Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af den National Natural Science Foundation i Kina tilskud 91753206, 21425204, og 21521003 og af den nationale nøgle forsknings- og udviklingsprojekt 2016YFA0501500.

Forsigtig: Når det er relevant, de reagenser skal købes i form af RNase-fri, eller opløst i RNase-fri, opløsningsmidler (i de fleste tilfælde, i diethylether pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand). Når du håndterer RNA prøver og RNase-fri reagenser, altid bære handsker og masker, og ændre dem ofte for at undgå RNase forurening.
1. forberedelse af Lysate af metabolisk mærket og UV krydsbundet celler
<ol><li>
Metaboliske indarbejdelse af EU og 4SU
	<ol>
<li>Kultur He...

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins.">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms.">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li><li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition.">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li><li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila.">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128 (2016).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings.">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li><li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

Vedligeholdelse af fair RNA integritet er en af nøglerne til succes CARIC eksperimenter. Med passende ligander af Cu(I) og forsigtig drift, kan RNA nedbrydning reduceres betydeligt, selv om delvis nedbrydning blev observeret. Substitution forhold mellem EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0,46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakte RNA'er med en længde på 2.000 nt, ~ 90% af RNA'er indeholder mindst én EU og en 4SU. For delvist nedbrudte RNA'er med en længde på 1.000 nt, ~ 70% af RNA'er indeholder m...

Det menneskelige genom er transskriberet i forskellige typer af kodning og noncoding RNA'er (klarlægning), herunder mRNAs, rRNAs, tRNAer, små nukleare RNA'er (snRNAs), lille nucleolar RNA'er (snoRNAs) og længe ikke-kodende RNA'er (lncRNAs)1. De fleste af disse RNA'er besidder tøj af RBPs og fungere som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. En omfattende identifikation af RBPs er derfor en forudsætning for at forstå den regulerende netværk mellem RNA'er og RBPs, som er impliceret i forskellige menneskelige sygdomme3,4,5.
De sidste par år har været vidne til et stort løft af RBPs opdaget i forskellige eukaryote systemer2,6, herunder menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gær9,15,16, zebrafisk17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskridt har været lettet ved en RBP capture strategi udviklet af Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking af RNA og dens interagerende proteiner, oligo(dT) opsamling af poly(A) RNA'er og massespektrometri (MS)-baseret proteom profilering. I betragtning af, at poly(A) overvejende findes på modne mRNAs, som tegner sig for kun ~ 3% - 5% af eukaryote transkriptom26, er denne udbredte strategi imidlertid ikke i stand til at indfange RBPs interagerer med non-poly(A) RNA'er, herunder de fleste klarlægning og pre-mRNAs.
Her, rapportere vi de detaljerede procedurer for en nyligt udviklede strategi for transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Betegnes CARIC, denne strategi kombinerer i vivo UV cross-linking og metaboliske mærkning af RNA'er med photoactivatable og "klikkes" nucleoside analoger (som indeholder en bioorthogonal funktionelle gruppe, der kan deltage i klik reaktion), 4 - thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Trin, der er nøglen til at få ideelle resultater med den CARIC strategi er effektiv metaboliske mærkning, UV cross-linking og klik reaktion og vedligeholdelse af RNA integritet. Fordi Cu(I) brugt som katalysator i klik reaktion kan forårsage fragmentering af RNA'er, er en Cu(I) ligand, der kan reducere RNA fragmentering afgørende. Vi beskriver, hvordan du udføre effektiv Klik reaktioner i cellelysater uden at forårsage alvorlige RNA nedbrydning.
Selv om RBP fange og identifikation i HeLa celler kun er beskrevet i denne protokol, kan den CARIC strategi anvendes til forskellige celletyper og eventuelt levende organismer. Udover RBP capture giver denne protokol også strømlinet trinvise procedurer for MS prøveforberedelsen og protein identifikation og kvantificering, som kan være nyttige for dem, der ikke er bekendt med proteom eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

En omfattende identifikation af RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøglen til at forstå den posttranskriptionelle regulerende netværk i cellerne. En udbredte strategi for RBP capture udnytter polyadenylation [poly(A)] af target RNA'er, som for det meste opstår på eukaryote modne mRNAs, forlader de fleste bindende proteiner af non-poly(A) RNA'er uidentificerede. Her beskriver vi de detaljerede procedurer i en nyligt rapporterede metode kaldes Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC), som muliggør transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved at kombinere den metaboliske mærkning af RNA'er, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal tagging.

De repræsentative resultater af kvalitetskontrol trin præsenteres. Resultaterne inkluderer tal i-gel fluorescens analyse beskrevet taktfast 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet taktfast 4.1.3 (figur 2A) og sølv-farvning analysen beskrevet taktfast 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontrol trin er kritisk for optimering af CARIC protokoller. Altid medtage kvalitetskontrol i forberedelsen af RB...

Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

En detaljeret protokol for at anvende den Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC) strategi for at identificere proteiner bindende til begge kodning og noncoding RNA'er præsenteres.

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Denne metode, CARIC, kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for post-transskription af gengenrogendræt ved at give en omfattende optælling af RNA-bindende proteiner. Den største fordel ved CARIC er dets evne til at fange proteiner bundet til forskellige former for RNA'er såsom mRNAs og ikke-kodning RNA'er. Denne metode kan anvendes i forskellige typer og organismen til at studere RNA protein interaktion på arbejdspladsen.For det første kultur HeLa celler i suppleret DMEM på 37 grader Celsius i en fem procent CO2 atmosfære. Når cellerne når omkring 80 procent sammenløb erstatte kulturmediet på hver skål med 15 milliliter forvarmet, frisk medium. Der tilsættes 15 mikroliter på 100 millimolar EU til hver skål til en endelig koncentration på en millimolar.For eksperimentelle og ingen UV-kontrolprøver tilsættes 7,5 mikroliter på 100 millimolar fire SU til hver skål. Dæk retterne med folie og kultur cellerne i 16 timer ved hjælp af de tidligere forhold. Derefter tilsættes halvdelen af den tidligere mængde EU og/eller fire SU'er til de relevante plader, og dyrkningen fortsættes i yderligere to timer.Til at begynde in vivo krydsbinding fjernes kulturmediet og vaskes hver skål tre gange med PBS med fem milliliter PBS pr. vask. Fjern den resterende PBS så meget som muligt. For de eksperimentelle og ingen fire SU kontrolprøver, placere retterne på is med låget fjernet.Brug en UV cross-linker til at bestråle cellerne med UV-lys på 365 nanometer og på to jules per centimeter kvadreret. For ingen UV kontrol prøver, placere retterne på is og beskytte dem mod lys. Dernæst tilsættes en milliliter prelysis buffer til hver skål.Brug en gummicelleløfter til at skrabe cellerne og opsamle forhjulssuspensionen i et 15 milliliterrør. Der tilsættes forlysebuffer til et rør, der indeholder suspensionen, fra to retter, der justerer det samlede volumen til seks milliliter. Tilføj derefter en tilsvarende mængde R lysis-buffer.Cellen lyser gennem en sprøjte med en smal nål flere gange, indtil lysatet er klart og homogent. Inkuber lysatet ved fire grader Celsius med blid rotation i en time. Efter denne fortyndes lysatet i 20 volumener af fortynding buffer og opdele det i 15 milliliter fraktioner i 15 milliliter untrafiltration rør, molekylær cutoff af 10 kilodaltons.Ved hjælp af en svingende spand rotator, drej rørene ved 4000 gange G og fire grader Celsius i ca 15 minutter, indtil hver fraktion er koncentreret til et volumen mindre end en milliliter. Der tilsættes 14 milliliter fortyndingsbuffer til hver koncentreret lysatfraktion, og koncentrationsprocessen gentages. Derefter kombineres fraktionerne og koncentreres dem til et volumen på seks milliliter ved hjælp af den tidligere beskrevne koncentrationsproces.Først forberede reaktionen mix som skitseret i tekstprotokollen. Tilsæt denne reaktion mix til de seks milliliter af præ-ryddet lysat og bland godt. Tilsæt 162,5 mikroliter af at reducere reagens og bland godt.Inkubere ved stuetemperatur på en orbital shaker ved 800 rpm i to timer. Efter denne dæmpning reaktionen ved at tilføje fem millimolar EDTA og inkubering på orbital shaker ved stuetemperatur i fem minutter. Dernæst opdeles reaktionsblandingen mellem to 50 milliliterrør, der hver indeholder fire volumener af forkølet methanol og inkuberes ved negative 30 grader Celsius i 30 minutter.Centrifuge