Name: capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation av Kina bidrag 91753206, 21425204, och 21521003 och av nationella nyckel forsknings- och utvecklingsprojektet 2016YFA0501500.

FÖRSIKTIGHET: I förekommande fall, de använda reagenserna bör köpas i form av RNase-fri, eller upplöst i RNase-fri, lösningsmedel (i de flesta fall i dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten). Vid hantering av RNA-prover och reagenser som RNase-fri, alltid bära handskar och masker, och ändra dem ofta för att undvika RNase kontaminering.
1. beredning av lysat av metaboliskt märkta och UV tvärbundna celler
<ol><li>
Metaboliska införlivandet av EU och 4SU
	...

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease.">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li><li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration:+Seq+and+you+shall+receive.">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li><li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases.">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li><li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins.">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells.">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture.">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome:+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease.">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li><li>Matia-Gonz&#225;lez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms.">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li><li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition.">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li><li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo.">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li><li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila.">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128 (2016).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings.">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li><li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana.">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts.">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li><li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei:+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome.">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li><li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture.">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).</li><li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions.">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li><li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins.">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly(A)+tail+dynamics.">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li><li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly(A)+trap.">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li><li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA.">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li><li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA.">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA.">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li><li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+in+bacteria.">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2018).</li></ol>

Underhåll av verkligt RNA integritet är en av nycklarna till framgångsrik CARIC experiment. Med lämpliga ligander av Cu(I) och noggrann drift, kan RNA nedbrytning minskas betydligt, även partiell nedbrytning observerades. Substitution kvoterna i EU och 4SU i experimentprover är 1,18% respektive 0,46%, (inga data anges). För intakt RNAs med en längd av 2 000 nt, ~ 90% av RNAs innehåller minst ett EU och ett 4SU. För delvis försämrad RNAs med en längd på 1000 nt, ~ 70% av RNAs innehåller minst ett EU och ett...

Det mänskliga genomet är transkriberas till olika typer av kodning och icke-kodande RNAs (ncRNAs), inklusive mRNA, rRNAs, tRNAs, små nukleära RNAs (snRNAs), små nukleolära RNAs (snoRNAs) och långa icke-kodande RNAs (lncRNAs)1. De flesta av dessa RNAs besitter kläder av RBPs och fungera som ribonukleoprotein partiklar (RNPs)2. En heltäckande identifiering av RBPs är därför en förutsättning för att förstå den regulatoriska nätverk mellan RNAs och RBPs, som är inblandade i olika mänskliga sjukdomar3,4,5.
De senaste åren har bevittnat ett stort uppsving av RBPs upptäckte olika eukaryota system2,6, inklusive mänskliga7,8,9,10,11, mus12,13,14, jäst9,15,16, zebrafiskar17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22och mänskliga parasiter23,24,25 . Dessa framsteg har underlättats genom en RBP fånga strategi som utvecklats av Castello o.a. 7 och Baltz o.a. 8 i 2012, som kombinerar i vivo UV cross-linking av RNA och dess samverkande proteiner, oligo(dT) fångst av poly(A) RNAs och masspektrometri (MS)-baserat proteomiska profilering. Med tanke på att poly(A) främst finns på mogen mRNA, som står för bara ~ 3% - 5% av de eukaryota transkriptom26, är denna utbredda strategi emellertid inte kan fånga RBPs interagerar med non-poly(A) RNAs, inklusive de flesta ncRNAs och pre-mRNA.
Här rapporterar vi de detaljerade förfarandena för en nyligen utvecklad strategi för transkriptom-wide tillfångatagandet av både poly(A) och non-poly(A) RBPs27. Denna strategi kallas CARIC, och kombinerar i vivo UV cross-linking och metabola märkning av RNAs med photoactivatable och ”klickbara” nukleosid-analoger (som innehåller en bioorthogonal funktionell grupp som kan delta i Klicka reaktion), 4 - thiouridine (4SU) och 5-ethynyluridine (EU). Stegen som är nyckeln till att få perfekt resultat med den CARIC strategin är effektiv metabola märkning, UV cross-linking och klicka reaktion och underhåll av RNA integritet. Eftersom Cu(I) används som katalysator i Klicka reaktion kan orsaka fragmenteringen av RNAs, är en Cu(I)-ligand som kan minska RNA fragmentering viktigt. Vi beskriver hur du utför effektiv Klicka reaktioner i cellen lysates utan att orsaka allvarliga RNA försämringar.
Även om RBP fånga och identifiering i HeLa celler endast beskrivs i detta protokoll, kan CARIC strategin tillämpas olika celltyper och eventuellt levande organismer. Förutom RBP fånga finns detta protokoll också strömlinjeformad stegvisa procedurer för MS provberedning och protein identifiering och kvantifiering, vilket kan vara användbart för dem som inte är bekant med proteomiska experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HeLa</td>
			<td style="width:175px;">ATCC</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:351px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EU (5-ethynyl uridine)</td>
			<td style="width:175px;">Wuhu Huaren Co.</td>
			<td style="width:175px;">CAS:69075-42-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">4SU (4-thiouridine)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10&#215;PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV cross-linker</td>
			<td style="width:175px;">UVP</td>
			<td style="width:175px;">CL-1000</td>
			<td>Equiped with 365-nm UV lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">D5758</td>
			<td>To treat water. Highly toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris&#183;HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LiCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:175px;">Biodee</td>
			<td style="width:175px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88265</td>
			<td>One tablet for 50 mL lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS (Lithium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:175px;">UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin magnetic beads</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-biotin</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Azide-Cy5</td>
			<td style="width:175px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:175px;">AZ118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LDS sample buffer (4&#215;)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10% bis-Tris gel</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase A</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether]</td>
			<td style="width:175px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:175px;">315442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">61743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MaxQuant</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Version: 1.5.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and identification of rna-binding proteins by using click chemistry-assisted rna-interactome capture (caric) strategy

En heltäckande identifiering av RNA-bindande proteiner (RBPs) är nyckeln till att förstå det postttransskriptionell regulatoriska nätverket i celler. En vanligt förekommande strategi för RBP fånga utnyttjar den polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, vilket oftast sker på eukaryota mogen mRNA, lämnar de flesta bindningsproteiner på non-poly(A) RNAs oidentifierade. Här beskriver vi de detaljerade förfarandena för en nyligen rapporterade metod kallas Klicka kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC), vilket gör att transkriptom-wide fånga både poly(A) och non-poly(A) RBPs genom att kombinera metabola märkning av RNAs i vivo UV cross-linking och bioorthogonal taggning.

De representativa resultat av kvalitetskontroll steg presenteras. Resultatet inkluderar siffror i-gel fluorescens analysen beskrivs i steg 2.3.2 (figur 1), western blot analys beskrivs i steg 4.1.3 (figur 2A) och silver-färgning analysen beskrivs i steg 4.2.2 (figur 2B). Stegen för kvalitetskontroll är kritiska för optimering av CARIC protokoll. Inkludera alltid kvalitetskontroller i utarbetandet...

Watch this Scientific Journal Video about Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy at JoVE.com

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

Ett detaljerat protokoll för att tillämpa den Klicka på kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategin för att identifiera proteiner som bindande för båda kodning och icke-kodande RNAs presenteras.

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Denna metod, CARIC, kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området efter transkription av genrekreation genom att tillhandahålla en omfattande folkräkning av RNA-bindande proteiner. Den största fördelen med CARIC är dess förmåga att fånga proteiner bundna till olika typer av RNA såsom mRNAs och icke-kodande RNAs. Denna metod kan användas i olika typer och organismen för att studera RNA-proteininteraktionen i arbetet.Först, kultur HeLa celler i kompletterade DMEM vid 37 grader Celsius i en fem procent CO2 atmosfär. När cellerna når cirka 80 procent sammanflödet ersätta odlingsmediet på varje maträtt med 15 milliliter av förkrigade, färskt medium. Tillsätt 15 mikroliter på 100 millimolar EU till varje rätt till en slutkoncentration på en millimolar.För experimentella och inga UV-kontrollprover tillsätt 7,5 mikroliter på 100 millimolar fyra SU till varje maträtt. Täck disken med folie och odla cellerna i 16 timmar med hjälp av tidigare villkor. Efter detta, lägga hälften av den tidigare mängden EU och / eller fyra SU till lämpliga plattor och fortsätta culturing i ytterligare två timmar.För att börja in vivo tvärbindning, ta bort odlingsmediet och tvätta varje maträtt tre gånger med PBS med fem milliliter PBS per tvätt. Ta bort rest PBS så mycket som möjligt. För de experimentella och inga fyra SU-kontrollproverna, placera disken på is med locket borttaget.Använd en UV-korslänkare för att bestråla cellerna med UV-ljus vid 365 nanometer och vid två jules per centimeter i kvadrat. För inga UV-kontrollprover, placera disken på is och skydda dem från ljus. Därefter lägger du till en milliliter av prelysbuffert till varje maträtt.Använd en gummicelllyftare för att skrapa cellerna och samla upp prelysupphängningen i ett 15 milliliterrör. Lägg till förlysbuffert till ett rör som innehåller suspensionen från två rätter som justerar den totala volymen till sex milliliter. Lägg sedan till en lika stor volym av R-lysbuffert.För cellen lysate genom en spruta med en smal nål flera gånger tills lysate är klar och homogen. Inkubera lysate vid fyra grader Celsius med mild rotation i en timme. Efter detta späda lysate i 20 volymer av utspädning buffert och dela upp den i 15 milliliter fraktioner i 15 milliliter untrafiltration rör, molekylär cutoff av 10 kilodalton.Med hjälp av en svängig hinkrotatorer snurrar du rören på 4000 gånger G och fyra grader Celsius i ca 15 minuter tills varje fraktion är koncentrerad till en volym mindre än en milliliter. Tillsätt 14 milliliter utspädningsbuffert till varje koncentrerad lysatefraktion och upprepa koncentrationsprocessen. Kombinera sedan fraktionerna och koncentrera dem till en volym på sex milliliter med hjälp av den tidigare beskrivna koncentrationsprocessen.Förbered först reaktionsmixen som den skisseras i textprotokollet. Lägg till denna reaktion mix till sex milliliter av pre-cleared lysate och blanda väl. Tillsätt 162,5 mikroliter av reducerande reagens och blanda väl.Inkubera i rumstemperatur på en orbital shaker på 800 rpm i två timmar. Efter denna släcka reaktionen genom att lägga till fem millimolar EDTA och inkubera på orbital shaker vid rumstemperatur i fem minuter. Därefter dela reaktionsblandningen mellan två 50 milliliter rör, var och en innehåller fyra volymer av pre-kyld metanol och inkubera vid negativa 30 grader Celsius i 30 minuter.Centrifugera vid 4000 gånger G och fyra grader Celsius i 15 minuter. Kassera supernatanten och tillsätt mellan en och två milliliter förkyld metanol till pelleten. Pipet upp och ner för att bryta upp pelleten se till att pelleten hamnar helt upphängd utan synliga bitar.Upprepa centrifugeringen och återfjädringsprocessen två gånger. Efter detta, dra försiktigt ut rest metanol så mycket som möjligt se till att inte störa pelleten. Tillsätt 10 milliliter reconstitutionsbuffert och pipet upp och ner för att lösa upp pelleten.Centrifugera vid 4000 gånger G och fyra grader Celsius i 10 minuter. Överför sedan supernatanten till ett nytt rör se till att samla in 20 mikroliter av provet för kvalitetskontroll. Överför det rengjorda och rekonstituerade provet till de beredda streptavidin agarosepärlorna.Inkubera vid fyra grader Celsius med skonsam rotation över natten. Snurra ner pärlorna vid 4000 gånger G i fem minuter. Överför supernatanten till ett nytt rör se till att samla in 20 mikroliter av provet för kvalitetskontroll.Tvätta pärlorna med 10 milliliter tvättbuffert A.Inkubera med skonsam rotation vid 12 rpm och vid rumstemperatur i 10 minuter. Snurra sedan ner pärlorna vid 4000 gånger G i fem minuter. Ta bort supernatanten och upprepa tvätt- och centrifugeringen en gång till.Upprepa denna tvättprocess för tvättbuffert B och tvättbuffert C enligt skiss i textprotokollet. Efter detta, tvätta pärlorna med 10 milliliter på 50 millimolar Tris hydroklorid. Snurra pärlorna ner på 4000 gånger G i fem minuter.Ta bort supernatanten och dela pärlorna jämnt mellan två 1,5 mikrocentrifugrör. För att börja undkomma de fångade RNPs, tillsätt 400 mikroliter av förberedda biotin elueringsbuffert till 400 mikroliter av tvättade, avgjorda pärlor. Inkubera på en orbital shaker vid 1500 rpm vid rumstemperatur i 20 minuter.Sedan inkubera på en orbital shaker med ett värmeblock på 1500 rpm och 65 grader Celsius i 10 minuter. Centrifugera pärlorna på 7800 gånger G i en minut och samla den eluded RNP. Tillsätt 400 mikroliter av färsk biotin elueringsbuffert till pärlorna.Upprepa inkubations- och centrifugeringsprocessen för att samla en andra elute och kombinera de två elutesna i ett enda 15 milliliterrör. Därefter lägger du till tre volymer utspädningsbuffert till de kombinerade RNP-eluterna för att minska koncentrationen av SDS. Med hjälp av ett 0,5 milliliter ultrafiltreringsrör koncentrerar du provet till ca 40 mikroliter enligt textprotokollet.Tillsätt 0,5 mikrogram per mikroliter RNase A och inkubera i 37 grader Celsius i två timmar för att frigöra RBPs från tvärbunden RNase. Samla två mikroliter av RBPs för kvalitetskontroll. När du optimerar CARIC-protokoll är kvalitetskontrollsteg kritiska.Representativ kvalitetskontroll av de klickmärkta proverna utförs via fluorescensanalyser i gel. Endast det dubbelt märkta provet visar ett starkt utstrykband vid den höga molekylvikten som representerar signalen av tvärbundna RNPs. RNP-signalen avskaffas genom att antingen de fyra SU eller EU utelämnas. Det kan också avskaffas genom matsmältning med RNase A.In vissa fall en stark utsmetad band observeras i no four SU kontrollprovet.Detta band representerar den märkta uncross-länkade RNase som kommer att försämras under värme innaturation i de flesta fall. Kvalitetskontroll av affinitetsundersökningen dataficiency bedöms genom Western blot analys som visar biotin signaler i proverna både före pulldown och efter pulldown. En silverfärgningsanalys av de fångade RBPs visar att för HeLa-celler är den allmänna totala infångningseffektiviteten mellan 0,05 och 0,1 procent av insatsproteiner.Medan du försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att RNase är känsliga för ribonucéer. Håll försöksmiljön så ren som möjligt för att minska degredationen av RNase. Efter detta förfarande kan protein almake identifiering med hjälp av masspektrometri förformas för att avslöja de järn-begränsning proteiner.Efter dess utveckling kommer CARIC-tekniken att bana väg för en mer omfattande förståelse av postranskription OT-förordningen i arbetet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd