Name: preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et felles PhD fellesskap til IB fra INRA anlegget biologi og avl divisjon og Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Vi ønsker også å erkjenne ANR prosjektet ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) for antistoffer mot LHCP og Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) for antistoffer mot KARI.

1. utarbeidelse av buffere, lager løsninger og graderinger
<ol><li>Klargjør følgende lager løsninger som kan lagres til 6 måneder til 4 ° C.<ol>
<li>Forberede 1 L Tricine buffer (1 M, pH 8.4) og Tricine buffer (1 M, pH 7.6). Justere pH ved å legge til KOH pellets.</li>
		<li>Forberede 1 L ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA, 0,5 M, pH 8) og 3-(N-morpholino) propan sulfonsyre (MOPPER) buffer (1 M, pH 7,8). Justere pH ved å legge NaOH pellets.</li>
		<li>Forberede 50 mL av MgCl2 (1 M).</li>
		<li>Forberede 50 mL av protease hemmere løsninger: phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF i isopropanol, 100 mM), benzamidine hydroklorid hydrat (100 mM), og ε-caproic aminosyre (50 mM). Merk: PMSF og caproic aminosyre er stabil i løsning for måneder på 4 ° C, benzamidine løsning bør lagres ved 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede følgende dagen før eksperimentet og lagre alle løsninger på 4 ° C.<ol>
<li>Forberede 4 L sliping middels pH 8.4 som inneholder Tricine-KOH (20 mM, pH 8.4) sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) og NaHCO3 (10 mM). Justere pH ved å legge NaOH pellets. Legg bovin serum albumin (BSA) på 0,1% (w/v) like før bruk og bland godt.</li>
		<li>Forberede 500 mL vaske middels (2 x) pH 7.6 som inneholder Tricine-KOH (20 mM, pH 7.6) sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) og EDTA (2,5). Justere pH ved å legge NaOH pellets. Fortynne slik løsning etter forberedelse av Percoll gradert løsning å få vask medium (1 x).</li>
		<li>Forberede 200 mL Percoll gradert løsning chloroplast rensing ved å blande Percoll med vask medium (2 x) med samme volum å få en endelig løsning på 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitol.</li>
		<li>Forberede 50 mL av sukrose løsninger chloroplast fraksjoneres ved å blande MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) og ulike konsentrasjoner av sukrose (0,3 M, 0.6 M og 0.93 M).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør følgende graderinger og buffere før du starter eksperimentet.<ol>
<li>Forberede seks rør Percoll graderinger (hver inneholder 30 mL av en 50% Percoll / 0,4 M sorbitol) med sentrifugering 38,700 x g i 55 min på 4 ° C. Holde bremsen av for å hindre blanding av graderingene. Etter sentrifugering, lagre rør som inneholder preformed graderingene i et kaldt rom før bruk.</li>
		<li>Forberede fire rør av sukrose graderinger, med hver forløpning dannet av tre følgende sukrose lag: 3 mL 0.93 M, 2,5 mL 0.6 M og 2 mL 0,3 M sukrose. Nøye overlegg hvert lag, bruker en peristaltiske pumpe starter med 0.93 M nederst og etterbehandling med 0,3 M øverst.</li>
		<li>Forberede 50 mL av hypotonisk medium chloroplast lysis som inneholder MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, definert i isopropanol), benzamidine hydroklorid hydrat (1 mM) og ε-caproic aminosyre (0,5 mM). Lagre bufferen på is til bruk.</li>
		<li>Forberede 50 mL av membran vaske bufferen som inneholder MOPPER (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), benzamidine hydroklorid hydrat (1 mM) og ε-caproic aminosyre (0,5 mM). Lagre bufferen på is til bruk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vekst og høsting av Arabidopsis blader
<ol><li>For veksten av Arabidopsis planter, forberede 4 store plast panner (for en totalt overflate 0,5 til 1 m2) Arabidopsis planter ved å så 30 mg av frø i hver panne. Vokse Arabidopsis planter for fem uker 12-h lyset sykle på 23 ° C (dag) / 18 ° C (natt) med lav intensitet av 150 μM m-2 s-1.</li>
	<li>Inkuber planter i et mørkt og kaldt rom (4 ° C) over natten før (for å redusere mengden av stivelse granulater i chloroplasts).</li>
	<li>Pre-veie en 1 liters kanne og deretter plassere den på is før høsting av blad materiale.</li>
	<li>Høste Arabidopsis blader ved å unngå jord (kompost). Nytt veie begeret og registrere vev vekten. Merk: 400 til 500 g blad materiale ventet fra fire panner.</li>
	<li>Homogenize blader i et kaldt rom med 2 L sliping buffer (Legg BSA før bruk) tre ganger / 2 s hver gang, i en blender på høy hastighet.</li>
	<li>Filtrere homogenate i et kaldt rom 4 lag av musselin og ett lag nylon blutex. Forsiktig presse homogenate bladene inne musselin/nylon blutex å ekstra alle flytende.</li>
	<li>Gjenopprette gjenværende vevet i blender cup for en andre utvinning. Gjenta 2.5 og 2.6 med 2 L sliping medium og nye 4-5 lag av musselin (i et kaldt rom).</li>
</ol>3. rensing av råolje Chloroplasts bruker differensial sentrifugering
<ol><li>Like distribuere råolje celle ekstrakt i seks 500 mL flasker og plasser flaskene på is før sentrifugering. Sentrifuger i 2 minutter så snart den maksimale hastigheten (2,070 x g) er nådd (maksimal akselerasjon og brems på, 4 ° C).</li>
	<li>Forsiktig kaste nedbryting.</li>
	<li>Sug opp gjenværende nedbryting med vann og holde pellets med konsentrert rå chloroplasts på is.</li>
	<li>Forsiktig resuspend pellets ved å legge en minimal mengde vask medium (1 x) (siste volumet av de kombinerte chloroplast suspensjoner = 36 mL) ved hjelp av en pensel eller buet plast spatula. Bruk en 10 mL Pipetter 3 mL vaske medium i hver flaske. Merk: Ikke bruk Pipetter med veldig fine tips for å unngå brudd på chloroplasts. Alternativt, kuttet blå spissen av en Pipetter med et barberblad generere større hull.</li>
	<li>Samle de resuspended chloroplasts i en tube ved hjelp av en 10 mL pipetter. Bland forsiktig ved å snu røret for å få en homogen suspensjon før lasting på Percoll grader.</li>
</ol>4. rensing av intakt Chloroplasts på kontinuerlig Percoll gradering
<ol><li>Sakte laste 6 mL av chloroplast suspensjon på hver av seks Percoll forløpninger ved å bruke en 10 mL Pipetter for å unngå brudd på chloroplasts.</li>
	<li>Sentrifuge graderingene i 10 min 13,300 x g, 4 ° C med en svingende bøtte rotor. Merk: Akselerasjon skal være treg, og brems bør kobles (brems av eller langsom retardasjon) for å hindre blanding av den Percoll forløpninger.</li>
	<li>Sug opp den øvre fasen som inneholder brutte chloroplasts og intakt mitokondrier bruker en vannpumpe, og deretter hente intakt chloroplasts i nedre fase (den mørke-grønne bredbånd) med en 10 mL pipetter. Pass på at du ikke Sug opp kjerner og celle rusk (funnet på bunnen av røret) med intakt chloroplasts (figur 2A).</li>
	<li>Fortynne 3-4-fold intakt chloroplast suspensjon med vask buffer (1 x). Sentrifuger i 2 minutter så snart den maksimale hastigheten (2,070 x g, 4 ° C) er nådd (maksimal akselerasjon og brems på).</li>
	<li>Forsiktig kaste nedbryting.</li>
	<li>Helt Sug opp gjenværende nedbryting med vann og holde pellets av konsentrert intakt chloroplasts på is.</li>
	<li>Før chloroplast lyse, holde en aliquot av intakt chloroplast fraksjon i ca 1 mL av vaske medium (1 x) for videre analyser ved hjelp av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel gelelektroforese (SDS-side) og vestlige blotting. Holde en liten aliquot av disse intakt chloroplasts for fastsettelse av protein konsentrasjon. Lagre den intakte chloroplast fraksjon i flytende nitrogen for videre studier.</li>
</ol>5. lysis av intakt Chloroplasts bruker hypotonisk Buffer og rensing Chloroplast sub rom på usammenhengende sukrose graderinger
<ol><li>Lyse renset intakt chloroplasts ved resuspending pellet i hypotonisk medium som inneholder proteasehemmere (det siste bindet ikke bør overskride 12 mL). Merk: Dette trinnet, bruk av Pipetter med fine tips (blå tips) er mulig fordi intactness av chloroplasts er mer viktig (pipettering chloroplasts opp og ned som pellets ikke er helt resuspended). Arabidopsis chloroplasts er svært skjøre (i forhold til ert chloroplasts, for eksempel) og deres lysis er nesten umiddelbar etter inkubasjon i hypotonisk medium.</li>
	<li>Sakte laste 3 mL lysed chloroplasts på hver preformed sukrose forløpninger ved å bruke en peristaltiske pumpe.</li>
	<li>Ultracentrifuge graderingene 1t (70.000 x g, 4 ° C). Setningspar av rør med hypotonisk middels buffer før sentrifugering.</li>
	<li>Nøye gjenopprette løselig stromal proteiner ved pipettering den øvre fasen av gradient (3 mL fra hver forløpning) (figur 2B). Ta en aliquot for fastsettelse av protein konsentrasjon7. Lagre stroma i flytende nitrogen for videre studier.</li>
	<li>Sug opp den gjenværende øvre fasen av hver forløpning til det gule båndet ved hjelp av en vannpumpe.</li>
	<li>Hente gule bandet (omsluttningskurven) med en Pipetter (ca 1 mL fra hver forløpning). Basseng konvoluttene i en tube.</li>
	<li>Fjern den gjenværende fasen av hver forløpning opptil thylakoid pellets med en vannpumpe.</li>
</ol>6. vask og konsentrasjon av Thylakoid og konvolutt membran systemer
<ol><li>Resuspend thylakoid pellets (grønn pellets) i et minimum volum (2 mL) på membran vaske bufferen (1 x) (med proteasehemmere).</li>
	<li>Fortynne av konvolutten og thylakoid suspensjon 3-4-fold i membranen vask medium (Juster volumet til 10 mL) og ultracentrifuge 1t (110 000 x g, 4 ° C). Setningspar av rør med membran vaske bufferen før sentrifugering.</li>
	<li>Nøye Sug opp supernatants med vann.</li>
	<li>Legge til ca 100 µL av membran vaske bufferen (med proteasehemmere) til konvolutt-pellets. Ta en aliquot for fastsettelse av protein konsentrasjon7. Lagre renset konvolutt membran forberedelse i flytende nitrogen.</li>
