Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन अनुदान ९१७५३२०६, २१४२५२०४, और २१५२१००३ और राष्ट्रीय मुख्य अनुसंधान और विकास परियोजना 2016YFA0501500 द्वारा ।

सावधानी: जब लागू हो, इस्तेमाल किया एजेंट RNase के रूप में खरीदा जाना चाहिए मुक्त, या RNase में भंग-मुक्त, सॉल्वैंट्स (ज्यादातर मामलों के लिए, diethyl pyrocarbonate (DEPC)-इलाज पानी में) । जब आरएनए के नमूनों और RNase मुक्त रिएजेंट हैंड...

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	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. 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S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

मेला आरएनए अखंडता का रखरखाव सफल CARIC प्रयोगों के लिए कुंजियों में से एक है । घन (I) और सावधान संचालन के उचित लाइगैंडों के साथ, आरएनए क्षरण काफी कम हो सकता है, हालांकि आंशिक क्षरण मनाया गया था । प्रायोगिक नमून?...

मानव जीनोम कोडिंग और गैर कोडिंग RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs, tRNAs, लघु नाभिकीय RNAs (snRNAs), छोटे nucleolar RNAs (snoRNAs), और लंबे समय नॉन कोडिंग RNAs (lncRNAs)1सहित के विभिंन प्रकार में लिखित है । इन RNAs के अधिकांश RBPs और ribonucleoprotein कणों (RNPs)2के रूप में कार्य के कपड़े के अधिकारी । इसलिए, RBPs की एक व्यापक पहचान RNAs और RBPs, जो विभिंन मानव रोगों में फंसाया है के बीच विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए एक शर्त है3,4,5।
पिछले कुछ वर्षोंके विभिंन eukaryotic प्रणालियों2,6मानव7,8,9,10,11सहित में पता चला RBPs का एक महान बढ़ावा देखा है, माउस12,13,14, खमीर9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis एलिगेंस16, Arabidopsis थालियाना20,21,22, और मानव परजीवी23,24,25 . इन अग्रिमों Castello एट अल द्वारा विकसित एक RBP कब्जा रणनीति द्वारा सुविधा दी गई है । 7 और Baltz एट अल. 8 में २०१२, जो vivo यूवी पार-आरएनए और उसके बातचीत प्रोटीन, oligo (डीटी) पर कब्जा पाली (ए) RNAs, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-आधारित proteomic profiling के जोड़ने में जोड़ती है । हालांकि, तथ्य यह है कि पाली (एक) ज्यादातर परिपक्व mRNAs, जो केवल ~ 3% eukaryotic transcriptome26के 5% के लिए खाते पर मौजूद है, इस व्यापक रूप से इस्तेमाल किया रणनीति गैर के साथ बातचीत RBPs पर कब्जा करने में सक्षम नहीं है, पाली (एक) RNAs, सहित सबसे ncRNAs और पूर्व mRNAs ।
यहां, हम दोनों पाली (ए) और गैर पाली (ए) RBPs27के transcriptome चौड़ा कब्जा के लिए हाल ही में विकसित रणनीति की विस्तृत प्रक्रियाओं की रिपोर्ट । CARIC, इस रणनीति vivo यूवी पार जोड़ने और photoactivatable और "क्लिक करने वाले" nucleoside सादृश्य के साथ RNAs के चयापचय लेबलिंग में जोड़ती है (जो एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह है कि क्लिक प्रतिक्रिया में भाग लेने के होते हैं), 4- thiouridine (4SU), और 5-ethynyluridine (ईयू) । कदम है कि CARIC रणनीति के साथ आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है कुशल चयापचय लेबलिंग, यूवी पार से जोड़ने और प्रतिक्रिया क्लिक करें, और आरएनए अखंडता के रखरखाव कर रहे हैं । क्योंकि घन (i) में क्लिक करें प्रतिक्रिया में उत्प्रेरक के रूप में उपयोग RNAs के विखंडन, एक घन (i) ligand जो आरएनए फ़्रेग्मेंटेशन कम कर सकते है आवश्यक है कारण हो सकता है । हम गंभीर आरएनए क्षरण के कारण के बिना सेल lysates में कुशल क्लिक प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन ।
हालांकि RBP कब्जा और हेला कोशिकाओं में पहचान केवल इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, CARIC रणनीति विभिंन प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता है और संभवतः रहने वाले जीवों के लिए । RBP कैप्चर के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी एमएस नमूना तैयारी और प्रोटीन की पहचान और ठहराव, जो जो proteomic प्रयोगों से परिचित नहीं हैं के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए सुव्यवस्थित कदम दर कदम प्रक्रियाओं प्रदान करता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की एक व्यापक पहचान कोशिकाओं में posttranscriptional विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । RBP कब्जा के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की रणनीति polyadenylation [पाली (ए)] लक्ष्य RNAs है, जो ज्यादातर eukaryotic परिपक्व mRNAs पर होता है, गैर की सबसे बाध्यकारी प्रोटीन छोड़कर पाली (एक) RNAs अज्ञात कारनामे । यहाँ हम एक हाल ही में रिपोर्ट की विधि की विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन क्लिक करें रसायन विज्ञान सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC), जो दोनों पाली (ए) और गैर पाली (ए) RBPs के चयापचय लेबलिंग के संयोजन के द्वारा transcriptome व्यापक कब्जा सक्षम बनाता है RNAs, vivo में यूवी क्रॉस-लिंकिंग, और bioorthogonal टैगिंग ।

