Name: preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

이 작품 INRA 식물 생물학과 번 식 및 Labex 성배 (ANR-10-LABX-49-01) IB를 공동 박사 학위 장학금에 의해 지원 되었다. 우리 또한 싶습니다 ANR 프로젝트 ANR-15-IDEX-02, 박사 올리비에 Vallon (IBPC 파리) LHCP 박사 Renaud 뒤 마 (LPCV, 그 르노 블)에 대 한 항 체를 인정 하는 카 리에 대 한 항 체에 대 한.

1. 버퍼, 재고 솔루션 및 그라디언트의 준비
<ol><li>4 ° c.에 6 개월 저장 될 수 있는 다음과 같은 재고 솔루션을 준비<ol>
<li>Tricine 버퍼 (1 M, pH 8.4) 및 Tricine 버퍼 (1 M, pH 7.6) 1 리터를 준비 합니다. 코 펠 릿을 추가 하 여 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, 0.5 M, pH 8) 1 리터와 3-(N-morpholino) 프로 판 술 폰 산 (MOPS) 버퍼 (1 M, pH 7.8) 준비 합니다. NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>MgCl2 (1m) 50 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>준비 50ml protease 억제제 솔루션: phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF 소 프로 파 놀, 100 m m에), benzamidine 염 산 염 수화물 (100 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (50 mM). 참고: 동안 PMSF 및 아미노 카프 산 솔루션에서 안정적인 4 ° C에서 개월 동안, benzamidine 솔루션 저장 해야-20 ° c.에</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 전에 하루 다음 솔루션을 준비 하 고 4 ° c.에 모든 솔루션 저장<ol>
<li>보통 pH 8.4 Tricine-코 (20 m m, pH 8.4), 포함 된 연 삭의 4 L 준비 톨 (0.4 M), (10 m m, pH 8), EDTA 그리고 NaHCO3 (10 mM). NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. 그냥 사용 하기 전에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1% (w/v)을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>중간 (2 배) pH 7.6 Tricine-코 (20 m m, pH 7.6), 포함 된 세척의 500 mL를 준비 톨 (0.8 M), MgCl2 (5 m m), 그리고 EDTA (2.5 m m). NaOH 산 탄을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. Percoll 그라데이션 솔루션의 세척 매체 (1x)를 준비 후 같은 솔루션을 희석.</li>
		<li>50% (v/v) Percoll에서 최종 솔루션을 동일한 볼륨에서 세척 매체 (2 배)와 Percoll를 혼합 하 여 엽록체 정화 200 mL Percoll 그라데이션 솔루션의 준비 / 0.4 M 톨.</li>
		<li>MOPS (10 m m, pH 7.8), MgCl2 (4 m m), 자당 (0.3 M, 0.6 M, 0.93 M)의 다른 농도 혼합 하 여 엽록체 분별에 대 한 자당 솔루션 50 mL를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 그라디언트 및 실험을 시작 하기 전에 버퍼를 준비 합니다.<ol>
<li>Percoll 그라데이션 6 튜브 준비 (각각 50%의 30 mL를 포함 된 Percoll / 0.4 M sorbitol) 4 ° c.에서 55 분 38,700 x g에서 원심 분리 하 여 그래디언트의 혼합을 방지 하기 위해 브레이크 계속. 원심, 후 차가운 방에 미리 형성한 그라디언트 사용까지 포함 된 튜브를 저장 합니다.</li>
		<li>3 다음 자당 계층 형성 각 그라데이션으로 자당 기온 변화도의 4 개의 튜브를 준비: 0.93 M, 2.5 ml 0.6 M, 0.3 M 자당의 2 mL의 3 mL. 조심 스럽게 시작 0.93 m 아래쪽에 그리고 0.3 M로 상단에 연동 펌프를 사용 하 여 각 레이어 오버레이.</li>
		<li>MOPS (10 m m, pH 7.8), MgCl2 (4 m m), PMSF (1mm, 소 프로 파 놀에서 설정), benzamidine 염 산 염 수화물 (1 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (0.5 m m)를 포함 하는 엽록체 세포에 대 한 소형 매체의 50 mL를 준비 합니다. 사용까지 얼음에 버퍼를 저장 합니다.</li>
		<li>막 세척 MOPS (10 m m, pH 7.8), PMSF (1mm), benzamidine 염 산 염 수화물 (1 m m), 및 ε-아미노 카프 산 (0.5 m m)를 포함 하는 버퍼의 50 mL를 준비 합니다. 사용까지 얼음에 버퍼를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 성장과 애기 잎의 수확
<ol><li>애기 식물의 성장에 대 한 준비 4 큰 플라스틱 팬 (0.5 ~ 1 m2의 총 표면) 애기 식물의 각 팬에는 씨앗의 30 mg을 파 종 하 여. 150 μ M m-2의 -1의 광도와 23 ° C (일) / 18 ℃ (밤) 12-h 라이트 사이클에서 5 주 동안 애기 식물을 성장.</li>
	<li>(엽록체에 전 분 알갱이의 양을 줄이기 위해)을 실험 전에 하룻밤 어둡고 차가운 룸 (4 ° C)에 식물을 품 어.</li>
	<li>1 리터 비 커를 미리 무게를 다음 잎 물자의 수확을 시작 하기 전에 얼음에 넣습니다.</li>
	<li>토양 (퇴 비)를 피하 여 애기 잎 수확. 다시 비 커의 무게와 조직 무게 기록. 참고: 잎 물자의 400 ~ 500 g 4 개의 팬에서 예상 된다.</li>
	<li>버퍼를 연 삭의 2 패와 함께 추운 방에 나뭇잎 균질 (BSA 사용 하기 전에) 3 번 추가 2 / s 고속 믹서 기에 각 시간.</li>
	<li>캘 리코의 4 개의 층 및 나일론 blutex의 1 개의 층을 사용 하 여 차가운 방에 homogenate를 필터링 합니다. 부드럽게 모든 액체를 추출 하는 캘 리코/나일론 blutex 내부 homogenate 잎을 짠 다.</li>
	<li>두 번째 추출에 대 한 믹서 기 컵에 나머지 조직을 복구 합니다. 2.5 및 2.6 (추운 방에) 캘 리코의 4-5 레이어 매체 및 새로운 연 삭의 2 L을 사용 하 여 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 차등 원심 분리를 사용 하 여 원유 엽록체의 정화
