Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

ويدعم هذا العمل الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين منح 91753206، 21425204، و 21521003 و "البحوث الرئيسية الوطنية" و "مشروع تنمية" 2016YFA0501500.

تنبيه: عند الاقتضاء، والكواشف المستخدمة ينبغي شراؤها في شكل رناسي خالية، أو حله في رناسي-مجاناً، المذيبات (لمعظم الحالات، في بيروكاربوناتي إثيل (ديبك)-المياه المعالجة). عند التعامل مع عينات الحمض النووي الريبي وخالية من رناسي الكواشف، دائماً ارتداء القفازات والأقنعة، وتغييرها متكرر لتجن...

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins.">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms.">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li><li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition.">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li><li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila.">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128 (2016).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings.">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li><li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي عادلة أحد مفاتيح نجاح تجارب كريك. بمناسبة يغاندس Cu(I) وعملية متأنية، تدهور الجيش الملكي النيبالي يمكن إلى حد كبير تخفيض، على الرغم من أن تم ملاحظة انخفاض جزئي. أن نسب الاستبدال من الاتحاد الأوروبي و 4SU في العينات التجريبية هي 1.18% و 0.46 في المائة، على التوا?...

يتم نسخها الجينوم البشري إلى أنواع شتى من الترميز وفضله الكشف (نكرناس)، بما في ذلك مرناس، ررناس، ترنس والكشف النووية الصغيرة (سنرناس) والكشف النوية الصغيرة (سنورناس) والكشف (لنكرناس) منذ فترة طويلة غير الترميز1. معظم هذه الكشف تمتلك ملابس للممارسات التجارية التقييدية وتعمل ك جسيمات (رنبس) ريبونوكليوبروتين2. ولذلك، تعريفاً شاملا للممارسات التجارية التقييدية شرط أساسي لفهم الشبكة التنظيمية بين الكشف والممارسات التجارية التقييدية، الذي تورط في مختلف الأمراض البشرية3،،من45.
وقد شهدت الأعوام القليلة الماضية دفعة كبيرة للممارسات التجارية التقييدية التي اكتشفت في مختلف نظم حقيقية النواة2،6، بما في ذلك الإنسان7،،من89،10،11، ماوس12،،من1314، الخميرة9،،من1516، الزرد17، melanogaster المورفولوجية18،19 ، ايليجانس كاينورهابديتيس16، و أعطيت التمويل20،،من2122، والطفيليات البشرية23،24،25 . وقد سهل هذه السلف باستراتيجية القبض على الممارسات التجارية التقييدية وضعتها كاستيللو et al. 7 وبالتز et al. 8 في عام 2012، الذي يجمع في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط من الجيش الملكي النيبالي والبروتينات المتفاعلة، والتقاط oligo(dT) من poly(A) الكشف، والطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتين التنميط. ومع ذلك، نظراً لحقيقة أن poly(A) معظمها موجود في مرناس الناضجة، التي تمثل لفقط ~ 3%-5% من التوكسينات الترنسكربيتوم26، هذه الاستراتيجية المستخدمة على نطاق واسع ليست قادرة على التقاط التفاعل مع non-poly(A) الكشف، بما في ذلك نكرناس معظم الممارسات التجارية التقييدية وقبل مرناس.
هنا، نحن تقرير الإجراءات المفصلة لاستراتيجية وضعت مؤخرا لإلقاء القبض على الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة ل الممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A)27. ووصف كريك، يجمع هذه الاستراتيجية في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط ووسم الأيضية للكشف مع فوتواكتيفاتابل و "نقر" نوكليوزيد النظير (والتي تحتوي على مجموعة وظيفية بيورثوجونال التي يمكنها المشاركة في رد فوق)، 4- ثيوريديني (4SU)، و 5-اثينيلوريديني (الاتحاد الأوروبي). الخطوات الأساسية للحصول على نتائج مثالية مع استراتيجية كريك هي وسم الأيضية الفعالة والرد العابرة للربط، وانقر فوق الأشعة فوق البنفسجية، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. لأن Cu(I) يستخدم المحفز في انقر فوق رد فعل يمكن أن يسبب تجزئة الكشف، ضروري يجند Cu(I) التي يمكن أن تقلل من تفتيت الحمض النووي الريبي. ونحن تصف كيفية تنفيذ ردود فعالة انقر في الخلية ليساتيس دون التسبب في تدهور حاد في الجيش الملكي النيبالي.
على الرغم من أن القبض على الممارسات التجارية التقييدية وتحديد الهوية في خلايا هيلا فقط هي المبينة في هذا البروتوكول، يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية كريك لمختلف أنواع الخلايا وربما للكائنات الحية. وإلى جانب الاستيلاء على الممارسات التجارية التقييدية، يوفر هذا البروتوكول أيضا تبسيط الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد نموذج MS وتحديد البروتين، والتقدير الكمي، التي يمكن أن تكون مفيدة لأولئك الذين ليسوا على دراية بتجارب البروتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

تعريف شامل للجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) هو المفتاح لفهم هذه الشبكة التنظيمية بوسترانسكريبشونال في الخلايا. استراتيجية تستخدم على نطاق واسع لمكافحة الممارسات التجارية التقييدية التقاط يستغل بوليادينيليشن [poly(A)] للكشف المستهدف، الذي غالباً ما يحدث في حقيقية النواة مرناس ناضجة، ترك معظم البروتينات ملزمة من non-poly(A) الكشف مجهولي الهوية. هنا يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لأسلوب تم الإبلاغ عنها مؤخرا وصف فوق الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي إينتيراكتومي التقاط (كريك)، التي تمكن التقاط الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة للممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A) من خلال الجمع بين العلامات الاستقلابية من الكشف، في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط، ووضع علامات على بيورثوجونال.