	<li>Resuspend thylakoids pellets i 3 mL membran vaske bufferen (med proteasehemmere). Ta en aliquot for fastsettelse av protein konsentrasjon7. Lagre thylakoid membran brøk i flytende nitrogen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+theory+for+organelle+origins.">Endosymbiotic theory for organelle origins.</a> Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).</li><li>Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+evolution.">Plastid evolution.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).</li><li>Linka, N., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+metabolite+transporters+in+plants.">Intracellular metabolite transporters in plants.</a> Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).</li><li>Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+envelope+membranes:+a+dynamic+interface+between+plastids+and+the+cytosol.">Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol.</a> Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Agrawal, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics:+collaborating+for+optimal+cell+function.">Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function.</a> Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).</li><li>Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[40]+Electrophoretic+analysis+of+chloroplast+proteins.">[40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins.</a> Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+intact+chloroplasts+from+Arabidopsis+and+spinach+leaves+by+isopycnic+centrifugation.">Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2008).</li><li>Ferro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT_CHLORO,+a+comprehensive+chloroplast+proteome+database+with+subplastidial+localization+and+curated+information+on+envelope+proteins.">AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).</li><li>Seigneurin-Berny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMA1,+a+new+Cu-ATPase+of+the+chloroplast+envelope,+is+essential+for+growth+under+adverse+light+conditions.">HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).</li><li>Vallon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+redistribution+of+cytochrome+b6/f+complexes+along+thylakoid+membranes+upon+state+transitions.">Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).</li><li>Douce, R. J. J., Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+chloroplast.">Purification of the chloroplast.</a> Methods in Chloroplast Molecular Biology. , 239-256 (1982).</li><li>Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+the+isolation+of+intact+chloroplasts+of+high+photosynthetic+capacity.">An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).</li><li>Kunst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+physiologically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis.">Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Protein+Import+into+Chloroplasts+Isolated+from+Stressed+Plants.">Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll-purified+and+photosynthetically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).</li><li>Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+chloroplasts+and+their+sub-organellar+compartments.">Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments.</a> Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).</li><li>Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , (1990).</li><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+membrane+fractions+enriched+in+outer+and+inner+envelope+membranes+from+spinach+chloroplasts.+II.+Biochemical+characterization.">Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization.</a> Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).</li><li>Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+and+protein-kinase+activity+in+isolated+envelopes+of+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 166 (3), 394-400 (1985).</li><li>Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Membrane+Fractions+(Envelope,+Thylakoids,+Grana,+and+Stroma+Lamellae)+from+Arabidopsis+Chloroplasts+for+Quantitative+Proteomic+Investigations+and+Other+Studies.">Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).</li><li>Tomizioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+thylakoid+sub-compartments+using+a+mass+spectrometry-based+approach.">Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).</li><li>Spicher, L., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+of+plastoglobules+(plastid+lipid+droplets)+in+vitamin+K1+and+E+metabolism.">Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Denne artikkel skal detalj trinn protokollen som brukes til å rense chloroplasts (og deres sub deler) fra Arabidopsis thaliana. Siden tilgjengeligheten av sin fullstendig Genova orden nesten to tiår siden, og store samlinger av innsetting mutanter gjort tilgjengelig for samfunnet, er Arabidopsis nå allment akseptert som. Men mens dette anlegget var perfekt tilpasset for genetisk tilnærminger, plante forskere måtte tilpasse biokjemiske og fysiologiske verktøy til denne nye modellen. Protokoller slik at for å rense Fotosyntetisk aktiv chloroplasts bladene av veletablert biokjemiske modeller som spinat12 eller ert13 dermed måtte tilpasses. Den første metoden som beskriver rensing av Arabidopsis chloroplasts ble utgitt i 199814, like før utgivelsen av det Arabidopsis Genova orden. Flere år senere, enkle metoder for å isolere Arabidopsis chloroplasts kompatibel med studier å analysere i vitro import av proteiner i renset organeller ble gjort tilgjengelig15,16. Men tillater disse metodene ikke for å kombinere høy renhet og bevaring av fotosynteseaktiviteten aktivitet av de renset chloroplasts. Nylig ble17, en rask metode etablert, som baserer seg på bruk av Percoll graderinger, og tillater for å beholde nesten 90% av fotosyntesen rate målt i Start bladene av Arabidopsis.
