल के बाद से था एफसी मध्यस्थता ताऊ जी (चित्रा 2) । इसके अलावा, उच्च अपनत्व dmCBTAU-२८.१ एंटीबॉडी की मध्यस्थता ताऊ वी. बी.-2 कोशिकाओं में एक उच्च हद तक जंगली प्रकार एंटीबॉडी (चित्रा 2) की तुलना में ।
एंटीबॉडी-मध्यस्थता ताऊ तेज और ताऊ समुच्चय के स्थानीयकरण endolysosomal डिब्बे में फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) जहां अंलीय सेलुलर डिब्बे कम पीएच organelles के लिए एक जांच चयनात्मक का उपयोग दाग था द्वारा की पुष्टि की थी । Intracellular puncta ग्रीन पीएच डाई लेबल ताऊ समुच्चय CBTAU-२८.१ के साथ मशीन थे कि कोशिकाओं के अंदर मनाया गया । इसके अलावा, intracellular ताऊ समुच्चय अक्सर कम पीएच डिब्बे चयनात्मक लाल डाई इस प्रकार के अम्लीय organelles में ताऊ समुच्चय की उपस्थिति का सुझाव के साथ colocalized । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़े वृद्धि नहीं किया ताऊ फिर से एक एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता internalization तंत्र का संकेत (चित्रा 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg"> चित्रा 1: वी. बी.-2 कोशिकाओं द्वारा ताऊ internalization का पता लगाने के लिए फ्लो cytometry एनालिसिस में गेटिंग स्ट्रैटेजी का इस्तेमाल किया । बी. वी.-2 से नमूना डेटा केवल नियंत्रण (ए सी), isotype नियंत्रण (डी एफ) और dmCBTAU-२८.१ (जी-I) दिखाया गया है । बी. वी.-2 सेल जनसंख्या एक FSC-ए बनाम एसएससी-मलबे और मृत कोशिकाओं को छोड़कर एक घनत्व भूखंड पर gated था (ए, डी, जी) । बी. वी.-2 कोशिकाओं को फिर आगे एक FSC-a बनाम FSC-एच घनत्व भूखंड पर सेल दोहरी और समुच्चय (ख, ई, एच) को बाहर करने के लिए gated थे । सिंगल सेल गेट एक पीएच डाई उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (इन प्रतिनिधि परिणामों में FITC) एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम (सी, एफ, आई) और ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण. वैकल्पिक रूप से, बी. ए.-2 केवल नियंत्रण का उपयोग करके निर्धारित के रूप में नकारात्मक कोशिकाओं को छोड़कर पीएच डाई-ताऊ सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की गई । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg"> चित्रा 2: CBTAU-२८.१ microglial वी. बी.-2 कोशिकाओं में ताऊ समुच्चय की मध्यस्थता । एग्रीगेट रिकॉमबिनेंट तौ हरे प्रतिदीप्ति पीएच के साथ covalently लेबल था संवेदनशील डाई और मानव विरोधी के एक माउस chimeric संस्करण के साथ मशीन-ताऊ एंटीबॉडी CBTAU-२८.१, अपने अपनत्व में सुधार स्वरूप, dmCBTAU-२८.१, इसी फैब टुकड़े, एक माउस IgG1 isotype नियंत्रण एंटीबॉडी या कोई एंटीबॉडी (ताऊ समुच्चय अकेला) । Immunocomplexes बाद में बी. वी. के साथ-2 कोशिकाओं को हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-निर्दलीय ताऊ के साथ मशीन थे । immunocomplexes के तेज प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था और ज्यामितीय माध्य (जीएम) के रूप में व्यक्त की प्रतिदीप्ति तीव्रता (ए) या ताऊ का प्रतिशत सकारात्मक (ताऊ +) कोशिकाओं (बी). (a) में त्रुटि पट्टियां दो स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन को इंगित करती हैं, जबकि (B) एक एकल प्रयोग दिखाता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg"> चित्रा 3: ताऊ समुच्चय वी के द्वारा आंतरिक है-2 कोशिकाओं और सेलुलर अंलीय organelles में information । पहिले ताऊ-एंटीबॉडी immunocomplexes वी. के.-2 कोशिकाओं के साथ हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-स्वतंत्र को रोकने के लिए मशीन थे । गर्मी के बाद, नाभिक एक डीएनए विशिष्ट नीले रंग और एक कम पीएच डिब्बे चयनात्मक लाल रंग के साथ अंलीय सेलुलर डिब्बे के साथ दाग थे । Live-सेल इमेजिंग से पता चला intracellular puncta के लेबल ताऊ समुच्चय (हरा) के अंदर कोशिकाओं है कि CBTAU-२८.१ और dmCBTAU-२८.१ के साथ मशीन थे, लेकिन isotype नियंत्रण के साथ नहीं है । इसके अलावा, intracellular ताऊ समुच्चय अक्सर लाल डाई (पीला) के साथ colocalized अम्लीय सेलुलर डिब्बे में ताऊ समुच्चय की उपस्थिति का सुझाव देते हैं । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़े नहीं वृद्धि हुई ताऊ एक एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता internalization तंत्र का संकेत । छवियाँ एक 63X जल विसर्जन उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत एक 20 विमानों जेड-टैक (०.५ µm विमानों) के अधिकतम तीव्रता अनुमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