गुणवत्ता नियंत्रण कदम के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं । परिणाम में जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण के आंकड़े शामिल कदम 2.3.2 (चित्रा1) में वर्णित है, पश्चिमी दाग कदम 4.1.3 (चि?...

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Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

पर कब्जा और क्लिक करें रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति का उपयोग करके आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान

क्लिक रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति दोनों कोडिंग और गैर कोडिंग RNAs के लिए बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए लागू करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है ।

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

यह विधि, CARIC, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की एक व्यापक जनगणना प्रदान करके जीन मनोरंजन के बाद प्रतिलेखन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकते हैं । CARIC का मुख्य लाभ इसकी इसकी क्षमता ऐसे mRNAs और गैर कोडिंग RNAs के रूप में आरएनए के विभिन्न प्रकार के लिए बाध्य प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए है। इस विधि का उपयोग विभिन्न प्रकारों और जीव में काम पर आरएनए प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।सबसे पहले, संस्कृति HeLa कोशिकाओं में पूरक DMEM में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पांच प्रतिशत CO2 वातावरण में । जब कोशिकाओं के बारे में ८० प्रतिशत संगम तक पहुंचने के पूर्व, ताजा माध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पकवान पर संस्कृति माध्यम की जगह । एक मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक डिश में 100 मिलीमोलर ईयू के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रायोगिक और कोई यूवी नियंत्रण नमूनों के लिए प्रत्येक पकवान के लिए १०० मिलीमोलर चार एसयू के ७.५ माइक्रोलीटर जोड़ें । पिछली स्थितियों का उपयोग करके 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को पन्नी और संस्कृति के साथ व्यंजनों को कवर करें। इसके बाद, यूरोपीय संघ की पिछली राशि का आधा और/या चार सु को उपयुक्त प्लेटों में जोड़ें और एक और दो घंटे के लिए खेती जारी रखें ।वीवो क्रॉस-लिंकिंग में शुरू करने के लिए, संस्कृति माध्यम को हटा दें और प्रत्येक डिश को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं प्रति वॉश पीबीएस के पांच मिलीलीटर का उपयोग करके। जितना हो सके अवशिष्ट पीबीएस निकालें। प्रायोगिक और कोई चार एसयू नियंत्रण नमूनों के लिए, ढक्कन हटा के साथ बर्फ पर व्यंजन जगह है ।365 नैनोमीटर पर यूवी प्रकाश के साथ कोशिकाओं को विकिरणित करने के लिए एक यूवी क्रॉस-लिंकर का उपयोग करें और दो जूल्स प्रति सेंटीमीटर चुकता पर। कोई यूवी नियंत्रण नमूनों के लिए, बर्फ पर व्यंजन जगह है और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए। इसके बाद, प्रत्येक डिश में प्रीलिसिस बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें।कोशिकाओं को कुरेदने और 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रीलिसिस निलंबन एकत्र करने के लिए एक रबर सेल लिफ्टर का उपयोग करें। छह मिलीलीटर करने के लिए कुल मात्रा को समायोजित करने के दो व्यंजनों से निलंबन युक्त एक ट्यूब के लिए prelysis बफर जोड़ें । फिर आर लाइसिस बफर की बराबर मात्रा जोड़ें।कोशिका को एक संकीर्ण सुई के साथ एक सिरिंज के माध्यम से कई बार पारित करें जब तक कि lysate स्पष्ट और सजातीय न हो जाए। एक घंटे के लिए कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर lysate इनक्यूबेट । इसके बाद तनु बफर के 20 वॉल्यूम में lysate को कमजोर करें और इसे 15 मिलीलीटर अनट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब्स में 15 मिलीलीटर अंशों में विभाजित करें, 10 किलोडडलटन की आणविक कटऑफ।