Одним из предлагаемых механизмов, с помощью которых терапевтические антитела антитау уменьшают патологию болезни Альцгеймера, является поглощение патологического агрегированного бывшего Тау микроглией. Здесь мы представляем анализ клеточной базы для оценки поглощения Тау микроглией. Этот анализ представляет собой полезный инструмент исследования, чтобы лучше охарактеризовать механизм действия антитау антител.
В первый день эксперимента, подготовить BV-2 клетки, сначала мыть их с 1x PBS в колбе, в которой они были культурны. Затем инкубировать их с 05%трипсина EDTA при 37 градусов по Цельсию и 5%C02, пока они не отсоединиться от колбы. Повторное приостановление клеток в среде культуры путем трубопроводов вверх и вниз три-пять раз.
Подсчитайте клетки и подготовьйте подвесную клетку с окончательной концентрацией 100 000 клеток на миллилитр в среде культуры, содержащей 200 микрограммов на миллилитр гепарина. Добавьте 250 микролитров этой клеточной суспензии на колодец в плоской нижней пластине культуры 96 хорошо. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию с 5%C02, на ночь.
После оттаивания ранее подготовленных рН красителя-Тау агрегаты на льду, разбавить их в 65 микролитров на состояние сыворотки свободной среды, чтобы сделать 500 наномолярный раствор. Разбавить антитела в 65 микролитров сыворотки свободной среды для достижения двойной желаемой концентрации. Смешайте рН красителя-Тау агрегаты и антитела в 96 хорошо U-нижней пластины.
Печать этой разбавленной пластины и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. На следующий день удалить среду из 96 хорошо пластины с BV-2 клеток. Вымойте клетки в каждом хорошо с 100 микролитров комнатной температуры 1x PBS.
Удалите PBS из клеточной пластины BV-2. Используйте многоканарновую пипетку для переноса 125 микролитров аминокислотных комплексов из разбавленной пластины в каждую колодец 96 хорошо BV-2 клеточной пластины, и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2. После инкубации удалить аминокислотные комплексы из клеток и мыть клетки в каждой хорошо с 100 микролитров комнатной температуры 1x PBS.
После удаления 1x PBS добавить 50 микролитров 25%трипсина EDTA и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2. После этого добавьте 200 микролитров культивирования среды и повторно приостановите колодец, трубя вверх и вниз, чтобы отсоединить клетки. Перенесите клетки на 96 хорошо U-нижней пластины и центрифуги его на 400 х г в течение 5 минут при 4 градусах по Цельсию.
Поместите пластину на лед, и удалить среды. Добавьте 150 микролитров ледяного 1x PBS и центрифугу снова при 400 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Поместите пластину на лед и мыть снова, удалив ранее добавил 1x PBS и добавив 150 микролитров ледяной PBS на колодец.
Центрифуга снова на тех же условиях. Поместите пластину на лед и промыть клетки, удалив ранее добавленный PBS и добавив 150 микролитров facS буфера на колодец. Центрифуга снова при 400 г в течение 5 минут при 4 градусах цельсия.
Поместите пластину на лед и удалите ранее добавленный буфер FACS и повторно приостановит ячейки в 200 микролитров буфера FACS на колодец. Немедленно приступайте к анализу FACS для того чтобы приобрести 20.000 случаев в стробе клетки в реальном реальном. Для анализа FACS используйте область рассеяния вперед или FSCA по сравнению с областью бокового рассеяния или участок плотности SSCA к воротам на живых клетках, исключая события с более низкими уровнями рассеяния вперед, такие как мусор и мертвые клетки.
Затем в популяции живых клеток используйте FSCA по сравнению с высотой рассеяния вперед или FSCH, чтобы создать единые ворота и исключить дублеты клеток и агрегаты. Затем используйте события в синглетных воротах для генерации гистограммы одного параметра рН красителя. Используйте генерируемую гистограмму, чтобы сначала определить средняя интенсивность флуоресценции.
После этого определить процент рН красителя-Тау положительных клеток, исключая отрицательные клетки, как определено USING BV-2 только контроль. Антитела CBTau-28.1 способствуют поглощению Тау в клетках BV-2 в зависимости от дозы, как показано на цитометрии потока. Высокое сродство двойной мутант CBTau-28.1 антитела опосредовано Tau поглощения в клетках BV-2 в большей степени, чем дикие антитела типа.
CBTau-28.1 Fab фрагменты не увеличивают базальный Tau поглощения с указанием рецептора FC опосредованного механизма интернализации. Конфокаленная микроскопия подтвердила антитела опосредованное увеличение поглощения Тау. Зеленый рН краситель помечены Тау агрегаты часто совместно локализованы с lysotracker красный краситель окрашенных кислых органелл, таким образом, предполагая наличие Tau агрегатов в эндолизосомном отсеке.
CBTau-28.1 Fab фрагменты не увеличить Tau поглощения снова о том, что поглощение действительно ФК опосредовано. Анализ, который мы только что описали, позволяет нам точно количественно определить антитела, опосредованное поглощением Тау микроглией. Данные, полученные с помощью этого анализа может помочь выяснить механизм действия анти-Тау антител, таким образом, представляющих собой полезный инструмент для продвижения анти-Тау антител для дальнейшего шага в их развитии в качестве потенциального лечения АД.
