Name: preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
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इस काम के लिए इणरा संयंत्र जीवविज्ञान और प्रजनन प्रभाग से आईबी को एक संयुक्त पीएचडी फैलोशिप और Labex ग़ाल (ANR-10-LABX-49-01) से समर्थन किया गया था । हम यह भी ANR परियोजना ANR-15-IDEX-02, डॉ ओलिवर वैल्हम (IBPC पेरिस) LHCP और डॉ Renaud Dumas (LPCV, ग्रेनोबल) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए कारी के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए स्वीकार करना चाहते हैं ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

वर्तमान लेख chloroplasts (और उनके उप डिब्बों) Arabidopsis थालियानासे शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल कदम प्रोटोकॉल द्वारा कदम विस्तार करना है । अपनी पूरी जीनोम अनुक्रम की उपलब्धता के बाद से लगभग दो दशक पहले, और प्रविष्टि म्यूटेंट के बड़े संग्रह समुदाय के लिए उपलब्ध कराया, Arabidopsis अब व्यापक रूप से एक मॉडल संयंत्र के रूप में स्वीकार कर लिया है । हालांकि, जबकि इस संयंत्र पूरी तरह से आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित किया गया था, संयंत्र वैज्ञानिकों को इस उभरते मॉडल को जैव रासायनिक और शारीरिक उपकरणों के अनुकूलन की जरूरत है । photosynthetically के पत्तों से सक्रिय chloroplasts को शुद्ध करने के लिए अनुमति देने वाले प्रोटोकॉल जैसे कि पालक12 या मटर13 जैसे जैव रासायनिक मॉडल को अनुकूलित किया जाना चाहिए । पहली विधि Arabidopsis chloroplasts की शुद्धि का वर्णन १९९८14में प्रकाशित किया गया था, बस Arabidopsis जीनोम अनुक्रम के रिलीज से पहले । कई साल बाद, Arabidopsis chloroplasts अलग करने के लिए सरल तरीके अध्ययन के साथ संगत में विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य इन विट्रो शुद्ध organelles में प्रोटीन के आयात उपलब्ध कराए गए15,16. हालांकि, इन तरीकों की अनुमति के लिए उच्च स्तर की पवित्रता और संश्लेषक गतिविधि के संरक्षण शुद्ध chloroplasts का गठबंधन नहीं था । हाल ही में17, एक तेजी से विधि स्थापित किया गया था, जो Percoll ढाल के उपयोग पर निर्भर करता है, और प्रकाश संश्लेषण Arabidopsis के शुरू पत्तियों में मापा दर के लगभग ९०% बनाए रखने के लिए अनुमति देता है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित शुद्धता का एक उत्कृष्ट स्तर पर Arabidopsis chloroplasts शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, प्रतिरक्षा अंय सेल डिब्बों से संदूषणों का पता लगाने का प्रदर्शन किया है कि शुद्ध organelles mitochondrial और प्लाज्मा झिल्ली मार्करों9,10से रहित हैं । इस प्रोटोकॉल भी कई Arabidopsis ecotypes18, कोलंबिया (कर्नल) या Wassilewskija (WS), यानी, ecotypes कि जीनोम के लिए इस्तेमाल किया गया या अनुक्रम टैग (सैकड़ा) sequencing व्यक्त की तरह chloroplasts से शुद्ध करने के लिए कुशल था परियोजनाओं लेकिन यह भी Arabidopsisमें टी डीएनए प्रविष्टि म्यूटेंट उत्पंन करने के लिए । दूसरे शब्दों में, जब प्रोटियोमिक् अध्ययन किया जाना है, वर्तमान प्रोटोकॉल Arabidopsisसे इन दो संदर्भ ecotypes के साथ संगत है । अंत में, chloroplasts की उपज वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त एक जब पालक या मटर के पत्तों से शुरू करने के समान है (यानी, 3%, के रूप में Percoll-शुद्ध chloroplast में क्लोरोफिल सामग्री से मापा जब कुल की तुलना में क्लोरोफिल शुरू पत्तियों में मौजूद राशि) । प्रोटीन की दृष्टि से, उपज chloroplast प्रोटीन के ५० मिलीग्राम के करीब है, जब organelles 5 सप्ताह पुराने Arabidopsis पत्तियों की ५०० ग्राम से शुद्ध कर रहे हैं ।
इस तरह के एक अच्छी उपज (और chloroplast अखंडता) तक पहुंचने के लिए, एक लेकिन कई कदम जब वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए । Arabidopsis में chloroplast एक अत्यंत नाजुक संरचना है (यह मटर chloroplasts के लिए मामला नहीं है, उदाहरण के लिए) । विशेष ध्यान इस प्रकार के लिए शुद्धि के दौरान organelles के बड़े पैमाने पर टूटना से बचने के लिए आवश्यक है । chloroplasts में मौजूद स्टार्च granules की संख्या और आकार बरकरार chloroplasts की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण हैं । दरअसल, chloroplasts बड़े स्टार्च अनाज युक्त आम तौर पर प्रारंभिक अंतर केंद्रापसारक के लिए कच्चे chloroplast भागों12ध्यान लक्ष्य कदम के दौरान टूट जाएगा । इसलिए, एक अंधेरे और ठंडे कमरे में रात भर रखा जाना चाहिए (4 ° c) प्रयोग करने से पहले, स्टार्च की मात्रा को कम करने के लिए ।
वर्तमान प्रोटोकॉल के नए उपयोगकर्ताओं को पत्ती सामग्री की बड़ी मात्रा से शुरू करने के लिए परीक्षा हो सकती है (बड़ा पत्तियों के साथ पुराने Arabidopsis पौधों से विशाल rosettes) को शुद्ध chloroplasts की वसूली बढ़ाने की कोशिश कर रहा । हालांकि, हमारे हाथों में, युवा पत्तियों (5 सप्ताह पुराने) से शुरू करने के लिए उपज, पवित्रता गठबंधन और शुद्ध organelles की अखंडता का सबसे अच्छा समझौता है । दरअसल, बहुत पुरानी पत्तियों phenolic यौगिकों कि chloroplast अखंडता19पर एक नकारात्मक प्रभाव है दिखाया गया में अत्यधिक समृद्ध कर रहे हैं ।
अंत में, प्रारंभिक निष्कर्षण कदम (ऊतक के पीस) एक और महत्वपूर्ण कदम है । सम्मिश्रण प्रक्रिया कुछ सेकंड तक ही सीमित होनी चाहिए. जैसा कि ऊपर कहा, नए उपयोगकर्ताओं को अब सम्मिश्रण का उपयोग करें परीक्षा हो सकती है, इस प्रकार दृढ़ता से शुद्ध organelles की उपज में सुधार की उंमीद । हालांकि, अगर अब प्रभावी ढंग से पत्तियों से अधिक सामग्री विज्ञप्ति सम्मिश्रण, ऐसा लगता है कि टूटी हुई chloroplasts का अनुपात तेजी से कच्चे सेल निकालने में बढ़ जाती है । इस उच्च अनुपात के कारण टूटे हुए chloroplasts को मध्यम में बरकरार रखने के लिए, आगे शुद्धिकरण कदम (Percoll ढाल पर जुदाई) दृढ़ता से प्रभावित होते हैं और शुद्धि की उपज अप्रत्याशित रूप से कम होती है ।
organelles शुद्ध करने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की उपलब्धता chloroplast नमूनों पर आयोजित किया जा करने के लिए उच्च प्रवाह प्रोटियोमिक्-आधारित प्रयोगों की एक श्रृंखला की अनुमति दी है. इन आंकड़ों के कई सार्वजनिक डेटाबेस6में उपलब्ध कराए गए थे, इस प्रकार क्षेत्र में जीव को उपलब्ध कराने के एक सटीक उपसेलुलर (और subplastidial) कई chloroplast प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण । यह लिफाफा प्रोटीन जिनकी पहचान और स्थान के लिए विशेष रूप से सच था इन विश्लेषण से पहले ज्यादातर अज्ञात है, के बाद से लिफाफा झिल्ली एक छोटी chloroplast घटक (chloroplast प्रोटीन का 1-2%) प्रतिनिधित्व करते हुए chloroplast में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा चयापचय और उत्पत्ति5,20। प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, हम हाल ही में Arabidopsis से तीन मुख्य chloroplast डिब्बों की संरचना का विश्लेषण (यानी, स्ट्रोमा, thylakoids, और लिफाफा झिल्ली प्रणाली)9। एक अर्द्ध मात्रात्मक प्रोटियोमिक् दृष्टिकोण (वर्णक्रम गिनती) के आधार पर, हम इन तीन chloroplast डिब्बों में प्रोटीन के सैकड़ों के विभाजन का आकलन करने में सक्षम थे ।
जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल Arabidopsisसे chloroplast के तीन मुख्य डिब्बों को शुद्ध करने की अनुमति देता है, यह भी chloroplast में अतिरिक्त उप डिब्बों भेद संभव है । दरअसल, लिफाफा झिल्ली प्रणाली आंतरिक और बाहरी लिफाफा झिल्ली (चित्रा 1) से बना है । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, Arabidopsis chloroplasts से भीतरी और बाहरी लिफाफा झिल्ली को शुद्ध करने के लिए एक विधि स्थापित किया जा करने के लिए बनी हुई है । भीतरी और बाहरी लिफाफा झिल्ली पालक21 या मटर22 chloroplasts से शुद्ध किया जा सकता है । Arabidopsis की मुख्य सीमा शुरू सामग्री की सीमित मात्रा से ज्यादातर परिणाम है । Arabidopsis के पत्तों की ५०० ग्राम से शुरू (जो पहले से ही एक विकास चैंबर में 1 मीटर2 सतह की आवश्यकता है) लिफाफा प्रोटीन के केवल १०० µ जी शुद्ध करने की अनुमति देता है । दूसरी ओर, यह बाजार से पालक के पत्तों की 5-10 किलो के साथ शुरू करने के लिए आसान है, chloroplasts8 की बड़ी राशि को शुद्ध करने के लिए और इस सामग्री से लिफाफा प्रोटीन के 3 से 10 मिलीग्राम की एक उपज के साथ समाप्त करने के लिए ।
thylakoid उप-डिब्बों के लिए भी यही सच है. दरअसल, thylakoids प्रकाश झिल्ली बुलबुले (lamellae) और घने संरचनाओं (grana) (चित्रा 1) के बने होते हैं । विशिष्ट प्रोटोकॉल Arabidopsis23,24में इन दो डिब्बों भेद करने के लिए उपलब्ध हैं । फिर, एक मात्रात्मक प्रोटियोमिक् विश्लेषण के आधार पर, हम हाल ही में इन दो उप डिब्बों में मौजूद प्रोटीन inventoried24। इन दृष्टिकोण, साहित्य की एक में गहराई से जांच के साथ, मांयता की अनुमति दी, या के लिए परिकल्पनाओं का प्रस्ताव, thylakoid प्रोटीन के सैकड़ों के subplastidial स्थान । हालांकि, यह ध्यान रखें कि अतिरिक्त झिल्ली microdomains thylakoids के घुमावदार मार्जिन पर मौजूद है महत्वपूर्ण है । इन लिपोप्रोटीन उप डिब्बों, या plastoglobules, स्थाई रूप से thylakoid झिल्ली के लिए युग्मित कर रहे है और25प्रोटीन का एक विशिष्ट सेट होते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह इस प्रकार अन्य thylakoid घटकों से इन विशिष्ट प्रोटीन भेद करने के लिए संभव नहीं है.