एक झूल बाल्टी रोटेटर का उपयोग करना, ४००० बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर लगभग 15 मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन जब तक प्रत्येक अंश एक मिलीलीटर से कम मात्रा के लिए केंद्रित है । प्रत्येक केंद्रित lysate अंश में कमजोर पड़ने बफर के 14 मिलीलीटर जोड़ें और एकाग्रता प्रक्रिया को दोहराएं। फिर अंशों को मिलाएं और उन्हें पहले वर्णित एकाग्रता प्रक्रिया का उपयोग करके छह मिलीलीटर की मात्रा में केंद्रित करें।सबसे पहले टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। इस प्रतिक्रिया मिश्रण को पूर्व-निकासी वाले lysate के छह मिलीलीटर में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। रिएजेंट को कम करने और अच्छी तरह से मिश्रण के 162.5 माइक्रोलीटर जोड़ें।दो घंटे के लिए ८०० आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । इसके बाद पांच मिलीमोलर EDTA जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं और कक्षीय शेखर पर पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करें । इसके बाद, दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों के बीच प्रतिक्रिया मिश्रण को विभाजित करें, प्रत्येक में पूर्व-ठंडा मेथनॉल की चार मात्रा होती है और 30 मिनट के लिए नकारात्मक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होती है।4000 बार जी और 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और गोली में पूर्व-ठंडा मेथनॉल के एक और दो मिलीलीटर के बीच जोड़ें। पिपेट ऊपर और नीचे को तोड़ने के लिए गोली सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से कोई दिखाई हिस्सा के साथ निलंबित समाप्त होता है ।अपकेंद्री और पुनर्पन्नरण प्रक्रिया को दो बार दोहराएं। इसके बाद, जितना संभव हो अवशिष्ट मेथनॉल को ध्यान से बाहर निकालें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि गोली को परेशान न किया जाए। गोली को भंग करने के लिए 10 मिलीलीटर पुनर्संस्था बफर और पिपेट अप और नीचे जोड़ें।4000 बार जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। फिर सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिससे गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 20 माइक्रोलीटर एकत्र करना सुनिश्चित करें। साफ किए गए नमूने को स्थानांतरित करें और तैयार स्ट्रेप्टाविडिन एगरेजेंट मोतियों को पुनर्गठित करें।रात भर कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । पांच मिनट के लिए 4000 बार जी पर मोतियों को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिससे गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 20 माइक्रोलीटर एकत्र करना सुनिश्चित करें।12 आरपीएम पर कोमल रोटेशन के साथ और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धोने बफर A. Incubate के 10 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धोएं । फिर पांच मिनट के लिए 4000 बार जी पर मोतियों को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट निकालें और एक बार फिर धुलाई और अपकेंद्रित्र प्रक्रिया दोहराएं।इस वॉश प्रोसेस को वॉश बफर बी के लिए दोहराएं और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में बताए गए बफर सी को धोएं । इसके बाद मोतियों को 10 मिलीलीटर 50 मिलीमोलर ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड से धोएं। मोतियों को पांच मिनट के लिए 4000 बार जी पर नीचे स्पिन करें।