<ol><li>똑같이 6 500 mL 병으로 원유 세포 추출 물 고 원심 분리 전에 얼음에 병을 배치. 최대 속도 (2,070 x g) (최대 가속 및 브레이크에, 4 ° C)에 2 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>부드럽게는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>물 펌프를 사용 하 여 나머지 상쾌한 발음 하 고 얼음에 집중된 원유 엽록체를 포함 하는 펠 릿을 유지.</li>
	<li>부드럽게 세척 매체 (1x)의 최소한의 볼륨을 추가 하 여 펠 릿을 resuspend (결합 된 엽록체 정지의 최종 볼륨 = 36 mL)를 붓 또는 곡선된 플라스틱 주걱을 사용 하 여. 10ml 피펫으로 사용 하 여 각 병에는 중간 세척 3 mL를 추가. 참고: 엽록체의 파손을 피하기 위해 아주 좋은 팁 피펫으로 사용 하지 마십시오. 또는, 더 큰 구멍을 생성 하는 면도날으로 피펫으로의 파란색 팁 잘라.</li>
	<li>10ml 피펫으로 사용 하 여 한 튜브에 resuspended 엽록체를 수집 합니다. Percoll 그라데이션에 로드 하기 전에 동일한 정지를 튜브를 거꾸로 하 여 부드럽게 섞는다.</li>
</ol>4. 연속 Percoll 그라데이션에 그대로 엽록체의 정화
<ol><li>천천히 6 mL 10ml 피펫으로 엽록체의 파손을 피하기 위해 사용 하는 6 Percoll 기온 변화도의 각 위에 엽록체의 서 스 펜 션의 로드.</li>
	<li>13300 x g, 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 10 분에 대 한 그라디언트 원심 참고: 가속, 그리고 브레이크를 분리 한다 (에서 브레이크 또는 느린 감속) Percoll 그라디언트의 혼합을 방지 하기 위해.</li>
	<li>깨진된 엽록체와 물 펌프를 사용 하 여 그대로 미토 콘 드리 아를 포함 하는 위 단계를 발음 하 고 그대로 엽록체에에서 존재를 다음 검색 (광범위 한 다크 그린 밴드) 10ml 피펫으로와 단계. 수 핵과 세포 파편 (튜브의 하단에서 찾을) 그대로 엽록체 (그림 2A)으로 발음 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>3-4-배 세척 버퍼 (1x) 그대로 엽록체 정지 희석. (2,070 x g, 4 ° C) 최대 속도 (최대 가속 및 브레이크에)에 2 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>신중 하 게는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>완전히 물 펌프와 나머지 상쾌한 발음 하 고 얼음에 집중된 그대로 엽록체의 펠 릿을 유지.</li>
	<li>엽록체 세포의 용 해, 전에 약 1 ml의 세척 매체 (1x) 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)와 서 부 럽을 사용 하 여 추가 분석에 대 한 그대로 엽록체 분수의 약 수를 유지. 작은 단백질 농도의 결정에 대 한 이러한 그대로 엽록체의 aliquot 유지. 추가 실험을 위한 액체 질소에 그대로 엽록체 분수를 저장 합니다.</li>
</ol>5. 당뇨 버퍼와 엽록체 하위 구획의 정화를 사용 하 여 불연속 자당 기온 변화도에 그대로 엽록체의 세포의 용 해
<ol><li>소형 매체 protease 억제제 (최종 볼륨 12 mL를 초과 하지 않아야 합니다)을 포함 하는 펠 릿을 resuspending에 의해 순화 그대로 엽록체를 lyse. 참고:이 단계에서 피펫으로 좋은 팁 (블루 팁) 사용 가능 하다 때문에 엽록체의 intactness는 더 이상 필수 (펠 릿은 전적으로 resuspended 하지로 아래로 엽록체 pipetting). 애기 엽록체는 (해당 되는 경우 예를 들어 완 두 엽록체에 비해) 매우 깨지기 쉬운 이며 그들의 세포의 용 해 거의 즉시 부 화 후 소형 매체에.</li>
	<li>연동 펌프를 사용 하 여 각 미리 형성한 자당 그라디언트 상단 lysed 엽록체의 3 mL를 천천히 로드.</li>
	<li>Ultracentrifuge (70000 x g, 4 ° C)에서 1 시간에 대 한 그라디언트. 원심 분리 이전 소형 중간 버퍼를 사용 하 여 튜브의 쌍을 균형.</li>
	<li>신중 하 게 그라데이션 (3 mL 각 그라데이션에서)의 상위 단계를 pipetting으로 수용 성 기질 단백질을 복구 (그림 2B). 단백질 농도7의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 추가 실험을 위한 액체 질소에 기질을 저장 합니다.</li>
	<li>각 그라디언트의 나머지 상위 단계 발음까지 물 펌프를 사용 하 여 노란색 밴드.</li>
	<li>피펫으로 (각 그라데이션에서 약 1 mL)와 노란색 밴드 (봉투)를 검색 합니다. 1 개의 관에 봉투를 풀.</li>
	<li>각 그라디언트의 나머지 단계를 최대 thylakoid 펠 릿 물 펌프를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
</ol>6. 세척 및 Thylakoid 및 봉투 막 시스템의 농도
<ol><li>막 세척 (protease 억제제)와 버퍼 (1x)의 최소 볼륨 (2 mL) thylakoid 펠 릿 (녹색 알갱이)를 resuspend.</li>
	<li>봉투와 thylakoid 정지 희석 3-4-배 막 세척 매체에서 (10 mL에 양을 맞추십시오) 및 ultracentrifuge (110000 x g, 4 ° C)에서 1 시간에 대 한. 막 세척 원심 분리 이전 버퍼를 사용 하 여 튜브의 쌍을 균형.</li>
	<li>조심 스럽게 물 펌프를 사용 하 여 supernatants 발음.</li>
	<li>버퍼 (protease 억제제) 봉투 펠 릿을 세척 하는 막의 약 100 µ L를 추가 합니다. 단백질 농도7의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 액체 질소에 순화 된 봉투 막 준비를 저장 합니다.</li>