ved 4000 gange G og fire grader Celsius i 15 minutter. Supernatanten kasseres, og der tilsættes mellem en og to milliliter forkølet methanol til pellets. Pipet op og ned for at bryde op pellet og sørg for, at pellet ender helt suspenderet uden synlige stykker.Gentag centrifugeringsprocessen og genoplivningsprocessen to gange. Efter dette, omhyggeligt trække ud den resterende methanol så meget som muligt at sikre ikke at forstyrre pellet. Tilsæt 10 milliliter rekonstitutionsbuffer og pipet op og ned for at opløse pellet.Centrifuge ved 4000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør derefter supernatanten til et nyt rør og sørg for at indsamle 20 mikroliter af prøven til kvalitetskontrol. Overfør den rensede og rekonstituerede prøve til de forberedte streptavidin agaroseperler.Inkubere ved fire grader Celsius med blid rotation natten over. Drej perlerne ned ved 4000 gange G i fem minutter. Overfør supernatanten til et nyt rør, og sørg for at indsamle 20 mikroliter af prøven til kvalitetskontrol.Vask perlerne med 10 milliliter vaskebuffer A.Inkubate med skånsom rotation ved 12 omdrejninger i minuttet og ved stuetemperatur i 10 minutter. Drej derefter perlerne ned ved 4000 gange G i fem minutter. Fjern supernatanten og gentag vaske- og centrifugeringsprocessen igen.Gentag denne vaskeproces for vaskebuffer B og vaskebuffer C som beskrevet i tekstprotokollen. Herefter vaskes perlerne med 10 milliliter 50 millimolar Tris hydrochlorid. Drej perlerne ned ved 4000 gange G i fem minutter.Fjern supernatanten og split perlerne jævnt mellem to 1,5 mikrocentrifuge rør. For at begynde at undvige de erobrede RNPs, tilsæt 400 mikroliter af tilberedt biotin elution buffer til 400 mikroliter af vaskede, afviklede perler. Inkubere på en orbital shaker ved 1500 rpm ved stuetemperatur i 20 minutter.Derefter inkuberes på en orbital shaker med en varmeblok ved 1500 rpm og 65 grader Celsius i 10 minutter. Centrifuge perlerne på 7800 gange G i et minut og indsamle den undvigede RNP. Tilføj 400 mikroliter frisk biotin elution buffer til perlerne.Gentag inkubations- og centrifugeringsprocessen for at indsamle en anden elut og kombinere de to elutter i et enkelt 15 milliliterrør. Dernæst tilsættes tre mængder fortyndingsbuffer til de kombinerede RNP-elutes for at reducere koncentrationen af SDS. Brug et 0,5 milliliter ultrafiltreringsrør, og koncentrat prøven til ca. 40 mikroliter som beskrevet i tekstprotokollen.Tilføj 0,5 mikrogram pr. mikroliter RNase A og inkuber ved 37 grader Celsius i to timer for at frigøre RBPs fra tværgående RNase. Saml to mikroliter af RINGmekanismer til kvalitetskontrol. Når CARIC-protokoller optimeres, er kvalitetskontroltrin afgørende.Repræsentativ kvalitetskontrol af klikmærkede prøver udføres via in-gel fluorescens analyser. Kun den dobbelt mærket prøve viser en stærk smørebånd på den høje molekylvægt, som repræsenterer signalet af tværgående RNPs. RNP-signalet afskaffes ved at udelade enten de fire SU'er eller EU. Det kan også afskaffes ved fordøjelse med RNase A.In nogle tilfælde en stærk smurt band er observeret i no four SU kontrol prøve.Dette bånd repræsenterer den mærkede uovertræt RNase, som vil nedbrydes under varme innaturering i de fleste tilfælde. Kvalitetskontrol af affinitetsmålingsdataficiency vurderes ved hjælp af western blot-analyse, som viser biotinsignalerne i prøverne både før pulldown og efter pulldown. En sølv farvning analyse af de tilfangetagne RBPs afslører, at for HeLa celler, den generelle samlede fange effektivitet er mellem 0,05 og 0,1 procent af input proteiner.Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske, at RNase er følsomme over for ribonucleaser. Hold forsøgsmiljøet så rent som muligt for at reducere affedtningen af RNase. Efter denne procedure, protein almake identifikation ved hjælp af massespektrometri kan præforme til at afsløre jern-afgrænsede proteiner.Efter udviklingen vil CARIC-teknikken bane vejen for en mere omfattende forståelse af ot-forordningen om postudsepskrift på arbejdspladsen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support