कुछ वास्तविक (प्रसिद्ध) लिफाफा, स्ट्रोमा, या thylakoid घटक अभी भी पता चला प्रोटीन की सूची से कमी कर रहे हैं । एक साथ लक्षित जैव रासायनिक और प्रतिरक्षा विश्लेषण के साथ, एमएस संवेदनशीलता के नित्य सुधार बहुत मदद की होगी अपनी विभिंन उप-डिब्बों की संरचना का एक पूरा प्रदर्शनों की समीक्षा की दिशा में chloroplast सामग्री फिर से आना ।

Chloroplasts संयंत्र कोशिकाओं के प्रमुख घटक हैं । वे एक cyanobacterial पूर्वज है कि एक endosymbiosis आया है और अंत में विकास के दौरान एक organelle के रूप में विकसित से व्युत्पंन1,2। इस तरह के organelles तीन मुख्य डिब्बों (चित्रा 1) होते हैं । लिफाफा प्रणाली एक आंतरिक और एक बाहरी organelle आसपास की झिल्ली से बना है । इस डबल झिल्ली प्रणाली विभिंन लिपिड और pigments के चयापचय में शामिल एंजाइमों शामिल है और ज्यादातर plastids और cytosol के बीच संचार के नियंत्रण के लिए समर्पित है । यह विभिंन परिवहन प्रणालियों कि परमाणु इनकोडिंग प्रोटीन के आयात की अनुमति है, और आयनों और cytosol और chloroplast के बीच चयापचयों के आदान प्रदान इस प्रकार संयंत्र सेल3,4 के आवश्यक चयापचय कार्यों को विनियमित शामिल . स्ट्रोमा, chloroplast के घुलनशील चरण, केल्विन चक्र के एंजाइमों शामिल (सह2 आत्मसात), एमिनो एसिड और विटामिन सहित विभिंन चयापचयों के संश्लेषण, और प्रतिलेखन और plastid के अनुवाद मशीनरी । thylakoid झिल्ली एक व्यापक रूप से आयोजित आंतरिक झिल्ली नेटवर्क जहां प्रकाश संश्लेषण के चरण जगह लेता है । इस प्रकार, chloroplasts जगह है जहां आवश्यक चयापचय रास्ते होते है5।
आदेश में नए विनियामक तंत्र है कि chloroplast गतिशीलता और शरीर विज्ञान नियंत्रण समझने के लिए, chloroplast प्रोटीन के उप plastidial स्थानीयकरण परिभाषित इस प्रकार बेहतर प्रोटीन कार्यों को समझने के लिए लक्ष्य को लक्षित अध्ययन का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है मॉडल जीवों में6. आदेश में इन प्रोटीन के वास्तविक subplastidial स्थानीयकरण के लिए उपयोग करने के लिए, यह इस प्रकार अत्यधिक शुद्ध subplastidial भागों (लिफाफा झिल्ली, स्ट्रोमा, और thylakoids) से शुरू करने के लिए आवश्यक है । इस संदर्भ में, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य विभेदक केंद्रापसारक और सतत Percoll ढाल का उपयोग कर Arabidopsis पत्तियों से अक्षुण्ण chloroplasts को शुद्ध करने के लिए है, और उन्हें fractionate का उपयोग करने के लिए सतत सुक्रोज ढाल, तीन में उप डिब्बों (यानी, लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids) । यहाँ वर्णित विधि भी विभिन्न chloroplast उप-डिब्बों से जुड़े मार्करों का उपयोग करते हुए शुद्ध उप-organellar अंशों की शुद्धता का आकलन करने के निर्देश प्रदान करती है. इस प्रोटोकॉल immunoblotting का उपयोग प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है और शुद्ध भागों मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-proteomic अध्ययन आधारित का उपयोग कर के आगे विश्लेषण के लिए ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6977.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#949;-amino caproic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6979.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9286.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>USB</td>
			<td>US12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel staining medium</td>
			<td>Clini-sciences</td>
			<td>GEN-QC-STAIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>528151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fat-free milk powder</td>
			<td>R&#233;gilait</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H/1150/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH pellets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.05012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>480507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMA1 antibody</td>
			<td></td>
			<td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KARI antibody</td>
			<td></td>
			<td>Ferro et al, 2010</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCP antibody</td>
			<td></td>
			<td>Vallon et al, 1991</td>
			<td>Used at a 1:25,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-coumaric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol (3-aminophalhydrazin)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO).</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large (30 cm &#215; 45 cm) plastic cases</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>162135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. thaliana seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Around 30 mg of seeds for a whole case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost &#34;Floragard&#34;</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>16311770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth rooms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12-h light cycle, set at 23&#176;C (day) / 18&#176;C (night) with a light intensity of 150 &#956;mol/m2/s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muslin or cheesecloth</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70116</td>
			<td>80-cm-large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon blutex 50 &#956;m aperture</td>
			<td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td>
			<td></td>
			<td>50 &#956;m aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity</td>
			<td>Waring Blender</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 &#215; 500-mL plastic bottles)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JA-20 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-20 (6 &#215; 50 mL polypropylene tubes)</td>
			<td>Sorvall instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 &#215; 50 mL polycarbonate tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor (6 &#215; 13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge (Beckman L7)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman JSE-06D18)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5415D or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>BA85, Schleicher and Schuell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>3MM, Whatman, Maidstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System for protein transfer to nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics

Chloroplasts संयंत्र कोशिकाओं के प्रमुख घटक हैं । इस तरह के plastids कार्बन, सल्फर और नाइट्रोजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आवश्यक चयापचयों के संश्लेषण के आत्मसात के रूप में कई महत्वपूर्ण कार्यों, पूरा । ये organelles निम्नलिखित तीन प्रमुख उप-डिब्बों से मिलकर बनता है. लिफाफा, दो झिल्ली की विशेषता, organelle के चारों ओर और अन्य कोशिका डिब्बों के साथ plastid के संचार को नियंत्रित करता है । स्ट्रोमा chloroplast और मुख्य साइट है जहां कार्बन डाइऑक्साइड कार्बोहाइड्रेट में परिवर्तित हो जाता है की घुलनशील चरण है । thylakoid झिल्ली आंतरिक झिल्ली grana से मिलकर नेटवर्क है (फ्लैट संकुचित sacs) और lamellae (कम घने संरचनाओं), जहां ऑक्सीजन प्रकाश संश्लेषण जगह लेता है । वर्तमान प्रोटोकॉल शुद्धि के लिए आवश्यक कदम से कदम प्रक्रियाओं का वर्णन, विभेदक केंद्रापसारक और Percoll ढाल का उपयोग, Arabidopsisसे बरकरार chloroplasts की, और उनके अंश, सुक्रोज ढाल का उपयोग, तीन में उप डिब्बों (यानी, लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids) । इस प्रोटोकॉल भी विभिंन chloroplast उप डिब्बों से जुड़े मार्करों का उपयोग कर इन अंशों की शुद्धता का आकलन करने के लिए कैसे पर निर्देश प्रदान करता है । यहां वर्णित विधि immunoblotting का उपयोग प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है, लेकिन यह भी उपसेलुलर और subplastidial प्रोटियोमिक् और अंय अध्ययनों के लिए ।

शुद्ध chloroplast और उनके उप डिब्बों में जिसके परिणामस्वरूप प्रक्रिया के क्रमिक कदम चित्रा 2में फिर से शुरू कर रहे हैं । Percoll ढाल (चित्रा 2a) टूटी chloroplast और mitochondria (ढाल के ऊपर) या नाभिक और कोशिका मलबे (ढाल के नीचे) से बरकरार chloroplasts भेद की अनुमति देता है । एक आसमाटिक सदमे के लिए Percoll-शुद्ध organelles धंयवाद के टूटना के बाद, परिणामस्वरूप भिन्न एक सुक्रोज ढाल पर अलग कर रहे हैं (चित्रा बी b). स्ट्रोमा (chloroplast के घुलनशील भाग) सुक्रोज ढाल की सतह पर तैर रहा है । प्रकाश लिफाफा झिल्ली बुलबुले 0.6/0.93 एम सुक्रोज इंटरफेस में एक असतत पीले बैंड के रूप में बरामद कर रहे हैं । सबसे भारी thylakoid झिल्ली बुलबुले ट्यूब के तल पर केंद्रित कर रहे हैं । वसूली के बाद, धोने और दो झिल्ली भागों की एकाग्रता, प्रोटीन quantified है और सभी चार भागों की संरचना एक एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 2c) पर विश्लेषण किया है । गलियाँ एक समान प्रोटीन आधार पर भरी जाती हैं (प्रत्येक शुद्ध अंश के २० µ जी). जानते हुए भी कि chloroplasts लिफाफा प्रोटीन और स्ट्रोमा से या thylakoids से प्रोटीन का ५०% का केवल 1% होते हैं, इस पार से अनुमान लगाने के अंय chloroplast उप डिब्बों के साथ शुद्ध लिफाफा तैयारी के संदूषण जाता है । हालांकि, इस विधि से प्रोटीन के मिनट मात्रा का पता लगाने की अनुमति देता है पार-दूषित लिफाफा अंश । प्रत्येक डिब्बे से मार्करों (यानी, प्रचुर मात्रा में प्रोटीन) अंशों के पार संदूषण के मूल्यांकन में बहुत सहायक होते हैं । वास्तव में, thylakoid और लिफाफा झिल्ली भागों RuBisCO (RBCL), स्ट्रोमा (५० केडीए) से सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की बड़ी उपइकाई के बहुत कम मात्रा में शामिल होने की उम्मीद कर रहे हैं. टूटी हुई chloroplasts आसानी से इस stromal प्रोटीन8के नुकसान के कारण बरकरार chloroplast से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन्स (LHCP) हैं 25-केडीए प्रचुर मात्रा में thylakoid घटक है कि मुश्किल से होना चाहिए (से कम 3%) दूषित लिफाफा झिल्ली9. अंत में, फॉस्फेट-triose-फास्फेट translocator (TPT) एक 30-केडीए प्रोटीन है कि शुद्ध लिफाफा में ही दिखाई दे रहा है अपने मजबूत संवर्धन के कारण अंश (यानी, ५० से १०० एक्स) लिफाफा अंश में जब पूरे chloroplast निष्कर्षों की तुलना में. विधि का प्रयोग यहां वर्णित है, chloroplast उप डिब्बों आम तौर पर खराब पार कर रहे है के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 2d) के सभी तीन उप डिब्बों के ज्ञात मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर का उपयोग कर संदूषित: घुलनशील ketol-एसिड reductoisomerase (कारी) से स्ट्रोमा, chloroplast लिफाफा कॉपर ATPase (HMA1), और LHCP झिल्ली से हल्की कटाई जटिल प्रोटीन (thylakoid) में होता है । तीन उप-डिब्बों के परस्पर संदूषण को immunoblotting और जन स्पेक्ट्रोमेट्री िरा9का प्रयोग कर quantified जा सकता है । जबकि स्ट्रोमा आमतौर पर लिफाफा या thylakoid भागों से दूषित नहीं है, शुद्ध लिफाफा अंशों thylakoid प्रोटीन के 3% और स्ट्रोमा से प्रोटीन का 10% तक होते हैं । स्ट्रोमा से प्रोटीन thylakoid झिल्ली को दूषित (कम 1%) लेकिन thylakoids लिफाफा झिल्ली प्रोटीन के 3% तक होते हैं । chloroplast प्रोटीन के वास्तविक subplastidial स्थान की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका होने से अधिक, वर्तमान विधि इस प्रकार भी पार संदूषणों से उत्पंन प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के बारे में गलत निष्कर्ष सीमा ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg"> चित्रा 1: chloroplast उप डिब्बों की प्रतिनिधि योजना । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg"> चित्रा 2: Percoll और सुक्रोज ढाल का उपयोग कर बरकरार chloroplasts और उनके तीन मुख्य उप डिब्बों की शुद्धि । A. Percoll भंग और बरकरार chloroplasts के पृथक्करण की अनुमति ढाल । B. सुक्रोज स्ट्रोमा, लिफाफे की जुदाई की अनुमति ढाल, और thylakoid भागों । C. प्रतिनिधि एसडीएस-बरकरार chloroplasts से प्रोटीन के पृष्ठ और उनके तीन मुख्य उप प्रत्येक उप डिब्बे से प्रचुर मात्रा में मार्करों कल्पना की अनुमति डिब्बों । प्रत्येक लेन में प्रोटीन के 10 µ g होते हैं । आण्विक वजन मार्करों: RBCL, RuBisCO की बड़ी उपइकाई (स्ट्रोमा के लिए मार्कर); TPT, फॉस्फेट/triose-फास्फेट translocator (लिफाफा के लिए मार्कर); LHCP, प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन (thylakoid के लिए मार्कर) । D. पश्चिमी दाग प्रयोग विशिष्ट मार्करों का पता लगाने की अनुमति (विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर) प्रत्येक उप डिब्बे से: chloroplast लिफाफा तांबे ATPase HMA110, प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन thylakoid से LHCP झिल्ली11, और स्ट्रोमा9से ketol-एसिड reductoisomerase कारी । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए Arabidopsis पत्तियों और उनके तीन मुख्य उप डिब्बों से बरकरार chloroplasts शुद्ध (लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids), अंतर केंद्रापसारक के एक संयोजन का उपयोग, सतत Percoll ढाल, और निरंतर सुक्रोज ग्रैडिएंट । विधि immunoblotting और प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन के subplastidial और सेलुलर स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है ।

Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

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