Protokollen beskrevet her kan rense Arabidopsis chloroplasts på et utmerket nivå av renhet. Faktisk immunologiske påvisning av forurensninger fra andre cellen avdelinger vist at renset organeller er blottet for mitokondrie og plasma membranen markører9,10. Denne protokollen ble også effektivt å rense chloroplasts flere Arabidopsis ecotypes18, som Columbia (Kol) eller Wassilewskija (WS), dvs. ecotypes som ble brukt for genomet eller uttrykt sekvens tags (interesser) sekvenser prosjekter men også å generere T-DNA innsetting mutanter i Arabidopsis. Med andre ord, når Proteomikk studier har utført, er nåværende protokollen kompatibel med disse to referanse ecotypes fra Arabidopsis. Til slutt, avkastningen av chloroplasts bruker stede protokollen er lik den oppnådd når du starter fra spinat eller ert blader (dvs. 3%, målt fra klorofyll innholdet i Percoll-renset chloroplast sammenlignet med totalen klorofyll beløp i starter blader). I form av proteiner ligger avkastningen nær 50 mg chloroplast proteiner, når organeller er renset fra 500 g 5-uke-gamle Arabidopsis blader.
Slike en god avkastning (og chloroplast integritet), en bør imidlertid vier spesiell oppmerksomhet til flere trinn når du bruker stede protokollen. Chloroplast i Arabidopsis er en ekstremt skjøre struktur (dette ikke er tilfelle for ert chloroplasts, for eksempel). Spesiell oppmerksomhet er derfor nødvendig for å unngå store ruptur av organeller under rensing. Antallet og størrelsen av stivelse granulater i chloroplasts er avgjørende for utarbeidelse av intakt chloroplasts. Faktisk brytes chloroplasts inneholder store stivelse korn vanligvis under første differensial centrifugations skritt å konsentrere råolje chloroplast fraksjoner12. Derfor bør plantene holdes over natten i et mørkt og kaldt rom (4 ° C) før eksperimentet å redusere mengden av stivelse.
Nye brukere av nåværende protokollen kan være fristet til å starte fra større mengder blad materiale (stor rosetter fra gamle Arabidopsis planter med større blader) prøver å forbedre utvinning av renset chloroplasts. Men i våre hender, starter fra små blader (5-uke-gamle) er det beste kompromisset for å kombinere avkastning, renhet og integriteten til renset organeller. For gammel bladene er faktisk svært beriket i Fenoliske forbindelser som ble vist å ha en negativ innvirkning på chloroplast integritet19.
Endelig, det første ekstraksjon trinnet (sliping av vev) er et kritisk steg. Blending prosessen skal begrenses til sekundene. Som nevnt ovenfor, kan nye brukere være fristet bruke lengre blander, dermed forventer sterkt forbedre avkastningen av renset organeller. Men hvis lengre blending effektivt slipper mer materiale fra blader, vises det at andelen brutt chloroplasts raskt øker i råolje celle utdrag. Denne høy andel av knust å intakt chloroplasts i medium, ytterligere rensing trinn (separasjon på Percoll grader) påvirkes sterkt og avkastningen av rensing er uventet lavere.
Tilgjengeligheten av bestemte protokoller å rense organeller har tillatt en rekke høy gjennomstrømning Proteomikk-baserte eksperimenter gjennomføres på chloroplast prøver. Disse dataene ble gjort tilgjengelig i flere offentlige databaser6, altså til biologer innen en nøyaktig subcellular (og subplastidial) lokalisering for mange chloroplast proteiner. Dette var særlig for konvolutt proteiner hvis identitet og sted forble stort sett ukjent før disse analysene, siden konvolutt membraner representerer en mindre chloroplast komponent (1-2% av chloroplast proteiner) mens du spiller en nøkkelrolle i chloroplast metabolisme og biogenesis5,20. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, vi nylig analysert sammensetningen av de tre viktigste chloroplast avdelinger fra Arabidopsis (dvs. stroma, thylakoids og konvolutt membran systemet)9. Basert på en semi kvantitative Proteomikk tilnærming (spectral teller), kunne vi vurdere partisjonering av hundrevis av proteiner i disse tre chloroplast rom.
Mens stede protokollen tillater for å rense de tre viktigste avdelinger av chloroplast fra Arabidopsis, er det også mulig å skille flere sub avdelinger i chloroplast. Konvolutt membran systemet er faktisk laget av indre og ytre konvolutt membraner (figur 1). Imidlertid etter beste overbevisning, en metode for å rense indre og ytre konvolutt membraner fra Arabidopsis chloroplasts gjenstår å bli etablert. Indre og ytre konvolutt membraner kan bli renset fra spinat21 eller ert22 chloroplasts. Den viktigste begrensningen av Arabidopsis resultater mest fra begrensende mengder starter materiale. Starter fra 500 g Arabidopsis blader (som allerede krever 1 m2 overflaten i en vekst kammer) kan rense 100 µg konvolutt proteiner. På den annen side, er det lett å starte med 5-10 kg spinat blader fra markedet, å rense stor mengde chloroplasts8 og til slutt med en avkastning på 3 til 10 mg konvolutt proteiner fra dette materialet.