	<li>(Protease 억제제)와 버퍼를 세척 하는 멤브레인의 3 ml에서 thylakoids 펠 릿을 resuspend. 단백질 농도7의 결정에 대 한 약 수를 가져가 라. 액체 질소에 thylakoid 막 분수를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+theory+for+organelle+origins.">Endosymbiotic theory for organelle origins.</a> Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).</li><li>Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+evolution.">Plastid evolution.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).</li><li>Linka, N., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+metabolite+transporters+in+plants.">Intracellular metabolite transporters in plants.</a> Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).</li><li>Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+envelope+membranes:+a+dynamic+interface+between+plastids+and+the+cytosol.">Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol.</a> Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Agrawal, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics:+collaborating+for+optimal+cell+function.">Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function.</a> Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).</li><li>Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[40]+Electrophoretic+analysis+of+chloroplast+proteins.">[40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins.</a> Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+intact+chloroplasts+from+Arabidopsis+and+spinach+leaves+by+isopycnic+centrifugation.">Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2008).</li><li>Ferro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT_CHLORO,+a+comprehensive+chloroplast+proteome+database+with+subplastidial+localization+and+curated+information+on+envelope+proteins.">AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).</li><li>Seigneurin-Berny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMA1,+a+new+Cu-ATPase+of+the+chloroplast+envelope,+is+essential+for+growth+under+adverse+light+conditions.">HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).</li><li>Vallon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+redistribution+of+cytochrome+b6/f+complexes+along+thylakoid+membranes+upon+state+transitions.">Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).</li><li>Douce, R. J. J., Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+chloroplast.">Purification of the chloroplast.</a> Methods in Chloroplast Molecular Biology. , 239-256 (1982).</li><li>Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+the+isolation+of+intact+chloroplasts+of+high+photosynthetic+capacity.">An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).</li><li>Kunst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+physiologically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis.">Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Protein+Import+into+Chloroplasts+Isolated+from+Stressed+Plants.">Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll-purified+and+photosynthetically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).</li><li>Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+chloroplasts+and+their+sub-organellar+compartments.">Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments.</a> Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).</li><li>Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , (1990).</li><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+membrane+fractions+enriched+in+outer+and+inner+envelope+membranes+from+spinach+chloroplasts.+II.+Biochemical+characterization.">Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization.</a> Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).</li><li>Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+and+protein-kinase+activity+in+isolated+envelopes+of+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 166 (3), 394-400 (1985).</li><li>Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Membrane+Fractions+(Envelope,+Thylakoids,+Grana,+and+Stroma+Lamellae)+from+Arabidopsis+Chloroplasts+for+Quantitative+Proteomic+Investigations+and+Other+Studies.">Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).</li><li>Tomizioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+thylakoid+sub-compartments+using+a+mass+spectrometry-based+approach.">Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).</li><li>Spicher, L., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+of+plastoglobules+(plastid+lipid+droplets)+in+vitamin+K1+and+E+metabolism.">Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 문서에서 애기 thaliana엽록체 (그리고 그들의 하위 구획)를 정화 하는 데 사용 하는 단계 프로토콜 세부 목표로 합니다. 그것의 완전 한 게놈 순서 거의 2 년 전와 지역 사회에 게 제공 하는 삽입 돌연변이의 대규모 컬렉션의 가용성, 이후 애기 는 지금 널리 받아들여진다 모델 식물으로. 그러나,이 식물 유전 접근에 대 한 완벽 하 게 적응 시킨 동안, 과학자 들은 생 화 확 및 생리 적인 도구가 신흥 모델에 적응 하는 데 필요한 공장. 따라서 시금치12 또는 완두콩13 같은 잘 설립 된 생 화 학적 모델의 잎에서 photosynthetically 활성 엽록체를 정화 수 있도록 프로토콜 적응 했다. 애기 엽록체의 정화를 설명 하는 첫 번째 방법은 199814, 애기 게놈 시퀀스의 출시 직전에 간행 되었다. 몇 년 동안 애기 엽록체 순화 된 세포에 있는 단백질의 생체 외에서 수입을 분석 하는 것을 목표로 연구와 호환 하기 위한 후, 간단한 방법은 사용할 수15,16되었다. 그러나, 이러한 방법은 순도의 높은 수준 및 순화 된 엽록체의 광합성 활동의 보존을 결합 허용 하지 않았다. 최근17, 빠른 방법 설립 되었다, Percoll 그라데이션의 사용에 의존 하 고 애기의 시작 잎에서 측정 하는 광합성 속도의 거의 90%를 유지할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 순도의 우수한 수준 애기 엽록체 정화 수 있습니다. 실제로, 다른 세포 구획에서 오염 물질의 면역 검출 순화 된 세포는 미토 콘 드리 아 없는 시연 및 플라즈마 멤브레인 마커9,10. 이 프로토콜은 여러 애기 ecotypes18, 컬럼비아 (열) 또는 Wassilewskija (WS), 즉, 같은 엽록체 정화 효율 또한 ecotypes 게놈에 사용 되거나 표현 된 태그 (에스토니아어) 시퀀싱 시퀀싱 또한에 애기에 T-DNA 삽입 돌연변이 생성 하지만 프로젝트. 즉, proteomics 연구 수행 될 때, 현재 프로토콜 애기에서이 두 참조 ecotypes와 호환 됩니다. 마지막으로, 현재 프로토콜을 사용 하 여 엽록체의 수익률은 시금치 나 완두콩 잎 (즉, 3%, Percoll 정화 엽록체는 총에 비교 될 때에 엽록소 콘텐츠 측정에서 시작 했을 때 확인 하는 것과 유사 염 록 소 양 잎을 시작에 존재)입니다. 단백질, 측면에서 수익률 때 엽록체 단백질의 50 밀리 그램 가까이 세포 5 주 된 애기 잎 500 g에서 순화 된다.
그러나 이러한 좋은 수확량 (와 엽록체 무결성), 도달을 현재 프로토콜을 사용 하는 경우 하나 몇 가지 단계에 특별 한 주의 기울여야 한다. 애기 에 엽록체 (이건 완 두 엽록체에 대 한 경우 예를 들어) 매우 깨지기 쉬운 구조 이다. 특정 관심 따라서 정화 동안에 세포의 대규모 파열을 피하기 위해 필요 합니다. 수와 엽록체에 전 분 알갱이의 크기는 그대로 엽록체의 준비에 대 한 중요 합니다. 실제로, 큰 전 분 곡물을 포함 하는 엽록체 일반적으로 손상 됩니다 원유 엽록체 분수12집중을 목표로 초기 차동 centrifugations 단계. 따라서, 식물 전 분의 양을 줄이기 위해 실험 전에 어둡고 차가운 룸 (4 ° C)에서 하룻밤 유지 되어야 한다.
현재의 프로토콜의 새로운 사용자가 더 많은 양의 잎 소재 (큰 잎을 가진 오래 된 애기 식물에서 거 대 한 근 엽)에서 시작 하 유혹 수 정화 엽록체의 복구를 강화 하려고. 그러나, 우리의 손 안에, 수율, 순도, 고 정화 세포의 무결성을 결합 하 여 최고의 타협은 젊은 잎 (5 주 된)에서 시작. 사실, 너무 오래 된 잎은 엽록체 무결성19에 부정적인 영향을 표시 했다 페 놀 화합물에 높은 농축 된다.
마지막으로, 초기 추출 단계 (조직의 연 삭) 또 다른 중요 한 단계가입니다. 혼합 프로세스는 몇 초를 제한 해야 합니다. 위에서 설명 했 듯이, 새로운 사용자 유혹 수도 있습니다 될 더 이상 혼합 사용 하 여 따라서 강력 하 게 순화 된 세포의 수율 향상을 기대. 그러나, 더 이상 효과적으로 혼합 잎에서 더 많은 자료 출시, 그것은 깨진된 엽록체의 비율 원유 세포 추출 물에서 급속 하 게 증가 나타납니다. 깨진 매체에 그대로 엽록체의이 높은 비율 때문 추가 정화 단계 (Percoll 그라디언트에 분리) 강하게 영향을 고 정화의 수확량은 예기치 않게 낮은.
세포를 정화 하는 특정 프로토콜의 일련 높은 처리량의 proteomics 기반 실험 엽록체 샘플에 실시 될 수 있다. 이러한 데이터는 여러 공용 데이터베이스6, 따라서 생물학 분야에서 많은 엽록체 단백질에 대 한 정확한 subcellular (및 subplastidial) 지역화 제공 가능 했다. 이것은 특히 사실 봉투 단백질에 대 한 id와 위치 남아 있었다 주로 이러한 분석 하기 전에 알 수 없는 때문에 봉투 막 엽록체에서 중요 한 역할을 재생 하는 동안 사소한 엽록체 구성 요소 (엽록체 단백질의 1-2%)를 나타냅니다. 신진 대사와 속5,20. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 최근 분석에서 애기 3 엽록체 주요 구획의 구성 (즉, 기질, thylakoids, 및 봉투 멤브레인 시스템)9. Proteomics 반 양적 접근 (스펙트럼 계산)에 따라,이 3 개의 엽록체 구획에 있는 단백질의 수백의 분할 평가할 수 있었습니다.