सुपरनेट निकालें और मोतियों को दो 1.5 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के बीच समान रूप से विभाजित करें। कैप्चर किए गए आरएनपी को शुरू करने के लिए, 400 माइक्रोलीटर तैयार बायोटिन एल्यूयूशन बफर को धोया, बसे हुए मोतियों के 400 माइक्रोलीटर में जोड़ें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १५०० आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर पर इनक्यूबेट ।फिर 1500 आरपीएम पर हीट ब्लॉक के साथ एक कक्षीय शेखर पर और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक मिनट के लिए 7800 बार जी पर मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और मिल पाई आरएनपी एकत्र करें। मोतियों में ताजा बायोटिन एल्यूशन बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक दूसरे एल्यूट को इकट्ठा करने के लिए इनक्यूबेशन और अपकेंद्रित्र प्रक्रिया दोहराएं और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में दो elutes गठबंधन करें। इसके बाद, एसडीएस की एकाग्रता को कम करने के लिए संयुक्त आरएनपी एल्यूट्स में कमजोर पड़ने वाले बफर के तीन वॉल्यूम जोड़ें। 0.5 मिलीलीटर अल्ट्रा फिल्ट्रेशन ट्यूब का उपयोग करके, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित लगभग 40 माइक्रोलीटर के लिए नमूना केंद्रित करें।क्रॉस-लिंक्ड आरएनएसई से आरबीएस को जारी करने के लिए दो घंटे के लिए ०.५ माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर RNase ए और ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें । गुणवत्ता नियंत्रण के लिए आरबीएसपी के दो माइक्रोलीटर एकत्र करें। CARIC प्रोटोकॉल का अनुकूलन करते समय, गुणवत्ता नियंत्रण चरण महत्वपूर्ण होते हैं।क्लिक लेबल किए गए नमूनों का प्रतिनिधि गुणवत्ता नियंत्रण इन-जेल फ्लोरेसेंस विश्लेषण के माध्यम से किया जाता है। केवल दोगुना लेबल नमूना उच्च आणविक वजन जो पार से जुड़े RNPs के संकेत का प्रतिनिधित्व करता है पर एक मजबूत धब्बा बैंड से पता चलता है । आरएनपी सिग्नल को या तो चार एसयू या ईयू को छोड़ कर समाप्त कर दिया जाता है । यह भी RNase के साथ पाचन द्वारा समाप्त किया जा सकता है A.In कुछ मामलों में कोई चार एसयू नियंत्रण नमूने में एक मजबूत गंदा बैंड मनाया जाता है ।यह बैंड लेबल वाले अनक्रॉस-लिंक्ड आरएनए का प्रतिनिधित्व करता है जो ज्यादातर मामलों में गर्मी के रोपण के दौरान नीचा होगा। एफ़िनिटी पोल डेटाफिसेंसी के गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन पश्चिमी दाग विश्लेषण के माध्यम से किया जाता है जो पुलडाउन से पहले और पुलडाउन के बाद दोनों नमूनों में बायोटिन संकेतों को दर्शाता है। कब्जा कर लिया RBPs के एक चांदी धुंधला विश्लेषण से पता चलता है कि HeLa कोशिकाओं के लिए, सामांय कुल कब्जा दक्षता इनपुट प्रोटीन के ०.०५ और ०.१ प्रतिशत के बीच है ।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि आरएनएएस राइबोन्यूक्लिस के प्रति संवेदनशील हैं। RNase के degredation को कम करने के लिए संभव के रूप में संभव के रूप में संभव के रूप में स्वच्छ रखने के लिए। इस प्रक्रिया के बाद, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन अल्माके पहचान को लोहे से बंधे प्रोटीन को प्रकट करने के लिए पूर्व सूचित किया जा सकता है।इसके विकास के बाद, CARIC तकनीक काम पर पोस्टल ट्रांसक्रिप्शन ओटी विनियमन की अधिक व्यापक समझ के लिए मार्ग प्रशस्त करेगी ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA संयंत्र Protoplasts से इंटरैक्टियम कैद

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी रेजिन के तीव्र विकास के लिए सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस - एक केस स्टडी के रूप में एंटीबॉडी कैप्चर

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-राल सहायता प्राप्त कब्जा का उपयोग कर प्रोटीन एस-Acylation का पता लगाने

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर