Name: preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en fælles ph.d.-stipendium til IB fra INRA plantebiologi og avl Division og Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Vi ønsker også at anerkende projektets Musikvogn ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) for antistoffer mod LHCP og Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) for antistoffer mod KARI.

1. fremstilling af buffere, stamopløsninger og forløb
<ol><li>Forberede følgende stock løsninger, der kan gemmes til 6 måneder ved 4 ° C.<ol>
<li>Forberede 1 L Tricine buffer (1 M, pH 8.4) og Tricine buffer (1 M, pH 7,6). Justere pH ved at tilføje KOH pellets.</li>
		<li>Forberede 1 L ethylendiamintetra syre (EDTA, 0,5 M, pH 8) og 3-(N-morpholino) propan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (MOPPER) buffer (1 M, pH 7,8). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets.</li>
		<li>Forberede 50 mL af MgCl2 (1 M).</li>
		<li>Forberede 50 mL af protease inhibitorer løsninger: phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF oprettet i isopropanol, 100 mM), benzamidine-hydrochlorid hydrat (100 mM), og ε-amino capronsyre (50 mM). Bemærk: Mens PMSF og amino capronsyre er stabile i løsning for måneder ved 4 ° C, benzamidine løsning skal opbevares ved-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede følgende løsninger dagen før eksperimentet og gemme alle løsninger ved 4 ° C.<ol>
<li>Forbered 4 L slibning medium pH 8.4 indeholdende Tricine-KOH (20 mM, pH 8.4), sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) og NaHCO3 (10 mM). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets. Tilføje bovint serumalbumin (BSA) på 0,1% (w/v) umiddelbart før brugen og bland godt.</li>
		<li>Forberede 500 mL vask medium (2 x) pH 7,6 indeholdende Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) og EDTA (2,5 mM). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets. Fortynd sådan løsning efter forberedelse af Percoll gradient løsning at opnå vask medium (1 x).</li>
		<li>Forberede 200 mL af Percoll gradient løsning for grønkorn rensning ved at blande Percoll med vask medium (2 x) på en tilsvarende mængde til at få en endelig løsning på 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitol.</li>
		<li>Forberede 50 mL af saccharose løsninger for grønkorn fraktionering af blande MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) og saccharose (0,3 M, 0,6 M og 0,93 M) i forskellige koncentrationer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede følgende forløb og buffere før du starter eksperimentet.<ol>
<li>Forberede seks rør af Percoll forløb (hver indeholdende 30 mL i en 50% Percoll / 0,4 M sorbitol) ved centrifugering ved 38.700 x g i 55 min. ved 4 ° C. Holde bremsen ud for at forhindre blanding af gradienter. Efter centrifugering, gemme rør indeholdende de preformed forløb i et koldt rum indtil brug.</li>
		<li>Forberede fire rør af saccharose forløb, med hvert farveforløb, dannet af tre følgende saccharose lag: 3 mL af 0.93 M, 2,5 mL 0,6 M og 2 mL 0,3 M saccharose. Omhyggeligt overlay hvert lag, ved hjælp af en peristaltisk pumpe starter med 0,93 M i bunden og efterbehandling med 0,3 M på toppen.</li>
		<li>Forberede grønkorn lysis indeholdende MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, oprettet i isopropanol), benzamidine-hydrochlorid hydrat (1 mM) og ε-amino capronsyre (0,5 mM) 50 mL af hypotonic medium. Gemme bufferen på køl indtil brug.</li>
		<li>Forberede 50 mL af membran vask buffer indeholdende MOPPER (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), benzamidine-hydrochlorid hydrat (1 mM) og ε-amino capronsyre (0,5 mM). Gemme bufferen på køl indtil brug.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vækst og høst af Arabidopsis blade
<ol><li>For vækst i Arabidopsis planter, forberede 4 store plast pander (en total overflade på 0,5 til 1 m2) af Arabidopsis planter ved såning 30 mg af frø i hver gryde. Vokse Arabidopsis planter i 5 uger ved 12-h lys cyklus ved 23 ° C (dag) / 18 ° C (nat) med en lysintensitet af 150 μM m-2 s-1.</li>
	<li>Der inkuberes planter i et mørkt og koldt værelse (4 ° C) natten før eksperimentet (til at reducere mængden af stivelse granulat i grønkornene).</li>
	<li>Pre vejer et 1 L bæger og derefter placere den på is før høst af blad materiale.</li>
	<li>Høste Arabidopsis blade ved at undgå jord (kompost). Re vejer bægerglasset og optage væv vægt. Bemærk: 400-500 g blad materiale forventes fra fire pander.</li>
	<li>Homogeniseres blade i et koldt rum med 2 L slibning buffer (tilføje BSA før brug) tre gange / 2 s hver gang, i en blender på høj hastighed.</li>
	<li>Filtrer homogenatet i et koldt værelse med 4 lag af musselin og et lag af nylon blutex. Forsigtigt klemme homogenatet blade indeni musselin nylon blutex hen til uddrag al væsken.</li>
	<li>Genskab de resterende væv i blenderen kop til en anden ekstraktion. Gentag trin 2.5 og 2.6 bruger 2 L slibning medium og nye 4-5 lag af musselin (i et koldt rum).</li>
</ol>3. rensning af rå grønkorn ved hjælp af differentieret centrifugering
<ol><li>Lige så distribuere rå celle ekstrakt i seks 500 mL flasker og Placer flasker på køl inden centrifugering. Der centrifugeres i 2 min så snart den maksimale hastighed (2,070 x g) er nået (maksimal acceleration og bremse på 4 ° C).</li>
	<li>Forsigtigt supernatanten.</li>
	<li>Opsug den resterende supernatanten ved hjælp af en vandpumpe og holde de piller, der indeholder koncentrerede rå grønkorn på is.</li>
	<li>Forsigtigt resuspend pellets ved at tilføje en minimal mængde af vask medium (1 x) (endelige mængden af kombinerede grønkorn suspensioner = 36 mL) ved hjælp af et paintbrush eller en buet plastik spatel. Bruge en 10 mL pipette til tilsættes 3 mL vask medium i hver flaske. Bemærk: Brug ikke pipette med meget fine tips til at undgå brud på grønkorn. Alternativt, skæres den blå spids af en pipette med et barberblad til at generere et større hul.</li>
	<li>Indsamle de resuspenderede kloroplaster i ét rør ved hjælp af en 10 mL pipette. Forsigtigt blandes ved at vende røret for at opnå en homogen suspension før pålæsningen på Percoll forløb.</li>
</ol>4. rensning af intakt grønkorn på kontinuerlig Percoll Gradient
<ol><li>Langsomt hæld 6 mL grønkorn suspension oven på hver af seks Percoll forløb ved hjælp af en 10 mL pipette til at undgå brud på grønkorn.</li>
	<li>Der centrifugeres forløb i 10 min på 13,300 x g, 4 ° C ved hjælp af en svinge spanden rotor. Bemærk: Accelerationen skal være langsom, og bremsen skal afbrydes (bremse off eller langsom deceleration) for at undgå blanding af Percoll forløb.</li>
	<li>Opsug den øverste fase, der indeholder brudte grønkorn og intakt mitokondrier ved hjælp af en vandpumpe, og derefter hente intakt grønkorn til stede i nederst fase (den brede mørke-grøn band) med en 10 mL pipette. Vær omhyggelig med ikke at Aspirér kerner og celle debris (findes i bunden af røret) med de intakte grønkorn (figur 2A).</li>
	<li>Fortyndes 3-4-fold intakt grønkorn suspension med vask buffer (1 x). Der centrifugeres i 2 min så snart den maksimale hastighed (2,070 x g, 4 ° C) er nået (maksimal acceleration og bremse på).</li>
	<li>Omhyggeligt supernatanten.</li>
	<li>Helt Opsug den resterende supernatanten med en vandpumpe og holde pellet af koncentreret intakt grønkorn på is.</li>
	<li>Før grønkorn lysis, holde en alikvot af intakt grønkorn brøkdel i ca. 1 mL vask medium (1 x) for yderligere analyser ved hjælp af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og western blotting. Holde en lille alikvot af disse intakt grønkorn til bestemmelse af proteinkoncentration. Gemme intakt grønkorn brøkdel i flydende nitrogen til yderligere forsøg.</li>
</ol>5. lysering af intakt grønkorn ved hjælp af en Hypotonic Buffer og rensning af grønkorn sub rum på diskontinuert saccharose forløb
<ol><li>Lyse renset intakt grønkornene af resuspending pellet i hypotonic medium, der indeholder proteasehæmmere (endelige volumen ikke bør overstige 12 mL). Bemærk: Fra dette trin, brugen af pipette med fine tips (blå tips) er muligt da handelsformer af kloroplaster er ikke mere væsentlige (pipettering grønkorn op og ned så længe pellet ikke er helt genopslemmes). Arabidopsis kloroplaster er meget skrøbeligt (i forhold til ært grønkorn, for eksempel) og deres lysis er næsten øjeblikkelig efter inkubation i hypotonic medium.</li>
	<li>Langsomt indlæse 3 mL lysed grønkornene på toppen af hver præfabrikerede saccharose forløb ved hjælp af en peristaltisk pumpe.</li>
	<li>Ultracentrifuge forløb for 1 h (70.000 x g, 4 ° C). Balance par af rørene ved hjælp hypotonic medium buffer inden centrifugering.</li>
	<li>Omhyggeligt genoprette de opløselige stromale proteiner af pipettering den øverste fase af gradient (3 mL fra hver gradient) (figur 2B). Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme stroma i flydende nitrogen til yderligere forsøg.</li>
	<li>Opsug den resterende øverste fase af hvert forløb op til gule bandet ved hjælp af en vandpumpe.</li>
	<li>Hent den gule band (konvolutten) med en pipette (ca. 1 mL fra hver forløb). Pool konvolutter i et rør.</li>
	<li>Fjern de resterende fase af hvert forløb op til tylakoid pellet ved hjælp af en vandpumpe.</li>
</ol>6. vask og koncentration af tylakoid og kuvert membran systemer
<ol><li>Resuspend tylakoid pellets (grøn pellets) i en mindstemængde (2 mL) af membran vask buffer (1 x) (med proteasehæmmere).</li>
	<li>Fortynd kuvert og tylakoid suspensionerne 3-4-fold i membranen vask medium (justere lydstyrken til 10 mL) og ultracentrifuge for 1 h (110.000 x g, 4 ° C). Balance par rør ved hjælp af membran vask buffer inden centrifugering.</li>
	<li>Omhyggeligt Aspirér analysere ved hjælp af en vandpumpe.</li>
	<li>Tilføje ca 100 µL af membran vask buffer (med proteasehæmmere) til kuvert pellet. Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme renset kuvert membran forberedelse i flydende kvælstof.</li>
	<li>Resuspend tylakoiderne pellet i 3 mL af membran vask buffer (med proteasehæmmere). Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme tylakoid membran brøkdel i flydende kvælstof.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+theory+for+organelle+origins.">Endosymbiotic theory for organelle origins.</a> Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).</li><li>Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+evolution.">Plastid evolution.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).</li><li>Linka, N., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+metabolite+transporters+in+plants.">Intracellular metabolite transporters in plants.</a> Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).</li><li>Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+envelope+membranes:+a+dynamic+interface+between+plastids+and+the+cytosol.">Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol.</a> Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Agrawal, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics:+collaborating+for+optimal+cell+function.">Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function.</a> Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).</li><li>Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[40]+Electrophoretic+analysis+of+chloroplast+proteins.">[40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins.</a> Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+intact+chloroplasts+from+Arabidopsis+and+spinach+leaves+by+isopycnic+centrifugation.">Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2008).</li><li>Ferro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT_CHLORO,+a+comprehensive+chloroplast+proteome+database+with+subplastidial+localization+and+curated+information+on+envelope+proteins.">AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).</li><li>Seigneurin-Berny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMA1,+a+new+Cu-ATPase+of+the+chloroplast+envelope,+is+essential+for+growth+under+adverse+light+conditions.">HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).</li><li>Vallon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+redistribution+of+cytochrome+b6/f+complexes+along+thylakoid+membranes+upon+state+transitions.">Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).</li><li>Douce, R. J. J., Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+chloroplast.">Purification of the chloroplast.</a> Methods in Chloroplast Molecular Biology. , 239-256 (1982).</li><li>Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+the+isolation+of+intact+chloroplasts+of+high+photosynthetic+capacity.">An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).</li><li>Kunst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+physiologically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis.">Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Protein+Import+into+Chloroplasts+Isolated+from+Stressed+Plants.">Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll-purified+and+photosynthetically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).</li><li>Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+chloroplasts+and+their+sub-organellar+compartments.">Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments.</a> Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).</li><li>Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , (1990).</li><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+membrane+fractions+enriched+in+outer+and+inner+envelope+membranes+from+spinach+chloroplasts.+II.+Biochemical+characterization.">Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization.</a> Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).</li><li>Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+and+protein-kinase+activity+in+isolated+envelopes+of+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 166 (3), 394-400 (1985).</li><li>Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Membrane+Fractions+(Envelope,+Thylakoids,+Grana,+and+Stroma+Lamellae)+from+Arabidopsis+Chloroplasts+for+Quantitative+Proteomic+Investigations+and+Other+Studies.">Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).</li><li>Tomizioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+thylakoid+sub-compartments+using+a+mass+spectrometry-based+approach.">Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).</li><li>Spicher, L., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+of+plastoglobules+(plastid+lipid+droplets)+in+vitamin+K1+and+E+metabolism.">Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne artikel har til formål at detaljer trin for trin-protokol, der bruges til at rense grønkorn (og deres sub rum) fra Arabidopsis thaliana. Siden tilgængelighed af dens komplet genomet sekvens næsten to årtier siden, og store samlinger af indsættelse mutanter stilles til rådighed for Fællesskabet, er Arabidopsis nu almindeligt accepteret som en model plante. Men mens denne plante var perfekt tilpasset til genetiske metoder, plante forskere nødvendige for at tilpasse biokemiske og fysiologiske værktøjer til denne nye model. Protokoller gør det muligt for at rense photosynthetically aktive grønkorn fra bladene af veletablerede biokemiske modeller som spinat12 eller ært13 således skulle tilpasses. Den første metode beskriver rensning af Arabidopsis grønkorn blev offentliggjort i 199814, lige før udgivelsen af Arabidopsis genomet sekvens. Flere år senere, enkle metoder til isolering af Arabidopsis grønkorn kompatibel med undersøgelser med henblik på at analysere in vitro- import af proteiner i renset organeller blev gjort tilgængelige15,16. Men disse metoder ikke tillod for at kombinere høj renhed og bevarelse af fotosyntetiske aktivitet renset grønkornene. For nylig blev17, en hurtig metode etableret, som bygger på anvendelse af Percoll forløb, og gør det muligt for at bevare næsten 90% af fotosyntese målt i Arabidopsis begynder bladene.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for at rense Arabidopsis grønkorn på et fremragende niveau af renhed. Faktisk, immunologiske påvisning af forurenende stoffer fra andre celle rum viste, at de renset organeller er blottet for mitokondrie og plasma membran markører9,10. Denne protokol blev også effektivt at rense grønkorn fra flere Arabidopsis økotyper18, som Columbia (Col) eller Wassilewskija (WS), dvs., de økotyper, der blev brugt til genom eller udtrykt sequence tags (interesser) sekventering projekter, men også til at generere T-DNA indsættelse mutanter i Arabidopsis. Med andre ord, når proteomics undersøgelser skal udføres, er i denne protokol kompatibel med disse to reference økotyper fra Arabidopsis. Endelig er udbyttet af grønkorn ved hjælp af denne protokol magen til det opnås, når start fra spinat eller ært blade (dvs. 3%, målt fra Percoll-renset chlorplasttransitpeptidsekvensen i forhold til samlet indhold af klorofyl klorofyl beløb i starter blade). Med hensyn til proteiner er udbyttet tæt på 50 mg af grønkorn proteiner, når organeller er renset fra 500 g af 5-uge-forhenværende Arabidopsis blade.
At nå frem til sådan en god udbytte (og grønkorn integritet), man bør dog være særlig opmærksom flere trin, når du bruger denne protokol. Grønkorn i Arabidopsis er en yderst skrøbelig struktur (dette ikke er tilfældet for pea grønkorn, for eksempel). Særlig opmærksomhed er dermed nødvendigt for at undgå store brud på organeller under rensningen. Antallet og størrelsen af stivelse granulat i kloroplaster er afgørende for forberedelsen af intakt grønkorn. Faktisk, grønkorn indeholdende store stivelse korn generelt bliver brudt under indledende differentieret centrifugations skridt med henblik på at koncentrere rå grønkorn fraktioner12. Derfor, bør planterne opbevares natten over i et mørkt og koldt værelse (4 ° C) før forsøget, at reducere mængden af stivelse.
Nye brugere af denne protokol kan blive fristet til at starte fra større mængder af blad materiale (store rosetter fra gamle Arabidopsis anlæg med større blade) forsøger at fremme genanvendelsen af renset grønkorn. Men i vores hænder, startende fra unge blade (5-uge-forhenværende) er det bedste kompromis at kombinere udbytte, renhed og integriteten af de oprensede organeller. Faktisk, for gamle blade er stærkt beriget i phenolforbindelser, der blev vist sig at have en negativ indvirkning på grønkorn integritet19.
Endelig, indledende ekstraktionstrinet (slibning af væv) er en anden afgørende skridt. Blending processen skal være begrænset til par sekunder. Som anført ovenfor, kunne nye brugere fristes til at bruge længere blanding, således forventer at kraftigt forbedre udbyttet af renset organeller. Hvis længere blanding effektivt frigiver mere materiale fra blade, synes det imidlertid at andelen af knækkede grønkorn hurtigt øger i rå celle ekstrakt. På grund af denne høj forholdet mellem brudt til intakt kloroplaster i medium, yderligere rensning trin (adskillelse på Percoll forløb) påvirkes kraftigt og udbyttet af rensning er uventet lavere.
Tilgængeligheden af specifikke protokoller til at rense organeller har tilladt en serie af høj overførselshastighed proteomics-baserede eksperimenter skal gennemføres på grønkorn prøver. Disse data blev stillet til rådighed i flere offentlige databaser6, hvilket giver at biologer i feltet en nøjagtig subcellulært (og subplastidial) lokalisering for mange grønkorn proteiner. Dette var især tilfældet for kuvert proteiner hvis identitet og placering forblev for det meste ukendte før disse analyser, da kuverten membraner repræsenterer en mindre grønkorn komponent (1-2% af proteinerne, grønkorn) mens du spiller en nøglerolle i grønkornets stofskifte og Biogenese5,20. Ved hjælp af protokollen beskrevet her, vi for nylig analyseret sammensætningen af de tre vigtigste grønkorn rum fra Arabidopsis (dvs. stroma, tylakoiderne og kuvert membran system)9. Baseret på en semi-kvantitative proteomics tilgang (spektrale tælle), har vi kunnet vurdere partitionering af hundredvis af proteiner i disse tre grønkorn rum.
Mens denne protokol giver mulighed for at rense de tre vigtigste rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen fra Arabidopsis, er det også muligt at skelne yderligere sub rum i chlorplasttransitpeptidsekvensen. Faktisk, kuvert membran system er lavet af indre og de ydre konvolut membraner (figur 1). Til bedste af vores viden er en metode til at rense indre og ydre konvolut membraner fra Arabidopsis grønkorn imidlertid fastsættes. Indre og ydre konvolut membraner kan blive renset fra spinat21 eller ært22 grønkorn. Den største begrænsning af Arabidopsis resultater for det meste fra de begrænsende beløb for at starte materiale. Start fra 500 g Arabidopsis blade (som allerede kræver 1 m2 overflade i et vækst kammer) giver mulighed for rensning kun 100 µg kuvert proteiner. På den anden side er det let at starte med, 5-10 kg af spinat blade fra markedet, at rense store mængder af grønkorn8 og ender med et udbytte på 3 til 10 mg af kuvert proteiner fra dette materiale.
Det samme gælder for tylakoid sub rum. Faktisk tylakoiderne er lavet af lys membran vesikler (lamellae) og tætte strukturer (grana) (figur 1). Særlige protokoller er tilgængelige til at skelne mellem disse to rum i Arabidopsis23,24. Igen, baseret på en kvantitativ proteomics analyser, vi for nylig fortegnelserne proteiner til stede i disse to sub rum24. Disse tilgange, sammen med en grundig undersøgelse af litteraturen, tilladt validering, eller foreslår hypoteser for subplastidial placeringen af hundredvis af tylakoid proteiner. Det er dog vigtigt at bemærke, at yderligere membran microdomains er til stede på de buede kanter af tylakoiderne. Disse lipoprotein sub rum, eller plastoglobules, er permanent tilkoblet tylakoid membraner og indeholder et bestemt sæt af proteiner25. Ved hjælp af denne protokol, er det således ikke muligt at skelne disse specifikke proteiner fra andre tylakoid komponenter.
Nogle ægte (kendte) kuvert, stroma eller tylakoid komponenter mangler stadig fra listerne over registrerede proteiner. Samt målrettede biokemiske og immunologiske analyser, vil den løbende forbedring af MS følsomhed være til stor hjælp at gense grønkorn indhold mod et komplet repertoire af sammensætningen af dens forskellige sub rum.

Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. De hidrører fra en cyanobakteriel forfader, der har undergået en endosymbiosis og til sidst udviklede sig som en organelle under udvikling1,2. Disse organeller indeholder tre hovedrum (figur 1). Kuvert system består af en indre og en ydre membraner omgiver organelle. Denne dobbelt membran system indeholder forskellige enzymer involveret i metaboliseringen af lipider og pigmenter og er for det meste afsat til kontrol af kommunikationen mellem plastids og cytosol. Det indeholder forskellige transportsystemer, der tillader import af nuklear-kodet proteiner, og udvekslingen af ioner og metabolitter mellem cytosol og chlorplasttransitpeptidsekvensen dermed regulerer væsentlige metaboliske funktioner af anlægget celle3,4 . Stroma, den opløselige fase af grønkorn, indeholder enzymer i Calvins cyklus (CO2 assimilation), syntese af forskellige metabolitter, herunder aminosyrer, vitaminer og plastid transskription og translation machineries. Tylakoid membran er et almindeligt organiseret indre membran netværk hvor den lette fase af fotosyntesen foregår. Dermed, er kloroplaster det sted, hvor væsentlige stofskifteveje forekomme5.
For at dechifrere nye reguleringsmekanismer, der styrer grønkorn dynamics og fysiologi, er definere de sub-plastidial lokalisering af grønkorn proteiner derfor kritisk at støtte målrettede undersøgelser med henblik på at bedre at forstå proteiner funktioner i model organismer6. For at få adgang til den ægte subplastidial lokalisering af disse proteiner, er det således vigtigt at starte fra yderst rene subplastidial fraktioner (kuvert membraner, stroma og tylakoiderne). I denne forbindelse formålet med denne protokol er at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade ved hjælp af differentieret centrifugations og kontinuerlig Percoll forløb, og at fractionate dem ved hjælp af diskontinuert saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Metoden beskrevet her indeholder også vejledning til vurdering af renheden af renset sub-organellar fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Denne protokol er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting og for yderligere analyse af renset fraktioner ved hjælp af massespektrometri (MS)-baseret proteom undersøgelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6977.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#949;-amino caproic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6979.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9286.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>USB</td>
			<td>US12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel staining medium</td>
			<td>Clini-sciences</td>
			<td>GEN-QC-STAIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>528151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fat-free milk powder</td>
			<td>R&#233;gilait</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H/1150/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH pellets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.05012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>480507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMA1 antibody</td>
			<td></td>
			<td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KARI antibody</td>
			<td></td>
			<td>Ferro et al, 2010</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCP antibody</td>
			<td></td>
			<td>Vallon et al, 1991</td>
			<td>Used at a 1:25,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-coumaric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol (3-aminophalhydrazin)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO).</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large (30 cm &#215; 45 cm) plastic cases</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>162135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. thaliana seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Around 30 mg of seeds for a whole case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost &#34;Floragard&#34;</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>16311770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth rooms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12-h light cycle, set at 23&#176;C (day) / 18&#176;C (night) with a light intensity of 150 &#956;mol/m2/s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muslin or cheesecloth</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70116</td>
			<td>80-cm-large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon blutex 50 &#956;m aperture</td>
			<td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td>
			<td></td>
			<td>50 &#956;m aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity</td>
			<td>Waring Blender</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 &#215; 500-mL plastic bottles)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JA-20 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-20 (6 &#215; 50 mL polypropylene tubes)</td>
			<td>Sorvall instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 &#215; 50 mL polycarbonate tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor (6 &#215; 13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge (Beckman L7)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman JSE-06D18)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5415D or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>BA85, Schleicher and Schuell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>3MM, Whatman, Maidstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System for protein transfer to nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics

Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. Sådanne plastids opfylde mange livsvigtige funktioner, som assimilation af kulstof, svovl og kvælstof samt syntese af væsentlige metabolitter. Disse organeller består af de følgende tre centrale sub rum. Kuvert, karakteriseret ved to membraner, omgiver organelle og styrer kommunikationen af plastid med andre celle rum. Stroma er den opløselige fase af chlorplasttransitpeptidsekvensen og de vigtigste site hvor kuldioxid er omdannet til kulhydrater. Tylakoid membran er den indre membran netværk bestående af grana (flad komprimeret sække) og lameller (mindre tætte strukturer), hvor iltdannende fotosyntese finder sted. Denne protokol beskriver trin for trin-procedurer, der kræves til rensning, ved hjælp af differentieret centrifugations og Percoll farveforløb, af intakt grønkorn fra Arabidopsisog deres fraktionering, ved hjælp af saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Denne protokol giver også anvisninger på hvordan man skal vurdere renhedsgraden af disse fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Metoden beskrevet her er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting, men også subcellulært og subplastidial proteomics og andre undersøgelser.

Successive trin af proceduren resulterer i renset grønkorn og deres sub rum er genoptaget i figur 2. Percoll gradient (figur 2A) kan skelne intakt grønkorn fra brudt grønkorn og mitokondrier (toppen af gradient) eller kerner og celle debris (bunden af gradient). Efter ruptur af Percoll-renset organeller takket være en osmotisk chok, er de deraf følgende fraktioner adskilt på en saccharose gradient (figur 2B). Stroma (opløselige del af chlorplasttransitpeptidsekvensen) flyder på overfladen af saccharose gradient. Lys kuvert membran vesikler er inddrevet som en diskret gule band på 0,6/0,93 M saccharose interface. De tungeste tylakoid membraner vesikler er koncentreret i bunden af røret. Efter gendannelse, vask og koncentrationen af to membran fraktioner, proteiner er kvantificeret og sammensætningen af alle fire fraktioner er analyseret på en SDS-PAGE (figur 2 c). Banerne er indlæst på grundlag af lige protein (20 µg for hver renset fraktion). Vel vidende at grønkorn indeholder kun 1% af kuvert proteiner og 50% af proteiner fra stroma eller tylakoiderne, denne tendens til at overvurdere krydskontaminering af renset kuvert præparater med andre grønkorn sub rum. Men denne metode giver mulighed for at opdage små mængder af proteiner cross-forurenende kuvert brøkdel. Markører fra hvert rum (dvs., rigelige proteiner) er meget hjælpsom med at evaluere krydskontaminering af fraktioner. Faktisk forventes tylakoid og kuvert membran fraktioner at indeholde meget lave mængder af store subunit af RuBisCO (RBCL), den mest rigelige protein fra stroma (50 kDa). Brudt grønkorn kan let skelnes fra intakt grønkorn på grund af tabet af denne stromale protein8. Lyset høst komplekse proteiner (LHCP) er 25-kDa rigelige tylakoid komponenter, der bør næppe (mindre end 3%) forurene kuvert membraner9. Endelig, fosfat-Triosefosfatisomerase-fosfat translocator (TPT) er en 30-kDa protein, der er kun synlige i renset kuvert fraktion på grund af sin stærke berigelse (dvs. 50 til 100 x) i kuvert-fraktionen i forhold til hele grønkorn ekstrakter. Ved hjælp af metoden beskrevet her, grønkorn sub rum er generelt dårligt cross-forurenet som bekræftet ved hjælp af western-skamplet analyser (figur 2D) afhængige af antistoffer rettet mod kendte markører for alle tre sub rum: den opløselige ketol syre reductoisomerase (KARI) fra stroma, grønkorn kuvert kobber ATPase (HMA1), og lyset høst komplekse proteiner (LHCP) fra tylakoid membraner. Krydskontaminering af tre sub rum kan kvantificeres ved hjælp af både immunoblotting og en masse massespektrometri analyser9. Mens stroma ikke er normalt forurenet af kuvert eller tylakoid fraktioner, renset kuvert fraktioner indeholder 3% af tylakoid proteiner og op til 10% af proteiner fra stroma. Proteiner fra stroma forurene dårligt tylakoid membraner (mindre end 1%) men tylakoiderne indeholder op til 3% af kuvert Membranproteiner. Mere end at have en afgørende rolle i at identificere ægte subplastidial placeringen af grønkorn proteiner, den nuværende metode således også begrænser fejlagtige konklusioner om subplastidial lokalisering af proteiner som følge af cross forureninger.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg"> Figur 1: repræsentative ordningen grønkorn sub rum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg"> Figur 2: oprensning af intakte grønkorn og deres tre vigtigste sub rum ved hjælp af Percoll og saccharose gradienter. A. Percoll graduering giver mulighed for adskillelse af brudt og intakt grønkorn. B. saccharose graduering giver mulighed for adskillelse af stroma, kuvert og tylakoid fraktioner. C. repræsentant SDS-PAGE af proteiner fra intakt grønkorn og deres tre vigtigste sub rum gør det muligt for at visualisere rigelige markører fra hvert sub rum. Hver bane indeholder 10 µg af proteiner. Molekylær vægt markører: RBCL, store subunit af RuBisCO (markør for stroma); TPT, Triosefosfatisomerase-fosfat-phosphat translocator (markør for konvolutten); LHCP, lys, høst komplekse proteiner (markør for tylakoid). D. Western-skamplet eksperimenter giver mulighed for at opdage specifikke markører (ved hjælp af specifikke antistoffer) fra hver sub rum: grønkorn kuvert kobber ATPase HMA110, lyset høst komplekse proteiner LHCP fra tylakoid membraner11, og ketol-syre reductoisomerase KARI fra stroma9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Her, vi beskriver en metode til at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade og deres tre vigtigste sub rum (kuvert, stroma og tylakoiderne), ved hjælp af en kombination af differentieret centrifugations, kontinuerlig Percoll forløb, og diskontinuerlig saccharose forløb. Metoden er værdifuld for subplastidial og subcellulært lokalisering af proteiner af immunoblotting og proteomics.

Forberedelse af grønkorn sub rum fra Arabidopsis til analyse af Protein lokalisering af Immunoblotting eller Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for at skelne proteiner af lignende aktiviteter, der har forskellige roller, afhængigt af lokalisering i kuvert, stroma, eller thylakoid membraner. Generelt vil personer nye til denne metode kæmpe, fordi de vil bruge planter, der er for gamle, blend bladet for længe, eller vil ikke være forsigtig nok, når re-suspension pellets af intakt, men skrøbelig, kloroplast. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da det er vanskeligt at lære indlæsning eller genindvinding af fraktion fra percoll eller i saccharosegradienttrin.På grund af risikoen for blanding af gradienter og dermed krydsforurenende de forskellige chloroplast delfraktioner. Demonstration af proceduren vil være af Imen Bouchnak, en ph.d.-studerende fra vores laboratorium og Lucas Moyet, en indendørs ingeniør. Til at begynde, dyrke arabidopsis planter i fem uger med en 12 timers lyscyklus ved 23 grader Celsius i dag og 18 grader Celsius om natten, med en lysintensitet på 150 micromoler per kvadratmeter per sekund.Den næste dag, pre-vejer en fem liters bægerglas og derefter placere den på is. Høst arabidopsis blade, og sørg for at undgå at plukke snavs. Afvej bægerglasset igen, og journal vævets vægt.Overfør de høstede blade til et koldt rum. Læg bladene i en blender, der indeholder to liter slibebuffer, og homogeniser dem ved at blande ved høj hastighed tre gange i en varighed på to sekunder hver gang. Placer fire lag musselin og et lag nylon blå tex i en si, og dette for at filtrere homogenate.Pres forsigtigt de blandede blade inde i musselin og blå tex for at udtrække al væsken. Genvind det resterende væv i blenderkoppen, og gentag homogeniseringsprocessen ved hjælp af frisk slibebuffer. Brug fire til fem lag ny musselin til at filtrere denne nye homogenat i et nyt bægerglas som tidligere beskrevet.Råcelleekstraktet fordeles ligeligt i seks 500 milliliterflasker. Læg flaskerne på is. Centrifuge de kølede flasker ved 2070 G og fire grader Celsius i to minutter.Derefter skal supernatanten forsigtigt kasseres. Brug en vandpumpe til at aspirere eventuelle resterende supernatant og holde pellets, som indeholder koncentreret rå kloroplast, på is. Ved hjælp af en 10 milliliter pipette tilsættes tre milliliter vaskemedium til hver flaske, og sørg for ikke at bruge fine pipettespidser for at undgå at bryde kloroplasterne.Brug derefter en pensel eller buet plast spatel til forsigtigt at re-suspendere pellets. Ved hjælp af en 10 milliliter pipette opsamler de re-suspenderede kloroplaster i et enkelt rør. Inverter forsigtigt røret for at opnå en homogen chloroplastaffjedring.Til at begynde, bruge en 10 millileter pipette til langsomt at indlæse seks milliliter af kloroplast suspension på toppen af hver af de seks forberedte percoll gradienter. Ved hjælp af en svingende spand rotor, centrifuge gradient ved 13, 300 G og fire grader Celsius i 10 minutter. Brug en vandpumpe til at aspirere den øverste fase, som indeholder brudt kloroplaster og intakt mitokondrier.Brug derefter en 10 milliliter pipette til at hente intakte kloroplaster til stede i den nederste fase, passe på ikke at aspirere kerner og cellerester fundet i bunden af røret sammen med de intakte kloroplaster. Den intakte chloroplastaffjedring fortyndes tre til fire gange med vaskemedium. Der opbevares ca. 10 milliliter en aliquot intakt chloroplastfraktion til yderligere analyse ved SDS-Page og Western blotting.Centrifuge ved 2070 G og fire grader Celsius i to minutter. Derefter skal supernatanten forsigtigt kasseres. Brug en vandpumpe til at aspirere eventuelle resterende supernatant og holde pellet, som indeholder koncentreret rå kloroplaster, på is.For at lyse de rensede intakte kloroplaster, re-suspendere pellet i hypotonisk medium, der indeholder proteasehæmmere. De re-ophængte kloroplaster overføres til et 10 milliliter falkerør. Forbered saccharosegradienten som beskrevet i tekstprotokollen.Ved hjælp af en peristaltisk pumpe indlæses der langsomt tre milliliter af de lysede kloroplaster oven på hver af de præformede saccharosegradienter. Brug hypotonisk medium buffer til at afbalancere par rør, og derefter ultra-centrifuge gradienten ved 70, 000 G og fire grader Celsius i en time. Tag en aliquot af de opløselige stromale proteiner, der skal anvendes ved bestemmelsen af proteinkoncentrationen.Brug derefter en vandpumpe til at aspirere den resterende øvre fase af gradienten op til det gule bånd. Brug en pipette til at hente det gule bånd, som er konvolutten. Træk konvolutterne ind i et rør.Fjern derefter den resterende fase af gradienten op til thylakoid pellet. Re-suspendere thylakoid pellets i membran vask buffer med protease hæmmere. Fortynde thylakoid suspension og kuvert tre til fire gange med vask medium, justere det endelige volumen til 10 milliliter.Balance par rør med membran vask buffer og ultra-centrifuge dem ved 110, 000 G og fire grader Celsius i en time. Derefter skal du bruge en vandpumpe til omhyggeligt at aspirere supernatanten. Der tilsættes ca. 100 mikroliter membranvaskebuffer til konvolutpellet.Derefter aspirere supernatant fra thylakoid rør. Re-suspendere thylakoid pellets i tre milliliter membran vask buffer. De tre rensede underrum opbevares i flydende nitrogen til brug ved yderligere forsøg.Efter membranfraktionerne er genvundet, vasket og koncentreret, bruges SDS-Page til at kvantificere proteinerne og analysere sammensætningen af alle fire fraktioner. Den mest rigelige protein fra stroma er RBCL, og repræsentative resultater viser det forventede resultat, at meget lidt af den store underenhed af dette protein er indeholdt thylakoid og kuvert fraktioner. Den lette høst komplekse proteiner er rigelige thylakoid komponenter, der bør næppe forurene kuvertmembraner.Endelig er fosfatttriosephosphat translocator kun synlig i den rensede kuvertfraktion på grund af sin stærke berigelse i kuvertfraktionen sammenlignet med hele kloroplastekstrakterne. Krydskontaminering af de tre underrum, den opløselige ketol-syre reductoisomerase fra stroma, chloroplast kuvert kobber ATPase, og lyset høst komplekse proteiner fra thylakoid membraner kan kvantificeres ved hjælp af både immunoblotting og massespektrometri analyse. Mens stroma er normalt ikke forurenet med kuvert eller thylakoid fraktioner, de rensede kuvert fraktioner indeholder 3% thylakoid proteiner og op til 10% af proteiner fra stroma.Thylakoiderne er dårligt forurenet med proteiner fra stroma, men indeholder op til 3% af kuvert membran proteiner. Kloroplaster udføre mange afgørende funktioner såsom assimilering af kulstof, svovl, og kvælstof, samt syntese af væsentlige metabolitter. For at dechifrere nye reguleringsmekanismer, der styrer kloroplastfysiologien, er det afgørende for super målrettede undersøgelser at definere surplasty-lokaliseringen af chlorplastproteiner.Kloroplaster indeholder flere underrum. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i kloroplastfeltet, såsom hvor specifikke chloroplastprotein er placeret i organellet. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at gennemføre alle de chloroplast isolation trin på fire grader til at sende protea modstå i renset fraktioner.Efter denne procedure kan andre metoder som lascare proteomic tilgange udføres for at besvare yderligere spørgsmål som sammensætningen og dynamikken i proteome af værdierne plastid sub-rum. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for plantefysiologi til at udforske mange forskellige aspekter af chloroplastbiogenese og funktion ved hjælp af målrettet analyse af kandidatproteiner identificeret i plastid sub-rum. Glem ikke, at arbejde med volumen blender, flydende nitrogen, på specifikke forbindelser som proteasehæmmere, kræver særlig pleje.Forholdsregler såsom brug af handsker, laboratoriekittel og sikkerhedsbriller bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En massespektrometribaseret proteomics-tilgang til global R-methyleringsanalyse med høj konfidensprotein

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...