현재 프로토콜 애기에서 엽록체의 세 가지 주요 구획을 정화 수 있습니다, 하는 동안 추가 하위 구획은 엽록체에서 구별 가능한 이기도 합니다. 사실, 봉투 막 시스템의 내부 및 외부 봉투 막 (그림 1) 이루어집니다. 그러나, 우리의 지식 최선을 애기 엽록체에서 내부 및 외부 봉투 막 정화 하는 방법을 설정할 수 있다. 내부 및 외부 봉투 막 시금치 완두콩 또는21 22 엽록체에서 정화 될 수 있다. 애기 의 주요 제한 시작 물자의 제한 금액에서 주로 발생 합니다. (요구 하는 이미 성장 챔버에 1 m2 표면) 애기 잎 500 g에서 시작만 100 µ g 봉투 단백질의 정화 수 있습니다. 다른 한편으로, 그것은 쉽습니다 시작으로 시금치의 5-10 k g 시장, 많은 양의 엽록체8 을 정화 하 고이 자료에서 봉투 단백질의 3 ~ 10 밀리 그램의 항복으로 끝에서 나뭇잎.
같은 thylakoid 하위 구획에 대 한 사실 이다. 실제로, thylakoids 빛의 만들어진다 막 소포 (lamellae) 및 밀도 구조 (grana) (그림 1). 특정 프로토콜 애기23,24에이 2 개의 구획을 구별할 수 있습니다. 우리 다시, 최근 이러한 두 개의 하위 구획24에 단백질을 인벤토리 양이 많은 proteomics 분석을 바탕으로. 이러한 접근 문학, 깊이 있는 조사와 검증, 또는 가설을 제안 하는 위치에 대 한, subplastidial thylakoid 단백질의 수백의 허용. 그러나, thylakoids의 곡선된 여백에 추가 막 microdomains 존재는 중요 하다. 이 지 하위 구획, 또는 plastoglobules, thylakoid 막에 영구적으로 결합 하는 고 단백질25의 특정 집합을 포함. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 불가능 따라서 다른 thylakoid 구성 요소에서이 특정 단백질을 구별 하.
일부 정품 (잘 알려진) 봉투, 기질, 또는 thylakoid 구성 요소는 검색 된 단백질의 목록에서 아직 부족 한. 타겟된 생 화 학적 및 면역 분석, 함께 MS 감도의 지속적인 개선의 다양 한 하위 구획의 구성의 완전 한 레 퍼 토리로 엽록체 콘텐츠를 다시 하는 게 큰 도움이 될 것입니다.

엽록체는 식물 세포의 주요 구성 요소. 그들은 한 endosymbiosis 겪고 있으며 결국 진화1,2중으로 한 세포 기관이 진화 cyanobacterial 조상에서 파생 됩니다. 이러한 세포 세 가지 주요 구획 (그림 1)를 포함합니다. 봉투 시스템 내부 및 주변 세포 기관이 외부 막의 이루어집니다. 이 이중 멤브레인 시스템 지질과 안료의 대사에 관련 된 다양 한 효소를 포함 하 고 plastids는 cytosol 간의 통신 제어 하는데 대부분 이다. 인코딩된 핵 단백질의 가져오기 및 이온 그리고 대사 산물은 cytosol와 따라서 식물 세포3,4 필수적인 대사 기능을 조절 하는 엽록체의 교환을 허용 하는 다양 한 전송 시스템 포함 . 기질, 엽록체의 용 해 단계 포함 캘빈 주기 (CO2 동화)의 효소와 비타민, 아미노산과 plastid의 전사 및 번역 기계를 포함 하 여 다양 한 대사 산물의 합성. Thylakoid 막 광합성의 빛 단계 수행 널리 조직된 내부 막 네트워크입니다. 따라서, 엽록체는 필수적인 대사 경로5발생 하는 장소입니다.
엽록체 역학 및 생리학을 제어 하는 새로운 규제 메커니즘을 해독 하려면 엽록체 단백질의 하위 plastidial 지역화를 정의 따라서 중요 하다 단백질 기능 파악을 목표로 하는 타겟된 연구를 지원 하기 위해 모델 생물6에서. 이 단백질의 정품 subplastidial 지역화에 대 한 액세스를 얻으려면, 따라서 매우 순수한 subplastidial 분수 (봉투 막, 기질, 및 thylakoids)에서 시작 필수적 이다. 이러한 맥락에서 현재 프로토콜의 목표는 애기 단풍 차동 centrifugations 및 연속 Percoll 그라디언트를 사용 하 여에서 그대로 엽록체를 정화 하 고 그들을 충분치 3 불연속 자당 기온 변화도 사용 하 여 하위 구획 (즉, 봉투, 기질, 및 thylakoids) 여기 설명 하는 방법을 다양 한 엽록체 하위 구획을 연결 하는 마커를 사용 하 여 순화 된 하위 organellar 분수의 순도 평가 하기 위해 또한 설명 합니다. 이 프로토콜은 immunoblotting를 사용 하 여 단백질의 subplastidial 지역화와 질량 분석 (MS)를 사용 하 여 순화 된 분수의 추가 분석을 위해 귀중 한-proteomic 연구를 기반으로.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6977.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#949;-amino caproic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6979.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9286.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>USB</td>
			<td>US12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel staining medium</td>
			<td>Clini-sciences</td>
			<td>GEN-QC-STAIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>528151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fat-free milk powder</td>
			<td>R&#233;gilait</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H/1150/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH pellets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.05012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>480507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMA1 antibody</td>
			<td></td>
			<td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KARI antibody</td>
			<td></td>
			<td>Ferro et al, 2010</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCP antibody</td>
			<td></td>
			<td>Vallon et al, 1991</td>
			<td>Used at a 1:25,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-coumaric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol (3-aminophalhydrazin)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO).</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large (30 cm &#215; 45 cm) plastic cases</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>162135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. thaliana seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Around 30 mg of seeds for a whole case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost &#34;Floragard&#34;</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>16311770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth rooms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12-h light cycle, set at 23&#176;C (day) / 18&#176;C (night) with a light intensity of 150 &#956;mol/m2/s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muslin or cheesecloth</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70116</td>
			<td>80-cm-large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon blutex 50 &#956;m aperture</td>
			<td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td>
			<td></td>
			<td>50 &#956;m aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity</td>
			<td>Waring Blender</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 &#215; 500-mL plastic bottles)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JA-20 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-20 (6 &#215; 50 mL polypropylene tubes)</td>
			<td>Sorvall instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 &#215; 50 mL polycarbonate tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor (6 &#215; 13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge (Beckman L7)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman JSE-06D18)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5415D or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>BA85, Schleicher and Schuell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>3MM, Whatman, Maidstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System for protein transfer to nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics

엽록체는 식물 세포의 주요 구성 요소. 이러한 plastids 필수 대사 산물의 합성 탄소, 유황 및 질소의 동화 등 많은 중요 한 기능을 성취 한다. 다음 세 가지 주요 하위 구획이이 세포에 의하여 이루어져 있다. 두 막이 특징인 봉투 둘러싸는 세포 기관이 고 다른 세포 구획 plastid의 통신을 제어 합니다. 스트로 마는 엽록체와 이산화탄소 탄수화물으로 변환 되는 주요 사이트의 가용성 단계입니다. Thylakoid 막 grana (평면 압축된 sac)의 구성 된 내부 막 네트워크 이며 lamellae (더 적은 조밀한 구조), 장소 oxygenic 광합성 걸립니다. 현재 프로토콜 차동 centrifugations 및 Percoll 그라데이션, 애기및 그들의 분류에서 그대로 엽록체의 사용 하 여, 3 자당 기온 변화도 사용 하 여 정화에 필요한 단계별 절차를 설명 합니다. 하위 구획 (즉, 봉투, 기질, 및 thylakoids) 이 프로토콜은 또한 다양 한 엽록체 하위 구획을 연결 하는 마커를 사용 하 여 이러한 분수의 순도 평가 하는 방법에 지침을 제공 합니다. 여기에 설명 된 방법은 subplastidial 단백질에 대 한 뿐만 아니라 immunoblotting을 사용 하 여 지역화에 대 한 귀중 한 subcellular subplastidial 단백질 및 다른 연구.

순화 된 엽록체 그리고 그들의 하위 구획 인 절차의 후속 단계는 그림 2에 다시 시작 됩니다. Percoll 그라데이션 (그림 2A) 깨진된 엽록체와 미토 콘 드리 아 (그라데이션의 위) 또는 핵 세포 파편 (그라데이션 아래)에서 그대로 엽록체를 구별 수 있습니다. 삼투성 충격 덕분에 Percoll 정화 세포의 파열, 후 결과 분수 자당 기온 변화도 (그림 2B)에 분리 된다. 성 부는 엽록체의 기질 자당 기온 변화도의 표면에 부동 이다. 빛 봉투 막 소포 0.6/0.93 M 자당 인터페이스에서 개별 노란 악대로 복구 됩니다. 가장 무거운 thylakoid 막 소포는 튜브의 하단에 집중. 복구 후, 세척 두 막 분수의 농도, 단백질 정량 하 고 모든 4 개의 분수의 조성은 SDS 페이지 (그림 2C) 분석. 레인은 동등한 단백질 (각 순화 된 분수의 20 µ g)에 로드 됩니다. 엽록체 포함 봉투 단백질의 1%와 스트로 마에서 나는 thylakoids에서 단백질의 50%만 알면,이 크로스-오염 정화 봉투 준비 다른 엽록체 하위 구획의 대 평가 하는 경향이 있다. 그러나,이 방법은 수 분 양의 단백질 봉투 분수 교차 오염 감지. 각 구획 (즉, 풍부한 단백질)에서 마커는 분수의 교차 오염 평가에 매우 유용 합니다. 사실, 봉투 및 thylakoid 막 분수 큰 소 단위의 RuBisCO (RBCL), 기질 (50 kDa)에서 가장 풍부한 단백질의 매우 낮은 금액을 포함 하도록 예상 된다. 깨진된 엽록체가 기질 단백질8의 손실로 인해 그대로 엽록체에서 쉽게 구분할 수 있습니다. 복잡 한 단백질 (LHCP)를 수확 하는 빛은 거의 해야 25 kDa 풍부한 thylakoid 구성 요소 (3% 미만) 봉투 막9오염. 마지막으로, 인산 triose 인산 염 translocator (TPT) 때문에 그것의 강한 농축 정제 봉투 분수에서 볼 수만 30 kDa 단백질 이다 (즉, 50 ~ 100 x) 전체 엽록체에 비교 될 때 봉투 일부에서 추출. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 엽록체 하위 구획은 일반적으로 제대로 서쪽 오 점 분석 (그림 2D) 의존 하는 모든 3 개의 하위 구획의 알려진된 표식에 대하여 지시 하는 항 체를 사용 하 여 확인 교차 오염:는 기질에서 녹는 ketol 산 reductoisomerase (카 리), 엽록체 봉투 구리 ATPase (HMA1), 그리고 복잡 한 단백질 (LHCP) 수확 thylakoid 막에서. 3 하위 구획의 교차 오염은 immunoblotting 및 질량 분석 분석9를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 기질 보통 봉투 또는 thylakoid 분수에 의해 오염 되지, 하는 동안 정화 봉투 분수 포함 thylakoid 단백질의 3%와 10% 단백질의 기질에서. 단백질 기질에서 저조한 오염 thylakoid 막 (1% 미만) 하지만 봉투 막 단백질의 3%까지를 포함 하는 thylakoids. 발생 하는 단백질의 subplastidial 지역화에 대 한 잘못 된 결론을 제한 또한 따라서 엽록체 단백질, 현재 방법의 정품 subplastidial 위치 식별에 중요 한 역할을가지고 보다 더 교차 오염.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg"> 그림 1: 엽록체 하위 구획의 대표적인 제도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg"> 그림 2: 그대로 엽록체의 정화 및 그들의 3 개의 주요 하위 Percoll 및 자당 기온 변화도 사용 하 여 구획. A. Percoll 그라데이션 부서 지 고 그대로 엽록체의 분리 허용. B. 자당 기온 변화도 기질, 봉투, 및 thylakoid 분수의 분리 허용. C. 대표 SDS 페이지 그대로 엽록체와 각 하위 구획에서 풍부한 마커를 시각화할 수 있도록 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 단백질의. 각 차선에는 단백질의 10 µ g을 포함 되어 있습니다. 분자 무게 마커: RBCL, RuBisCO (기질에 대 한 마커);의 큰 소 단위 TPT, 인산 염/triose 인산 염 translocator (봉투 표식); LHCP, 수확 하는 복잡 한 단백질 (마커는 thylakoid에 대 한) 빛. D. 각 하위 구획에서 허용 (특정 항 체를 사용 하 여) 특정 마커를 감지 하는 서쪽 오 점 실험: 엽록체 봉투 구리 ATPase HMA110, 복잡 한 단백질 LHCP는 thylakoid에서 수확 하는 빛 막11, 그리고 기질9ketol 산 reductoisomerase 카 리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

이 기술의 주요 장점은 봉투, 스트로마 또는 틸라코이드 막의 국소화에 따라 다른 역할을 하는 유사한 활동의 단백질을 구별할 수 있다는 것입니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인투쟁 합니다., 그들은 너무 오래 된 식물을 사용 하기 때문에, 너무 오래 잎을 혼합, 또는 그대로의 펠 릿을 다시 중단 하는 경우 충분히 조심 하지 않습니다., 하지만 깨지기 쉬운, 엽록체. 이 방법의 시각적 데모는 percoll 또는 자당 그라데이션 단계에서 분수의 적재 또는 복구가 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.그라데이션의 혼합 위험 때문에 다양한 엽록소 서브 분획을 교차 오염시합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 이멘 부흐낙(Imen Bouchnak)과 실내 엔지니어인 루카스 모예트(Lucas Moyet)가 시연할 것입니다. 우선, 12시간 광주기로 5주 동안 아라비도시스 식물을 재배하고 밤에는 섭씨 23도, 밤에는 18도의 가벼운 강도로 초당 평방 미터당 150 마이크로몰러를 사용하게 됩니다.다음 날, 5 리터 비커를 미리 무게와 얼음에 배치합니다. 애기독증 잎을 수확하여 토양을 따기 피하십시오. 비커의 무게를 재측정하고 조직 무게를 기록합니다.수확한 잎을 차가운 방으로 옮깁니다. 잎을 두 리터의 연삭 버퍼가 들어 있는 블렌더에 넣고 매번 2초 동안 고속3번 블렌딩하여 균질화합니다. 모슬린 의 네 층과 나일론 블루 텍스의 한 층을 여조기에 넣고 이를 필터링합니다.혼합된 잎을 모슬린과 블루 텍스 내부로 부드럽게 짜서 모든 액체를 추출합니다. 블렌더 컵에 남은 조직을 회수하고 신선한 연삭 버퍼를 사용하여 균질화 과정을 반복합니다. 4~5개의 새 모슬린 레이어를 사용하여 이전에 설명한 대로 새 비커에서 이 새로운 동형모네이트를 필터링합니다.6 개의 500 밀리리터 병에 원유 세포 추출물을 동등하게 분배합니다. 병을 얼음 위에 놓습니다. 2070 G에서 차가운 병을 원심 분리하고 섭씨 4도에서 2 분 동안.그 후, 부드럽게 상체를 폐기. 물 펌프를 사용하여 남은 수퍼네티를 흡인하고 농축 된 원유 클로로플라스트를 포함하는 펠릿을 얼음에 보관하십시오. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 병에 3 밀리리터의 세탁 매체를 추가하여 엽록소가 부서지지 않도록 미세파이펫 팁을 사용하지 않도록 하십시오.그런 다음 페인트 브러시 또는 곡선 플라스틱 주걱을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 단일 튜브에서 다시 중단된 엽록소를 수집합니다. 균질엽산염 서스펜션을 얻기 위해 튜브를 부드럽게 반전시다.시작하려면 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 준비된 6개의 퍼콜링 그라데이션 위에 엽록체 서스펜션 6밀리리터를 천천히 로드합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 13, 300 G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 그라데이션을 원심분리합니다. 물 펌프를 사용하여 부서진 엽록체와 그대로 미토콘드리아가 포함된 상위를 흡인합니다.그런 다음, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 하부에 존재하는 손상되지 않은 엽록체를 회수하고, 튜브 의 바닥에서 발견되는 핵및 세포 파편을 그대로 엽록체와 함께 흡인시키지 않도록 주의하십시오. 그대로 엽록소 액수 서스펜션을 세척 매체로 3~4배 희석합니다. SDS 페이지와 서양 얼룩에 의해 추가 분석을 위해 약 10 밀리리터의 손상되지 않은 엽록소 분획을 보관하십시오.2070 G의 원심 분리기와 섭씨 4도2분. 그 후, 부드럽게 상체를 폐기. 물 펌프를 사용하여 남은 수퍼네티를 흡인하고 농축 된 원유 엽록물이 들어있는 펠릿을 얼음위에 보관하십시오.정제된 그대로 엽록체를 lyse하려면 프로테아제 억제제가 포함된 저혈압 배지에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다시 매달린 엽록체를 10 밀리리터 팔콘 튜브로 옮기습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자당 그라데이션을 준비합니다.연동 펌프를 사용하여 미리 형성된 자당 그라데이션 의 상단에 용액 엽록체 3 밀리리터를 천천히 로드합니다. 저혈압 중간 버퍼를 사용하여 튜브 쌍의 균형을 맞추고, 1시간 동안 70, 000 G 및 섭씨 4도에서 그라데이션을 매우 원심분리합니다. 단백질 농도의 결정에 사용되는 용해성 기질 단백질의 알리쿼트복용.다음으로, 물 펌프를 사용하여 그라데이션의 나머지 상층을 노란색 대역까지 흡인시합니다. 파이펫을 사용하여 봉투인 노란색 밴드를 검색합니다. 봉투를 하나의 튜브로 당깁니다.그런 다음 그라데이션의 나머지 단계를 틸라코이드 펠릿까지 제거합니다. 프로테아제 억제제로 멤브레인 세척 완충제에서 틸라코이드 펠릿을 다시 중단합니다. 틸라코이드 서스펜션을 희석하고 세척 매체로 3~4배 봉투를 희석하여 최종 부피를 10밀리리터로 조정합니다.1시간 동안 110, 000G 및 섭씨 4도에서 멤브레인 세척 완충제와 초원심분리기의 튜브 쌍을 균형 있게 조정합니다. 그 후 워터 펌프를 사용하여 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 봉투 펠릿에 약 100 마이크로리터의 멤브레인 세척 버퍼를 넣습니다.그런 다음, 틸라코이드 튜브에서 상체를 흡인. 멤브레인 세척 버퍼의 세 밀리리터에서 틸라코이드 펠릿을 다시 중단합니다. 추가 실험에 사용하기 위해 3개의 정제된 하위 구획을 액체 질소에 보관합니다.멤브레인 분획이 회수, 세척 및 농축된 후, SDS-Page는 단백질을 정량화하고 4개의 분획의 조성물을 분석하는 데 사용됩니다. 스트로마에서 가장 풍부한 단백질은 RBCL이며, 대표적인 결과는 예상되는 결과를 나타내며, 이 단백질의 큰 서브유닛 중 거의 틸라코이드 및 봉투 막 분획이 포함되어 있지 않다는 것을 나타낸다. 가벼운 수확 복합 단백질은 봉투 막을 거의 오염시켜야 하는 풍부한 틸라코이드 성분입니다.마지막으로, 인산삼염 트랜스로케이터는 전체 엽록체 추출물과 비교할 때 봉투 분획에 강한 농축으로 인해 정제된 봉투 분획에서만 볼 수 있다. 3개의 하위 구획의 교차 오염, 기질로부터의 수용성 케톨산 재유도, 클로로푸스 봉투 구리 ATPase 및 틸라코이드 멤브레인에서의 가벼운 수확 복합 단백질은 면역 블로팅 및 질량 분광법 분석을 모두 사용하여 정량화될 수 있다. 스트로마는 일반적으로 봉투 또는 틸라코이드 분획에 의해 오염되지 않지만, 정제 된 봉투 분수는 3 % 틸라코이드 단백질과 스트로마에서 단백질의 최대 10 %를 함유하고 있습니다.틸라코이드는 스트로마의 단백질에 의해 오염되지 않지만 봉투 막 단백질의 최대 3%를 함유하고 있습니다. 엽록소는 탄소, 황 및 질소의 동화뿐만 아니라 필수 대사 산물의 합성과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 엽록소 생리학을 제어하는 새로운 규제 메커니즘을 해독하기 위해서는 엽록소 세포 단백질의 절립 지역화를 정의하는 것이 초표적 연구에 매우 중요합니다.엽록체에는 여러 하위 구획이 포함되어 있습니다. 이 방법은 특정 엽록과 단백질이 세포기관 내에 있는 곳과 같은 엽록체 필드의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 정제 된 분수로 프로테아 저항을 송금하기 위해 4도에서 엽록소 절연 단계를 모두 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, lascare proteomic 접근과 같은 다른 방법은 플라스티드 하위 구획값의 프로테오메의 조성 및 역학과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 식물 생리학 분야의 연구원들이 플라스티드 하위 구획 내에서 확인된 후보 단백질의 표적 분석을 사용하여 엽록세포 생체 발생 및 기능의 여러 측면을 탐구하는 길을 열었습니다. 프로테아제 억제제와 같은 특정 화합물에 대한 부피 블렌더, 액체 질소를 사용하려면 특별한 주의가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야합니다.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...