Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av den nasjonale Natural Science Foundation av Kina tilskudd 91753206, 21425204, og 21521003 og ved nasjonale nøkkelen forskning og utviklingsprosjektet 2016YFA0501500.

FORSIKTIG: Eventuelt reagensene brukes bør kjøpes i form av RNase-fri, eller oppløst i RNase-fri, løsemidler (i de fleste tilfeller, i diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann). Ved håndtering av RNA prøver og RNase-fri reagenser, alltid bruke hansker og masker, og endre dem ofte for å unngå RNase forurensning.
1. forberedelse av Lysate av Metabolically merket og UV krysskoblet celler
<ol><li>
Metabolsk innlemmelse av EU og 4SU
	<ol>
<li>Kultur HeLa celler i Dulbe...

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins.">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms.">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li><li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition.">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li><li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila.">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128 (2016).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings.">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li><li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

Vedlikehold av rettferdig RNA integritet er en av nøklene til vellykket CARIC eksperimenter. Med riktig ligander av Cu(I) og forsiktig operasjon, kan RNA fornedrelse reduseres betydelig, selv om delvis fornedrelse ble observert. Substitusjon prosenter av EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0.46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakt RNAs med en lengde på 2000 nt ~ 90% av RNAs inneholder minst én EU og en 4SU. For delvis dårligere RNAs med en lengde på 1000 nt ~ 70% av RNAs inneholder minst én EU og ...

Det menneskelige genomet er transkribert til ulike typer koding og noncoding RNAs (ncRNAs), inkludert mRNAs, rRNAs, tRNAs, liten kjernefysiske RNAs (snRNAs), liten nucleolar RNAs (snoRNAs) og lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs)1. De fleste av disse RNAs har klær av RBPs og fungerer som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. Derfor er en omfattende identifikasjon av RBPs en forutsetning for å forstå regulatoriske nettverket mellom RNAs og RBPs, som er involvert i ulike menneskelige sykdommer3,4,5.
De siste årene har sett en stor forbedring av RBPs i ulike eukaryote systemer2,6, inkludert menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gjær9,15,16, sebrafisk17 Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskrittene har blitt lettere ved en RBP datafangst strategi utviklet av Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking RNA og samspill proteiner, oligo(dT) fange av poly(A) RNAs og massespektrometri (MS)-basert proteomic profilering. Gitt det faktum at poly(A) hovedsakelig finnes på eldre mRNAs, som står for bare ~ 3-5% av eukaryote transcriptome26, er dette brukte strategi imidlertid ikke kan fange RBPs samspill med non-poly(A) RNAs, inkludert de fleste ncRNAs og pre-mRNAs.
Her rapporterer vi detaljerte prosedyrer på en nylig utviklet strategi for transcriptome hele tatt både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Kalt CARIC, denne strategien kombinerer i vivo UV cross-linking og metabolske merking av RNAs med analogs med photoactivatable og "klikkbare" nukleosid (som inneholder en bioorthogonal funksjonsgruppe som kan delta i Klikk reaksjon), 4 - thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Fremgangsmåten for å få perfekte resultater med CARIC strategi er effektiv metabolske merking, UV cross-linking og klikk reaksjon og vedlikehold av RNA integritet. Fordi Cu(I) brukes som katalysator Klikk reaksjon kan forårsake fragmentering av RNAs, er en Cu(I) ligand som kan redusere RNA fragmentering viktig. Vi beskriver hvordan du utfører effektiv Klikk reaksjoner i celle lysates uten å forårsake alvorlige RNA nedbrytning.
Selv om RBP fange og identifisering i HeLa celler bare er beskrevet i denne protokollen, kan CARIC strategien brukes ulike celletyper og muligens levende organismer. Foruten RBP fange gir denne protokollen også strømlinjeformet trinnvise fremgangsmåter for MS utvalg forberedelse og protein identifikasjon og måling, som kan være nyttig for de som ikke er kjent med proteomic eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

En omfattende identifikasjon av RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøkkelen til å forstå posttranscriptional regulatoriske nettverket i celler. En brukte strategi for RBP fange utnytter polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, som stort sett oppstår på eukaryote moden mRNAs, forlater de fleste bindende proteiner av non-poly(A) RNAs uidentifisert. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av en nylig rapportert metode kalt Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC), som gjør transcriptome hele erobringen av både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved å kombinere metabolske merkingen av RNAs, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal merking.

Representant resultatene av kvalitetskontroll trinnene presenteres. Resultatene omfatter tall i-gel fluorescens analysen beskrevet i trinn 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet i trinn 4.1.3 (figur 2A) og sølv flekker analysen beskrevet i trinn 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontroll trinnene er avgjørende for optimalisering av CARIC protokoller. Alltid inkludere kvalitetskontroll i utarbeid...

Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

En detaljert protokoll for å bruke Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC) strategi for å identifisere proteiner bindende til både koding og noncoding RNAs presenteres.

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Denne metoden, CARIC, kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen ettertranskripsjon av genre rekreasjon ved å gi en omfattende folketelling av RNA-bindende proteiner. Den største fordelen med CARIC er dens evne til å fange proteiner bundet til ulike typer RNAer som mRNAs og ikke-koding RNA. Denne metoden kan brukes i ulike typer og organismen til å studere RNA protein interaksjon på jobb.For det første, kultur HeLa celler i supplert DMEM på 37 grader Celsius i en fem prosent CO2 atmosfære. Når cellene når ca 80 prosent samløpet erstatte kulturmediet på hver tallerken med 15 milliliter prewarmed, frisk medium. Tilsett 15 mikroliter på 100 millimolar EU til hver tallerken til en endelig konsentrasjon på en millimolar.For eksperimentelle og ingen UV-kontrollprøver legger du til 7,5 mikroliter på 100 millimolar fire SU til hver tallerken. Dekk oppvasken med folie og kultur cellene i 16 timer ved hjelp av de tidligere forholdene. Etter dette legger du til halvparten av den forrige mengden EU og/eller fire SU til de aktuelle platene og fortsetter å kultere i ytterligere to timer.For å begynne in vivo krysskobling, fjern kulturmediet og vask hver tallerken tre ganger med PBS ved hjelp av fem milliliter PBS per vask. Fjern rester pbs så mye som mulig. For eksperimentelle og ingen fire SU kontrollprøver, plasser oppvasken på is med lokket fjernet.Bruk en UV-kryss-linker for å bestråle cellene med UV-lys på 365 nanometer og ved to jules per centimeter kvadrert. For ingen UV-kontrollprøver, legg oppvasken på is og beskytt dem mot lys. Deretter legger du til en milliliter prelysebuffer til hver tallerken.Bruk en gummicelleløfter til å skrape cellene og samle prelyse suspensjon i en 15 milliliter tube. Legg prelyse buffer til et rør som inneholder suspensjon fra to retter justere det totale volumet til seks milliliter. Deretter legger du til et likt volum av R lysis buffer.Før cellelysatet gjennom en sprøyte med en smal nål flere ganger til lysatet er klart og homogent. Inkuber lysatet ved fire grader Celsius med mild rotasjon i en time. Etter dette fortynner lysatet i 20 mengder fortynningsbuffer og deler den i 15 milliliter fraksjoner i 15 milliliter untrafiltrasjonsrør, molekylær cutoff på 10 kilodaltonn.Bruk en svingende bøtte rotator, spinne rørene på 4000 ganger G og fire grader Celsius i ca 15 minutter til hver brøkdel er konsentrert til et volum mindre enn en milliliter. Tilsett 14 milliliter fortynningsbuffer til hver konsentrert lysatfraksjon og gjenta konsentrasjonsprosessen. Deretter kombinerer du brøkene og konsentrerer dem til et volum på seks milliliter ved hjelp av den tidligere beskrevne konsentrasjonsprosessen.Først forberede reaksjonsblandingen som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsett denne reaksjonsblandingen til de seks milliliter med forhåndsklarert lysat og bland godt. Tilsett 162,5 mikroliter med å redusere reagensen og bland godt.Inkuber ved romtemperatur på en orbital shaker ved 800 rpm i to timer. Etter dette slukke reaksjonen ved å legge til fem millimolar EDTA og inkubere på orbital shaker ved romtemperatur i fem minutter. Deretter deler du reaksjonsblandingen mellom to 50 milliliter rør, som hver inneholder fire volumer av prekjølt metanol og inkuberer ved negative 30 grader Celsius i 30 minutter.Sentrifuge ved 4000 ganger G og fire grader Celsius i 15 minutter. Kast det overnaturlige og tilsett mellom en og to milliliter pre-kjølt metanol til pellet. Pipet opp og ned for