وترد نتائج تمثيلية لخطوات مراقبة الجودة. وتشمل النتائج الأرقام لتحليل fluorescence في جل الموضحة في الخطوة 2.3.2 (الشكل 1)، وتحليل لطخة غربية الموضحة في الخطوة 4.1.3 (الشكل 2A)، وتحليل الفضة تلطيخ الموضحة في الخطوة 4-2-2 (الشكل 2). خطوات مر...

Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

بروتوكول مفصلة لتطبيق انقر فوق الكيمياء-وساعدت الاستراتيجية التقاط (كاريك) إينتيراكتومي الحمض النووي الريبي لتحديد البروتينات ملزما لكلا الترميز وفضله يرد الكشف.

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

هذه الطريقة، CARIC، يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ما بعد النسخ من الترفيه الجيني من خلال توفير تعداد شامل للبروتينات RNA ملزمة. والميزة الرئيسية لـ CARIC هي قدرته على التقاط البروتينات المرتبطة بأنواع مختلفة من الرنا رنا مثل الرنا ونات غير الترميز. يمكن استخدام هذه الطريقة في أنواع مختلفة والكائنات الحية لدراسة تفاعل البروتين RNA في العمل.أولاً، الخلايا الهيلا الثقافة في DMEM تكمل في 37 درجة مئوية في جو CO2 خمسة في المئة. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80 في المئة التقاء استبدال الوسط الثقافة على كل طبق مع 15 ملليلتر من قبل الدفء، والمتوسطة الطازجة. إضافة 15 ميكرولترات من الاتحاد الأوروبي 100 ملليمولار إلى كل طبق إلى تركيز النهائي من ملليمتر واحد.للتجارب ولا عينات التحكم الأشعة فوق البنفسجية إضافة 7.5 ميكرولترات من 100 ميليمولار أربع SU إلى كل طبق. تغطية الأطباق مع احباط وثقافة الخلايا لمدة 16 ساعة باستخدام الشروط السابقة. بعد ذلك، إضافة نصف المبلغ السابق للاتحاد الأوروبي و / أو أربع SU إلى لوحات المناسبة ومواصلة زراعة لمدة ساعتين أخرى.لتبدأ في الربط عبر الجسم الحي، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسل كل طبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني باستخدام خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية قدر الإمكان. بالنسبة للعينات التجريبية ولا توجد أربع عينات تحكم SU ، ضع الأطباق على الجليد مع إزالة الغطاء.استخدام الأشعة فوق البنفسجية عبر الرابط لتشعيع الخلايا مع الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر وعلى اثنين جول لكل سنتيمتر مربع. للحصول على عينات من الأشعة فوق البنفسجية لا تحكم، وضع الأطباق على الجليد وحمايتها من الضوء. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من العازلة قبل التحلل إلى كل طبق.استخدم رافع الخلايا المطاطية لكشط الخلايا وجمع تعليق ما قبل التحلل في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة العازلة قبل تحلل إلى أنبوب يحتوي على تعليق من اثنين من الأطباق ضبط الحجم الكلي إلى ستة ملليلتر. ثم إضافة وحدة تخزين متساوية من R lysis المخزن المؤقت.تمرير الخلية من خلال حقنة مع إبرة ضيقة عدة مرات حتى lysate واضحة ومتجانسة. احتضان ال ليسات في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف لمدة ساعة واحدة. بعد هذا تمييع lysate في 20 مجلدا من العازلة التخفيف وتقسيمه إلى 15 ملليلتر الكسور في 15 ملليلتر أنابيب untrafiltration، قطع الجزيئية من 10 كيلودالتون.باستخدام دوار دلو يتأرجح، تدور الأنابيب في 4000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا حتى يتم تركيز كل جزء إلى حجم أقل من ملليلتر واحد. إضافة 14 ملليلتر من تخفيف العازلة إلى كل جزء lysate المركزة وتكرار عملية التركيز. ثم الجمع بين الكسور وتركيزها على حجم من ستة ملليلتر باستخدام عملية التركيز الموصوفة سابقا.أولاً إعداد مزيج رد الفعل كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة هذا المزيج رد فعل إلى ستة ملليلتر من مسح مسبق lysate وخلط جيدا. إضافة 162.5 microliters من الحد من الكاشف ويخلط جيدا.احتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 800 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد هذا يروّي التفاعل بإضافة خمسة ملليمتر EDTA واحتضان على شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تقسيم خليط التفاعل بين أنبوبين 50 ملليلتر، كل منها يحتوي على أربعة مجلدات من الميثانول المبردة مسبقاً واحتضان في درجة حرارة سالبة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.جهاز طرد مركزي في 4000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تجاهل السوبر و إضافة بين ملليلتر واحد واثنين من الميثانول قبل المبردة إلى بيليه. Pipet صعودا وهبوطا لتفريق بيليه التأكد من أن بيليه ينتهي علقت تماما مع عدم وجود قطع مرئية.كرر عملية الطرد المركزي وإعادة التبجين مرتين. بعد هذا، استخلاص بعناية من الميثانول المتبقية قدر الإمكان التأكد من عدم إزعاج بيليه. إضافة 10 ملليلتر من العازلة إعادة تشكيل و pipet صعودا وهبوطا إلى حل بيليه.جهاز طرد مركزي في 4000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم نقل supernatant إلى أنبوب جديد مع التأكد من جمع 20 ميكرولترات من العينة لمراقبة الجودة. نقل تنظيف وإعادة تشكيل العينة إلى الخرز agarose streptavidin المعدة.احتضان في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف بين عشية وضحاها. تدور أسفل الخرز في 4000 مرة G لمدة خمس دقائق. نقل المابير إلى أنبوب جديد مع التأكد من جمع 20 ميكرولترات من العينة لمراقبة الجودة.اغسل الخرز بـ 10 ملليلتر من عازل الغسيل A.Incubate مع دوران لطيف عند 12 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم تدور أسفل الخرز في 4000 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة اابر وكرر عملية الغسيل والطرد المركزي مرة أخرى.كرر عملية الغسيل هذه لغسيل العازلة B وغسل العازلة C كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بغسل الخرز بـ 10 ملليلتر من هيدروكلوريد 50 ملليمولار تريس. تدور حبات أسفل في 4000 مرات G لمدة خمس دقائق.إزالة supernatant وتقسيم الخرز بالتساوي بين اثنين من أنابيب microcentrifuge 1.5. للبدء في الاستخفاف RNPs القبض ، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة elution الحيوية المعدة إلى 400 ميكرولترات من الخرز غسلها ، واستقر. احتضان على شاكر المدارية في 1500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.ثم احتضان على شاكر المدارية مع كتلة الحرارة في 1500 دورة في الدقيقة و 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي الخرز في 7800 مرات G لمدة دقيقة واحدة وجمع RNP مراوغة. إضافة 400 ميكرولترات من عازلة التن الحيوي الطازجة إلى الخرز.كرر عملية الحضانة والطرد المركزي لجمع elute الثانية والجمع بين elutes اثنين في أنبوب واحد 15 ملليلتر. بعد ذلك، إضافة ثلاثة مجلدات من العازلة التخفيف إلى elutes RNP مجتمعة لتقليل تركيز SDS. باستخدام أنبوب الترشيح فائقة 0.5 ملليلتر، تركز العينة إلى حوالي 40 ميكرولترات كما هو مبين في بروتوكول النص.إضافة 0.5 ميكروغرام لكل ميكروليتر RNase A واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للافراج عن RBPs من RNase عبر المرتبطة. جمع اثنين microliters من RBPs لمراقبة الجودة. عند تحسين بروتوكولات CARIC، تكون خطوات ضبط الجودة أمرًا بالغ الأهمية.يتم تنفيذ مراقبة الجودة التمثيلية للعينات التي تحمل علامة النقرة عن طريق تحليلات الفلورس في الجل. فقط العينة ذات المسمى مضاعف يظهر عصابة تشويه قوية في الوزن الجزيئي العالي الذي يمثل إشارة RNPs عبر المرتبطة. يتم إلغاء إشارة RNP عن طريق حذف إما الوحدة الخاصة الأربعة أو الاتحاد الأوروبي. ويمكن أيضا أن يتم إلغاؤها عن طريق الهضم مع RNase A.In بعض الحالات لوحظ وجود شريط لطخة قوية في أي عينة مراقبة SU أربعة.يمثل هذا النطاق RNase غير المرتبط بـ "غير متقاطع" والذي سوف يتحلل أثناء التثاب الحراري في معظم الحالات. يتم تقييم مراقبة الجودة من بيانات استطلاع تقارب من خلال تحليل لطخة الغربية التي تظهر إشارات البيوتين في العينات على حد سواء قبل الانسحاب وبعد الانسحاب. ويكشف تحليل تلطيخ الفضة من RBPs القبض على أن لخلايا هيلا، والكفاءة الإجمالية التقاط العام هو بين 0.05 و 0.1 في المئة من البروتينات المدخلات.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن RNase حساسة لريبونوكليس. الحفاظ على بيئة تجريبية نظيفة قدر الإمكان للحد من الخفض من RNase. بعد هذا الإجراء، يمكن تحديد ألمك البروتين باستخدام قياس الطيف الشامل preformed للكشف عن البروتينات التي تحد الحديد.بعد تطويرها ، فإن تقنية CARIC تمهد الطريق لفهم أكثر شمولا لتنظيم النسخ البريدي OT في العمل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support