Det samme gjelder for thylakoid sub avdelinger. Faktisk thylakoids er laget av lys membran blemmer (lamellae) og tett strukturer (grana) (figur 1). Bestemte protokoller er tilgjengelige å skille disse to avdelinger i Arabidopsis23,24. Igjen, basert på en kvantitativ Proteomikk analyse, vi nylig inventoried proteiner i disse to sub deler24. Disse tilnærmingene, sammen med en grundig undersøkelse av litteraturen, tillatt validering, eller foreslår hypoteser for, subplastidial plasseringen av hundrevis av thylakoid proteiner. Det er imidlertid viktig å merke seg at flere membran microdomains finnes i buet margene på thylakoids. Disse lipoprotein sub rom, eller plastoglobules, er permanent koblet til thylakoid membraner og inneholde et bestemt sett med proteiner25. Bruker stede protokollen, er det derfor ikke mulig å skille disse spesifikke proteiner fra andre thylakoid komponenter.
Noen ekte (kjent) konvolutt, stroma eller thylakoid komponenter er fortsatt mangler fra listen over oppdagede proteiner. Sammen med målrettet biokjemiske og immunologiske analyser, vil kontinuerlig forbedring av MS følsomhet være til stor hjelp å besøke chloroplast innholdet mot et komplett repertoar av sammensetningen av dens forskjellige sub avdelinger.

Chloroplasts er hovedkomponentene i anlegget celler. De er avledet fra en cyanobacterial stamfar som har gjennomgått en endosymbiosis og til slutt utviklet seg som en organelle under utviklingen1,2. Slike organeller inneholder tre hovedrommene (figur 1). Konvolutt-systemet består av en indre og en ytre membraner rundt organeller. Dobbel membran systemet inneholder ulike enzymer som er involvert i metabolismen av lipider og pigmenter og er hovedsakelig viet til kontroll av kommunikasjonen mellom plastids og stoffer. Den inneholder ulike transportsystemer som tillater import av kjernefysisk-kodet proteiner og utveksling av ioner og metabolitter mellom stoffer og chloroplast dermed regulerer viktige metabolske funksjoner av anlegget celle3,4 . Stroma, løselig fasen av chloroplast, inneholder enzymer av Calvin syklusen (CO2 assimilering), syntese av ulike metabolitter inkludert aminosyrer og vitaminer og den transkripsjon og oversettelse machineries av plastid. Thylakoid membranen er et allment organisert interne membran nettverk hvor lett fasen av fotosyntese finner sted. Dermed er chloroplasts stedet hvor viktige metabolske veier holdes5.
For å tyde nye regulatoriske mekanismer som styrer chloroplast dynamikk og fysiologi, er definere den sub-plastidial lokaliseringen av chloroplast proteiner derfor avgjørende å støtte målrettede studier tar sikte på å bedre forstå proteiner funksjoner i modellen organismer6. For å få tilgang til den ekte subplastidial lokaliseringen av disse proteinene, er det derfor viktig å starte fra svært ren subplastidial brøker (konvolutt membraner, stroma og thylakoids). I denne sammenheng, målet med nåværende protokollen er å rense intakt chloroplasts Arabidopsis bladene differensial centrifugations og kontinuerlig Percoll graderinger og smuldre vekk dem med usammenhengende sukrose graderinger, i tre sub rom (dvs. konvolutt, stroma og thylakoids). Metoden beskrevet her likeledes skaffer instruksjoner å vurdere renheten av renset sub-organellar brøker med markører knyttet til de ulike chloroplast sub-avdelinger. Denne protokollen er verdifulle subplastidial lokalisering av proteiner med immunoblotting og for videre analyse av renset fraksjoner bruker massespektrometri (MS)-basert proteomic studier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6977.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#949;-amino caproic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6979.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9286.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>USB</td>
			<td>US12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel staining medium</td>
			<td>Clini-sciences</td>
			<td>GEN-QC-STAIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>528151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fat-free milk powder</td>
			<td>R&#233;gilait</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H/1150/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH pellets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.05012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>480507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMA1 antibody</td>
			<td></td>
			<td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KARI antibody</td>
			<td></td>
			<td>Ferro et al, 2010</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCP antibody</td>
			<td></td>
			<td>Vallon et al, 1991</td>