å bryte opp pellet sørge for at pellet ender opp helt suspendert uten synlige biter.Gjenta sentrifugerings- og resuspensjonsprosessen to ganger. Etter dette, trekk forsiktig ut gjenværende metanol så mye som mulig, og sørg for ikke å forstyrre pelleten. Tilsett 10 milliliter rekonstitueringsbuffer og pipet opp og ned for å oppløse pelleten.Sentrifuge ved 4000 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter. Deretter overfører du det overnaturlige til et nytt rør og sørger for å samle 20 mikroliter av prøven for kvalitetskontroll. Overfør den oppryddingen og rekonstituert prøven til de tilberedte streptavidin agarose perlene.Inkuber ved fire grader Celsius med mild rotasjon over natten. Spinn ned perlene ved 4000 ganger G i fem minutter. Overfør det overnaturlige til et nytt rør, og sørg for å samle 20 mikroliter av prøven for kvalitetskontroll.Vask perlene med 10 milliliter vaskebuffer A.Inkuber med mild rotasjon ved 12 o/min og ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter spinner du ned perlene ved 4000 ganger G i fem minutter. Fjern det overnaturlige og gjenta vaske- og sentrifugeringsprosessen igjen.Gjenta denne vaskeprosessen for vaskebuffer B og vaskebuffer C som beskrevet i tekstprotokollen. Etter dette, vask perlene med 10 milliliter av 50 millimolar Tris hydroklorid. Spinn perlene ned på 4000 ganger G i fem minutter.Fjern det overnaturlige og del perlene jevnt mellom to 1,5 mikrocentrifuge rør. For å begynne å unnvike de fangede RPs, legg til 400 mikroliter forberedt biotin elution buffer til 400 mikroliter vasket, avgjorte perler. Inkuber på en orbital shaker ved 1500 rpm ved romtemperatur i 20 minutter.Deretter inkubere på en orbital shaker med en varmeblokk på 1500 rpm og 65 grader Celsius i 10 minutter. Sentrifuger perlene ved 7800 ganger G i ett minutt og samle den unnsluppede RNP. Tilsett 400 mikroliter med fersk biotin elution buffer til perlene.Gjenta inkubasjons- og sentrifugeringsprosessen for å samle en ny elute og kombinere de to elutes i et enkelt 15 milliliter rør. Deretter legger du til tre volumer fortynningsbuffer til de kombinerte RNP-elutes for å redusere konsentrasjonen av SDS. Bruk et 0,5 milliliter ultrafiltreringsrør, konsentrat prøven til ca. 40 mikroliter som beskrevet i tekstprotokollen.Legg til 0,5 mikrogram per mikroliter RNase A og inkuber ved 37 grader Celsius i to timer for å frigjøre RBPer fra krysskoblede RNase. Samle to mikroliter av RBPs for kvalitetskontroll. Når du optimaliserer CARIC-protokoller, er kvalitetskontrolltrinn avgjørende.Representativ kvalitetskontroll av klikkmerkede prøver utføres via analyser av fluorescens i gelen. Bare den dobbelt merkede prøven viser et sterkt smørebånd ved høymolekylær vekt som representerer signalet fra krysskoblede RNPs. RNP-signalet avskaffes ved å utelate enten de fire SU eller EU. Det kan også avskaffes ved fordøyelsen med RNase A.In noen tilfeller observeres et sterkt smurt bånd i no four SU-kontrollprøven.Dette båndet representerer den merkede uncross-koblede RNase som vil forringes under varmemetningen i de fleste tilfeller. Kvalitetskontroll av affinitetsmålingsdataene vurderes gjennom western blot-analyse som viser biotinsignalene i prøvene både før nedtrekk og etter nedtrekk. En sølvfargeanalyse av de fangede RBPs avslører at for HeLa-celler er den generelle totale fangsteffektiviteten mellom 0,05 og 0,1 prosent av inngangsproteinene.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske at RNase er følsomme for ribonucleases. Hold det eksperimentelle miljøet så rent som mulig for å redusere degredation av RNase. Etter denne prosedyren kan protein almake identifikasjon ved hjelp av massespektrometri forhåndsformed for å avsløre jern-avgrensende proteiner.Etter utviklingen vil CARIC-teknikken bane vei for en mer omfattende forståelse av posttranskripsjonen OT-reguleringen på jobben.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktivert tverrbundet Agarose for den raske utviklingen av affinitet kromatografi harpikser-antistoff fangst som en Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Påvisning av protein s-acylasjon ved hjelp av Acyl-harpiks assistert fangst

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte