Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 보조금 91753206, 21425204, 21521003 그리고 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 2016YFA0501500에 의해 지원 됩니다.

주의: 해당 되는 경우, 사용 시 약 되어야 RNase 무료의 형태로 구입 하거나 RNase-무료, 용 매에 용 해 (diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 대부분의 경우-처리 물). 때 RNA 샘플 및 RNase 무료 시 약 처리, 항상 장갑 및 마스크를 착용 하 고 자주 RNase 오염을 피하기 위하여 그들을 변경.
1. 준비의 Lysate의 Metabolically 표시 및 UV 복사해올된 셀
<ol><li>
EU와 4SU의 변화 관
	<ol>
<li>문화 HeL...

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins.">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms.">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li><li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition.">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li><li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila.">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128 (2016).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings.">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li><li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

공정한 RNA 무결성의 유지 관리는 성공적인 CARIC 실험 키 중 하나입니다. Cu(I) 및 주의 적절 한 ligands와 RNA 저하 줄일 수 있습니다 상당히, 비록 부분 저하 관찰 했다. EU와 실험 샘플에서 4SU의 대체 비율은 1.18%와 0.46%, 각각 (데이터 표시 되지 않음). 2000의 길이 그대로 RNAs에 대 한 nt, RNAs의 ~ 90% 이상의 EU 및 한 4SU 포함. 부분적으로 저하 RNAs의 길이 대 한 nt, RNAs의 ~ 70% 포함 하나 이상 EU와 한 4SU. 따라서, ...

인간 게놈은 코딩 및 noncoding RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs tRNAs, 작은 핵 RNAs (snRNAs), 작은 nucleolar RNAs (snoRNAs), 그리고 긴 비 코딩 RNAs (lncRNAs)1의 다양 한 형식으로 복사할 수 있습니다. 대부분 이러한 RNAs의 RBPs의 의류를 보유 하 고 ribonucleoprotein 입자 (RNPs)2로 작동. 따라서 RBPs의 포괄적인 식별 다양 한 인간 질병3,,45에 연루 RNAs 사이의 RBPs, 규제 네트워크를 이해 하기 위한 전제 조건입니다.
지난 몇 년 동안 다양 한 진 핵 시스템2,6, 인간의7,,89,10,11를 포함 하 여 발견 RBPs의 큰 향상을 목격 했다 마우스12,,1314, 효 모9,,1516, zebrafish17, 초파리 melanogaster18,19 , 꼬마 선 충16, 애기 thaliana20,,2122, 그리고 인간의 기생충23,24,25 . 이러한 진보 카스텔로 연구진이 개발한 RBP 캡처 전략에 의해 촉진 되어 있다 7 , Baltz 외. 8 2012 년에 RNA와 단백질 상호 작용, 많은 RNAs의 oligo(dT) 캡처 및 질량 분석 (MS)의 cross-linking vivo에서 UV-proteomic 프로 파일링 기반. 그러나, 그 많은 계정에 대 한 3%-5%만 진 핵 transcriptome26의 성숙한 mRNAs에 주로 존재 하는 사실을 감안할 때이 널리 사용 되는 전략은 RBPs non-poly(A) RNAs, 대부분 ncRNAs를 포함 한 상호 작용을 캡처할 수 그리고 사전 mRNAs입니다.
여기, 우리는 많은 non-poly(A) RBPs27transcriptome 전체 캡처에 대 한 최근 개발 된 전략의 세부 절차를 보고합니다. CARIC 되 나,이 전략 결합 vivo에서 UV cross-linking 및 photoactivatable 및 "클릭" nucleoside 유사 체 (는 클릭 반응에 참여할 수는 bioorthogonal 기능 그룹 포함)와 RNAs의 대사 라벨 4- thiouridine (4SU), 그리고 5-ethynyluridine (유럽 연합). CARIC 전략 이상적인 결과 얻기 위해 중요 단계는 효율적인 대사 라벨, UV cross-linking 및 클릭 반응, 그리고 RNA 무결성의 유지 관리 합니다. 클릭 반응에서 촉매로 사용 하는 Cu(I)는 RNAs의 조각화를 발생할 수 있습니다, 때문에 RNA 조각화를 줄일 수 있는 Cu(I) ligand 필수적 이다. 우리는 심각한 RNA 저하를 유발 하지 않고 세포 lysates의 효율적인 클릭 반응을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
RBP 캡처만 HeLa 세포에서 식별이이 프로토콜에서 설명 하는 있지만 다양 한 세포 유형으로, 그리고 아마도 생물 CARIC 전략을 적용할 수 있습니다. RBP 캡처, 게다가이 프로토콜 또한 MS 샘플 준비, 단백질 식별 및 정량화, proteomic 실험에 익숙하지 않는 사람들을 위해 도움이 될 수 있는 효율적인된 단계별 절차를 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

RNA 의무적인 단백질 (RBPs)의 포괄적인 식별 셀에 posttranscriptional 규제 네트워크를 이해 하는 열쇠입니다. RBP 캡처에 대 한 널리 사용 되는 전략은 polyadenylation [많은] 대상 RNAs의 미확인 non-poly(A) RNAs의 대부분 바인딩 단백질을 떠나 진 성숙한 mRNAs에 주로 발생 하는 이용 한다. 여기 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC)의 대사 라벨을 결합 하 여 많은 non-poly(A) RBPs transcriptome 전체 캡처를 가능 하 게 되 나 최근 보고 된 방법의 자세한 절차 설명 RNAs vivo에서 UV cross-linking, 그리고 bioorthogonal 태그.

품질 관리 단계의 대표적인 결과 표시 됩니다. 결과 단계 2.3.2 (그림 1)에서 설명 하는 젤에 형광 분석, 단계 4.1.3 (그림 2A)에서 설명 하는 서쪽 오 점 분석 및 단계 4.2.2 (그림 2B)에 설명 된 실버 얼룩 분석 수치 포함. 품질 관리 단계는 CARIC 프로토콜의 최적화를 위해 중요 합니다. 항상 대규모 RBP 식별 실험의 ...

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Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

이 방법, CARIC, RNA 결합 단백질의 포괄적인 인구 조사를 제공 하 여 유전자 레크리에이션의 후 전사의 분야에서 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다. CARIC의 주요 장점은 mRNA 및 비코딩 RNA와 같은 다양한 종류의 RNA에 바인딩된 단백질을 포착하는 능력입니다. 이 방법은 다양한 유형 및 유기체에서 작용시 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있다.첫째, 5%의 CO2 대기에서 섭씨 37도에서 DMEM을 보충한 배양 헬라 세포. 세포가 약 80%에 도달하면 각 접시의 배양 배지를 예동, 신선한 배지의 15 밀리리터로 대체합니다. 각 접시에 100 밀리머 EU의 15 마이크로리터를 추가하여 1 밀리머의 최종 농도를 유지합니다.실험용 및 자외선 제어 샘플의 경우 각 접시에 100 밀리머 4 SU의 7.5 마이크로리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 16 시간 동안 세포를 호일로 덮고 요리를 덮습니다. 그 후, EU 및/또는 4개의 SU의 이전 금액의 절반을 적절한 판에 추가하고 2시간 동안 계속 배양합니다.생체 내 교차 연결에서 시작하려면, 배양 매체를 제거하고 세척 당 PBS의 5 밀리리터를 사용하여 PBS로 각 접시를 세 번 세척하십시오. 잔여 PBS를 가능한 한 많이 제거합니다. 실험적이고 4개의 SU 제어 샘플이 없는 경우 뚜껑을 제거한 채 접시를 얼음 위에 놓습니다.UV 크로스 링커를 사용하여 365 나노미터의 UV 빛과 2개의 줄의 제곱을 통해 세포를 조사합니다. 자외선 제어 샘플이 없는 경우, 얼음 위에 접시를 놓고 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로 각 접시에 프리리시스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.고무 셀 리프터를 사용하여 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브에서 프리 리시즈 서스펜션을 수집합니다. 총 볼륨을 6밀리리터로 조정하는 두 접시의 서스펜션이 포함된 튜브에 프리리시스 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 동일한 양의 R 리시스 버퍼를 추가합니다.리스가 명확하고 균일 할 때까지 좁은 바늘로 주사기를 통해 셀 리스를 여러 번 전달합니다. 1 시간 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 lysate을 배양. 이 후 희석 버퍼의 20 볼륨에서 lysate를 희석하고 15 밀리리터 여과 튜브, 10 킬로달톤의 분자 차단에 15 밀리리터 분획으로 분할.스윙 버킷 회전기를 사용하여 튜브를 4000회 G와 섭씨 4도에서 약 15분간 회전하여 각 분획이 1밀리리터 미만의 부피로 농축됩니다. 각 농축 된 용액 분획에 14 밀리리터의 희석 버퍼를 추가하고 농도 과정을 반복합니다. 그런 다음 분획을 결합하고 이전에 설명한 농도 공정을 사용하여 6 밀리리터의 부피에 농축한다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 믹스를 준비합니다. 이 반응 믹스를 미리 지워진 용액의 6 밀리리터에 넣고 잘 섞습니다. 시약을 줄이는 162.5 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다.궤도 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 800rpm의 배양합니다. 이 후 5 밀리머 EDTA를 추가하고 5 분 동안 실온에서 궤도 셰이커에 인큐베이팅하여 반응을 담금질. 다음으로, 반응 혼합물을 50밀리리터 튜브 2개 사이로 나누고, 각각 4권의 미리 냉각된 메탄올을 포함하고 30분 동안 음수 섭씨 30도에서 배양한다.원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 15분 동안. 상체를 버리고 미리 차가운 메탄올의 1~2밀리리터를 펠릿에 넣습니다. 펠릿이 보이는 덩어리없이 완전히 중단되도록 펠릿을 분해하기 위해 위아래로 파이프.원심분리 및 재서스펜션 프로세스를 두 번 반복합니다. 그 후, 펠릿을 방해하지 않도록 가능한 한 잔류 메탄올을 조심스럽게 꺼낸다. 10 밀리리터의 재구성 버퍼를 추가하고 펠릿을 녹이도록 위아래로 파이프를 넣습니다.원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 10분 간. 그런 다음 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집하는 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 세척 및 재구성된 샘플을 준비된 스트렙타비딘 아가로즈 구슬로 옮기.하룻밤 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 배양. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집할 수 있도록 새로운 튜브로 상체를 전송합니다.10 밀리리터의 워시 버퍼 A.Incubate로 구슬을 12 rpm및 실온에서 10 분 동안 부드럽게 회전시 세척하십시오. 그런 다음 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 상체를 제거하고 세탁 및 원심 분리 과정을 다시 한 번 반복하십시오.이 세척 과정을 반복하여 버퍼 B를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 C를 세척합니다. 그 후, 50 밀리머 트리스 염산염의 10 밀리리터로 구슬을 씻으시다. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다.상체를 제거하고 두 개의 1.5 마이크로 센세이퍼지 튜브 사이에 구슬을 균등하게 분할합니다. 포획된 RNP를 제외하기 시작하려면 400마이크로리터의 세척된 정착구슬에 준비된 비오틴 용출 버퍼 400마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1500 rpm에서 궤도 셰이커를 20분 동안 배양합니다.그런 다음 1500 rpm과 섭씨 65도에서 10 분 동안 열 블록으로 궤도 셰이커에 배양하십시오. 구슬을 7800회 G로 1분간 원심분리하고 꺼진 RNP를 수집합니다. 400 마이크로리터의 신선한 비오틴 용출 버퍼를 비드에 추가합니다.인큐베이션 및 원심분리 과정을 반복하여 두 번째 엘루트를 수집하고 두 개의 엘루스를 단일 15 밀리리터 튜브에 결합합니다. 다음으로, 결합된 RNP elutes에 3권의 희석 버퍼를 추가하여 SDS의 농도를 감소시다. 0.5 밀리리터 울트라 여과 튜브를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 약 40 마이크로리터에 농축합니다.마이크로리터 RNase A당 0.5 마이크로그램을 추가하고 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 교차 연결된 RNase에서 RBP를 방출합니다. 품질 관리를 위해 두 개의 마이크로리터를 RP로 수집합니다. CARIC 프로토콜을 최적화할 때 품질 관리 단계가 중요합니다.클릭 라벨이 부착된 샘플의 대표적인 품질 관리는 인겔 형광 분석을 통해 수행됩니다. 이중 표지된 샘플만이 교차 연결된 RNP의 신호를 나타내는 높은 분자량에서 강한 얼룩 밴드를 보여줍니다. RNP 신호는 4개의 SU 또는 EU를 생략하여 폐지됩니다. 또한 RNase를 사용하여 소화에 의해 폐지될 수 A.In 어떤 경우에는 4개의 SU 제어 샘플에서 강한 얼룩밴드가 관찰된다.이 밴드는 대부분의 경우 열 내포화 중에 저하되는 레이블이 지정되지 않은 연결되지 않은 RNase를 나타냅니다. 선호도 투표 데이터의 품질 관리는 풀다운 전과 풀다운 후 샘플의 비오틴 신호를 보여주는 서부 블롯 분석을 통해 평가됩니다. 포획된 RBP의 은 염색 분석은 HeLa 세포의 경우 일반적인 총 포획 효율이 입력 단백질의 0.05~0.1% 사이임을 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 RNase는 ribonucleases에 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. RNase의 탈색을 줄이기 위해 실험 환경을 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 이 절차에 따라 질량 분석법을 사용하여 단백질 알메이크 식별이 미리 형성되어 철 경계 단백질을 나타낼 수 있습니다.개발 후 CARIC 기술은 직장에서 우편 전사 OT 규정을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support