			<td>Used at a 1:25,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-coumaric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol (3-aminophalhydrazin)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO).</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large (30 cm &#215; 45 cm) plastic cases</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>162135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. thaliana seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Around 30 mg of seeds for a whole case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost &#34;Floragard&#34;</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>16311770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth rooms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12-h light cycle, set at 23&#176;C (day) / 18&#176;C (night) with a light intensity of 150 &#956;mol/m2/s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muslin or cheesecloth</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70116</td>
			<td>80-cm-large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon blutex 50 &#956;m aperture</td>
			<td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td>
			<td></td>
			<td>50 &#956;m aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity</td>
			<td>Waring Blender</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 &#215; 500-mL plastic bottles)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JA-20 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-20 (6 &#215; 50 mL polypropylene tubes)</td>
			<td>Sorvall instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 &#215; 50 mL polycarbonate tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor (6 &#215; 13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge (Beckman L7)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman JSE-06D18)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5415D or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>BA85, Schleicher and Schuell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>3MM, Whatman, Maidstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System for protein transfer to nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics

Chloroplasts er hovedkomponentene i anlegget celler. Slike plastids oppfylle mange viktige funksjoner, som assimilering av karbon, svovel og nitrogen samt syntese av essensielle metabolitter. Disse organeller består av de følgende tre viktige sub avdelinger. Konvolutten, preget av to membraner, omgir organeller og kontrollerer kommunikasjonen av plastid med andre cellen avdelinger. Stroma er løselig fase av chloroplast og hovedområde der karbondioksid omdannes til karbohydrater. Thylakoid membran er den interne membran nettverket bestående av grana (flat komprimert sacs) og lamellae (mindre tett strukturer), der oxygenic fotosyntese tar sted. Nåværende protokollen beskriver trinnvise fremgangsmåter kreves for rensing, bruker differensial centrifugations og Percoll graderinger, av intakt chloroplasts fra Arabidopsis, og deres fraksjoneres, bruke sukrose graderinger, i tre sub rom (dvs. konvolutt, stroma og thylakoids). Denne protokollen gir også instruksjoner om hvordan å vurdere renheten av disse fraksjoner med markører knyttet til de ulike chloroplast sub-avdelinger. Metoden beskrevet her er verdifull subplastidial lokalisering av proteiner ved hjelp av immunoblotting, men også for subcellular og subplastidial Proteomikk og andre studier.

Etterfølgende trinnene av fremgangsmåten renset chloroplast og deres sub rom er gjenopptatt i figur 2. Percoll gradient (figur 2A) kan skille intakt chloroplasts fra ødelagte chloroplast og mitokondrier (øverst på graderingen) eller kjerner og celle rusk (nederst på graderingen). Etter brudd på Percoll-renset organeller takket være en osmotisk sjokk skilles de resulterende fraksjonene på sukrose gradering (figur 2B). Stroma (løselig del av chloroplast) flyter på overflaten av sukrose graderingen. Lys konvolutt membran blemmer gjenopprettes som en diskret gule band på 0,6/0.93 M sukrose grensesnittet. De tyngste thylakoid membraner blemmer er konsentrert på bunnen av røret. Etter utvinning, vask og konsentrasjonen av to membran fraksjoner, proteiner er kvantifisert og sammensetningen av alle fire fraksjoner analyseres på en SDS-siden (figur 2C). Banene er lastet på en lik protein basis (20 µg hver renset brøkdel). Å vite at chloroplasts inneholder bare 1% av konvolutt proteiner og 50% av proteiner fra stroma eller fra thylakoids, pleier dette å overvurdere krysskontaminering av renset konvolutt preparater med andre chloroplast sub-avdelinger. Men tillater denne metoden for å oppdage minutt mengder proteiner kryss-forurensende konvolutt brøken. Markører fra hvert kammer (dvs. rikelig proteiner) er svært nyttig i å vurdere krysskontaminering av fraksjoner. Faktisk forventes thylakoid og konvolutt membran fraksjoner å inneholde svært små mengder av den store delenhet av RuBisCO (RBCL), det mest rikelig proteinet fra stroma (50 kDa). Ødelagt chloroplasts kan lett skilles fra intakt chloroplast på grunn av denne stromal protein8. Lyset høsting komplekse proteiner (LHCP) er 25-kDa rikelig thylakoid komponenter som skal knapt (mindre enn 3%) forurense konvolutt membraner9. Til slutt, fosfat-triose-fosfat translocator (TPT) er et 30-kDa protein som bare vises i renset konvolutt fraksjonen på grunn av en sterk berikelse (dvs. 50 til 100 x) i konvolutten fraksjonen sammenlignet med hele chloroplast trekker ut. Med metoden beskrevet her chloroplast sub rom er generelt dårlig tvers forurenset som bruke western blot analyser (figur 2D) avhengig av antistoffer rettet mot kjente markører av alle tre sub avdelinger: den løselig ketol-syre reductoisomerase (KARI) fra stroma, chloroplast konvolutten kobber ATPase (HMA1), og lyset høsting komplekse proteiner (LHCP) fra thylakoid membraner. Krysskontaminering av tre sub seksjonene kan kvantifiseres bruker både immunoblotting og masse massespektrometri analyser9. Mens stroma vanligvis ikke er forurenset av konvolutten eller thylakoid fraksjoner, renset konvolutt fraksjoner inneholde 3% av thylakoid proteiner og opptil 10% av proteiner fra stroma. Proteiner fra stroma forurense dårlig thylakoid membraner (mindre enn 1%), men thylakoids inneholder opp til 3% av konvolutten membran proteiner. Mer enn har en avgjørende rolle i å identifisere hvor ekte subplastidial chloroplast proteiner, metoden finnes dermed begrenser også feilaktige konklusjoner om subplastidial lokalisering av proteiner som krysser forurensing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg"> Figur 1: representant ordningen med chloroplast sub avdelinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg"> Figur 2: rensing av intakt chloroplasts og deres tre viktigste sub compartments bruker Percoll og sukrose graderinger. A. Percoll gradering slik at separasjon av knust og intakt chloroplasts. B. sukrose gradering slik at skillet mellom stroma, konvolutt og thylakoid fraksjoner. C. representant SDS-PAGE proteiner fra intakt chloroplasts og deres tre sub hovedrommene tillater for å visualisere rikelig markører fra hvert sub kammer. Hver fil inneholder 10 µg proteiner. Molekylvekt markører: RBCL, store delenhet i RuBisCO (markør for stroma); TPT, fosfat/triose-fosfat translocator (markør for konvolutten); LHCP, lette høsting komplekse proteiner (markør for thylakoid). D. Western blot eksperimenter tillater for å oppdage bestemte markører (med spesifikke antistoffer) fra hver sub avdeling: chloroplast konvolutt kobber ATPase HMA110, lyset høsting komplekse proteiner LHCP fra thylakoid membraner11og ketol-syre reductoisomerase KARI fra stroma9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Her vi beskriver en metode for å rense intakt chloroplasts fra Arabidopsis blader og deres tre viktigste sub avdelinger (konvolutt, stroma og thylakoids), en kombinasjon av differensial centrifugations, kontinuerlig Percoll graderinger, og usammenhengende sukrose graderinger. Metoden er nyttig for subplastidial og subcellular lokalisering av proteiner av immunoblotting og Proteomikk.

Utarbeidelse av Chloroplast sub deler fra Arabidopsis for analyse av Protein lokalisering av Immunoblotting eller Proteomikk

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater å skille proteiner av lignende aktiviteter som har forskjellige roller, avhengig av lokaliseringen i konvolutt, stroma eller thylakoid membraner. Generelt vil personer som er nye på denne metoden slite, fordi de vil bruke planter som er for gamle, blande bladet for lenge, eller vil ikke være forsiktig nok når de re-suspendere pellets av intakt, men skjøre, kloroplast. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da lasting eller gjenoppretting av brøk fra percoll eller i sukrose gradient trinn er vanskelig å lære.På grunn av risikoen for blanding av gradientene og dermed kryssforurensende de ulike kloroplast sub-fraksjoner. Å demonstrere prosedyren vil være av Imen Bouchnak, en ph.d.-student fra laboratoriet vårt og Lucas Moyet, en innendørs ingeniør. Til å begynne, vokse arabidopsis planter i fem uker med en 12 timers lyssyklus på 23 grader Celsius i dag og 18 grader Celsius om natten, med en lysintensitet på 150 mikromol per kvadratmeter per sekund.Neste dag, pre-veie en fem liters beger og deretter plassere den på is. Høst arabidopsisbladene, og sørg for å unngå å plukke jord. Vei begeret på igjen og registrer vevsvekten.Overfør høstede blader til et kaldt rom. Plasser bladene i en blender som inneholder to liter slipebuffer og homogeniser dem ved å blande ved høy hastighet tre ganger i en varighet på to sekunder hver gang. Legg fire lag musselin og ett lag nylonblå tex i en sil, og dette for å filtrere homogenatet.Klem forsiktig de blandede bladene inne i musselin og blå tex for å trekke ut all væsken. Gjenopprett det gjenværende vevet i blenderkoppen og gjenta homogeniseringsprosessen ved hjelp av fersk slipebuffer. Bruk fire til fem lag med ny musselin til å filtrere denne nye homogenatet i et nytt beger som tidligere beskrevet.Fordel råoljecelleekstraktet likt i seks 500 milliliter flasker. Legg flaskene på is. Sentrifuge de kjølte flaskene ved 2070 G og fire grader Celsius i to minutter.Etter dette, kast forsiktig overnatanten. Bruk en vannpumpe til å aspirere eventuelle gjenværende supernatant og holde pellets, som inneholder konsentrert rå kloroplast, på is. Bruk en 10 milliliter pipette, tilsett tre milliliter vaskemedium til hver flaske, og pass på at du ikke bruker fine pipettespisser for å unngå å bryte kloroplastene.Deretter bruker du en pensel