यहां हम एक सेल का वर्णन परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ के ऊपर का आकलन ।

सेल ने परख कर पढ़ाई एंटीबॉडी-मध्यस्थता करने वाले ताऊ को Microglia ने मंजूरी

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

प्रस्तावित तंत्रों में से एक जिसके द्वारा चिकित्सीय विरोधी ताऊ एंटीबॉडी अल्जाइमर रोग में विकृति को कम करते हैं, माइक्रोग्लिया द्वारा रोग एकत्रित पूर्व ताऊ की मंजूरी में तेज है। यहां, हम माइक्रोग्लिया द्वारा ताऊ तेज का आकलन करने के लिए सेल बेस परख पेश करते हैं। यह परख एंटी-ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र को बेहतर तरह से चित्रित करने के लिए एक उपयोगी जांच उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।प्रयोग के पहले दिन बीवी-2 कोशिकाओं को पहले फ्लास्क में 1x पीबीएस से धोकर तैयार करें, जिसमें उन्हें संस्कारी किया गया है। फिर उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% C02 पर 05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के साथ तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे फ्लास्क से अलग न हो जाए। संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें ।कोशिकाओं की गणना करें और संस्कृति माध्यम में 100, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के साथ एक सेल निलंबन तैयार करें जिसमें 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर हेपरिन होता है। एक 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति फ्लैट नीचे प्लेट में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से इस सेल निलंबन के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। रात भर 5% C02 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।बर्फ पर पहले से तैयार पीएच डाई-ताऊ समुच्चय के बाद, उन्हें सीरम मुक्त माध्यम की स्थिति के अनुसार 65 माइक्रोलीटर में पतला करें, ताकि 500 नैनोमोलर समाधान बनाया जा सके। वांछित एकाग्रता को दोगुना प्राप्त करने के लिए सीरम मुक्त माध्यम के 65 माइक्रोलीटर में पतला एंटीबॉडी। एक ९६ अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में पीएच डाई-ताऊ समुच्चय और एंटीबॉडी मिलाएं ।इस कमजोर पड़ने की थाली को सील करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन बीवी-2 कोशिकाओं के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट से माध्यम को हटा दें। कमरे के तापमान 1x PBS के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं को धोएं।बीवी-2 सेल प्लेट से पीबीएस निकालें। एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग कमजोर पड़ने वाली प्लेट से अमीनो परिसरों के 125 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी तरह से बीवी-2 सेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए, और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं से अमीनो परिसरों को हटा दें और कमरे के तापमान 1x पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को धोएं।1x पीबीएस को हटाने के बाद 25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उसके बाद, 200 माइक्रोलीटर को खेती करने वाले माध्यम को जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कुएं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 96 अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।बर्फ पर थाली रखें, और माध्यम को हटा दें। बर्फ ठंड के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें 1x पीबीएस और अपकेंद्रित्र फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर। बर्फ पर थाली रखें और पहले से जोड़ा 1x PBS को हटाने और अच्छी तरह से प्रति बर्फ ठंड PBS के १५० माइक्रोलीटर जोड़ने के द्वारा फिर से धोने ।अपकेंद्रित्र फिर से एक ही शर्तों के तहत । प्लेट को बर्फ पर रखें और पहले जोड़े गए पीबीएस को हटाकर कोशिकाओं को धोएं और प्रति अच्छी तरह से 150 माइक्रोलीटर एफएस बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज।बर्फ पर प्लेट रखें और पहले से जोड़े गए FACS बफर को हटा दें और 200 माइक्रोलीटर FACS बफर प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। लाइव सेल गेट में 20, 000 घटनाओं को प्राप्त करने के लिए FACS द्वारा विश्लेषण करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें। FACS विश्लेषण के लिए आगे स्कैटर क्षेत्र या FSCA बनाम पक्ष तितर बितर क्षेत्र या SSCA घनत्व साजिश का उपयोग करने के लिए कम आगे तितर बितर स्तर, जैसे मलबे और मृत कोशिकाओं के साथ घटनाओं को छोड़कर रहते कोशिकाओं पर गेट ।फिर लाइव सेल आबादी के भीतर एफएससीए बनाम फॉरवर्ड स्कैटर हाइट या एफसीएच का उपयोग एक सिंगलेट गेट बनाने और सेल डबल्स और एग्रीगेट को बाहर करने के लिए किया जाता है। फिर एक पीएच डाई एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए सिंगलेट गेट में घटनाओं का उपयोग करें। पहले मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता निर्धारित करने के लिए उत्पन्न हिस्टोग्राम का उपयोग करें।उसके बाद बीवी-2 के एकमात्र नियंत्रण का उपयोग करते हुए निर्धारित नकारात्मक कोशिकाओं को छोड़कर पीएच डाई-ताऊ सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें। सीबीटीएयू-28.1 एंटीबॉडी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा दिखाए गए खुराक निर्भर तरीके से बीवी-2 कोशिकाओं में ताऊ के तेज को बढ़ावा देते हैं। उच्च आत्मीयता डबल उत्परिवर्ती CBTau-२८.१ एंटीबॉडी मध्यस्थता ताऊ बीवी-2 कोशिकाओं में एक उच्च हद तक जंगली प्रकार एंटीबॉडी से तेज ।सीबीटीएयू-28.1 फैब टुकड़ों ने एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता आंतरिककरण तंत्र का संकेत देते हुए बेसल ताऊ तेज में वृद्धि नहीं की। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने ताऊ के तेज की एंटीबॉडी मध्यस्थता वृद्धि की पुष्टि की । ग्रीन पीएच डाई लेबल वाले ताऊ अक्सर एक एंडोलेसोमल डिब्बे में ताऊ समुच्चय की उपस्थिति का सुझाव देते हैं।CBTau-२८.१ फैब टुकड़े ताऊ तेज फिर से संकेत है कि तेज वास्तव में एफसी मध्यस्थता की थी वृद्धि नहीं की । परख हम सिर्फ वर्णित हमें विशेष रूप से लगातार माइक्रोग्लिया द्वारा एंटीबॉडी मध्यस्थता ताऊ तेज मात्रा में अनुमति देता है । इस परख के साथ उत्पन्न डेटा एंटी-ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है, इस प्रकार संभावित विज्ञापन उपचार के रूप में उनके विकास में आगे बढ़ने के लिए एंटी-ताऊ एंटीबॉडी को आगे बढ़ाने के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

लेजर कैद की Microdissection ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

में सहज और Circadian नियमित Photobehavior अध्ययन करने के लिए लाइट पसंद परख<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं के एक Deconvolution विश्लेषण के साथ ग्लूटामेट क्लीयरेंस का टाइम कोर्स पाने

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

एक किराए की Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity निर्धारण करने के लिए Microglia

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

उच्च सामग्री के लिए परख विकास Sod1 उत्परिवर्ती प्रोटीन समग्र गठन के रहने की कोशिकाओं में ठहराव

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

एक साधारण कोशिका आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख रक्त में एन मिथाइल-डी-Aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर के खिलाफ Autoantibody का पता लगाने के लिए

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

लक्षण वर्णन और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा माउस प्राथमिक Microglia के अलगाव

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

एक उच्च प्रवाह कैल्शियम-फ्लक्स परख मोर्फिन अध्ययन करने के लिए Glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ रिसेप्टर्स/डी-serine और ग्लूटामेट

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

इन विट्रो में ताऊ के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए परख प्रोटीन और ड्रग स्क्रीनिंग

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...