eller buet plastspatel til å forsiktig suspendere pellets. Bruk en 10 milliliter pipette, samle re-suspendert kloroplaster i ett enkelt rør. Snu forsiktig røret for å oppnå en homogen kloroplastfjæring.Til å begynne med, bruk en 10 millileter pipette til å sakte laste seks milliliter av kloroplastsuspensjonen på toppen av hver av de seks forberedte percoll-gradientene. Ved hjelp av en svingende bøtterotor, sentrifuger gradientene ved 13, 300 G og fire grader Celsius i 10 minutter. Bruk en vannpumpe til å aspirere den øvre fasen, som inneholder ødelagte kloroplaster og intakte mitokondrier.Deretter bruker du en 10 milliliter pipette for å hente intakte kloroplaster tilstede i den nedre fasen, vær forsiktig så du ikke aspirerer kjernene og celleavfallene som finnes nederst på røret sammen med de intakte kloroplastene. Fortynn den intakte kloroplastfjæringen tre til fire ganger med vaskemedium. Hold ca 10 milliliter av en aliquot av intakt kloroplastfraksjon for videre analyse av SDS-Page og Western blotting.Sentrifuge ved 2070 G og fire grader Celsius i to minutter. Etter dette, kast forsiktig overnatanten. Bruk en vannpumpe til å aspirere eventuelle gjenværende supernatant og holde pellet, som inneholder konsentrerte råoljeklorplaster, på is.For å lyse de rensede intakte kloroplastene, re-suspendere pellet i hypotonisk medium som inneholder proteasehemmere. Overfør de re-suspenderte kloroplastene til et 10 milliliter falkerør. Forbered sukrosegradienten som beskrevet i tekstprotokollen.Ved hjelp av en peristaltisk pumpe, sakte laste tre milliliter av lysed kloroplaster på toppen av hver av de forhåndsdannede sukrose gradienter. Bruk hypotonisk medium buffer for å balansere par rør, og deretter ultra-sentrifuge gradienten ved 70, 000 G og fire grader Celsius i en time. Ta en aliquot av de løselige stromale proteinene som skal brukes til bestemmelse av proteinkonsentrasjonen.Deretter bruker du en vannpumpe til å aspirere den gjenværende øvre fasen av gradienten opp til det gule båndet. Bruk en pipette til å hente det gule båndet, som er konvolutten. Trekk konvoluttene inn i ett rør.Fjern deretter den gjenværende fasen av gradienten opp til thylakoidpellet. Re-suspendere thylakoid pellets i membran vaskebuffer med protease hemmere. Fortynn thylakoid suspensjon og konvolutt tre til fire ganger med vaskemediet, justere det endelige volumet til 10 milliliter.Balanse par rør med membran vaskebuffer og ultra-sentrifuge dem på 110, 000 G og fire grader Celsius i en time. Etter dette, bruk en vannpumpe til å forsiktig aspirere supernatanten. Tilsett ca. 100 mikroliter membranvaskbuffer til konvoluttpellet.Deretter aspirerer du overnatanten fra thylakoidrøret. Re-suspendere thylakoid pellets i tre milliliter membran vaskebuffer. Oppbevar de tre rensede underrommene i flytende nitrogen for bruk i videre eksperimenter.Etter at membranfraksjonene er gjenopprettet, vasket og konsentrert, brukes SDS-Page til å kvantifisere proteinene og analysere sammensetningen av alle fire fraksjoner. Det mest tallrike proteinet fra stroma er RBCL, og representative resultater viser det forventede resultatet, at svært lite av den store underenheten av dette proteinet inneholder thylakoid- og konvoluttmembranfraksjonene. De lette høsting komplekse proteiner er rikelig thylakoid komponenter som knapt bør forurense konvoluttmembranene.Til slutt er fosfattriosefosfattranslocatoren bare synlig i den rensede konvoluttfraksjonen, på grunn av sin sterke berikelse i konvoluttfraksjonen sammenlignet med hele kloroplastekstraktene. Krysskontaminering av de tre underrommene, den oppløselige ketolsyren reduserer tilsisomerase fra stroma, kloroplastkonvolutten kobber ATPase og lyshøstingskomplekse proteiner fra thylakoidmembranene kan kvantifiseres ved hjelp av både immunoblotting og massespektrometrianalyse. Mens stroma vanligvis ikke er forurenset av konvolutt eller thylakoid fraksjoner, inneholder de rensede konvoluttfraksjonene 3% thylakoidproteiner og opptil 10% av proteiner fra stroma.Thylakoidene er dårlig forurenset av proteiner fra stroma, men inneholder opptil 3% av konvoluttmembranproteiner. Kloroplaster utfører mange viktige funksjoner som assimilering av karbon, svovel og nitrogen, samt syntese av essensielle metabolitter. For å dechiffrere nye regulatoriske mekanismer som styrer kloroplastfysiologien, er det avgjørende for supermålrettede studier å definere surplastikken av kloroplastproteiner.Kloroplaster inneholder flere underrom. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i kloroplastfeltet, for eksempel hvor spesifikt kloroplastprotein ligger i organellet. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å gjennomføre alle kloroplastisolasjonstrinnene på fire grader for å remittere protea motstå til rensede fraksjoner.Etter denne prosedyren kan andre metoder som lascare proteomiske tilnærminger utføres for å svare på flere spørsmål som sammensetningen og dynamikken i proteomet av verdiene plastid underrom. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen plantefysiologi for å utforske mange forskjellige aspekter ved kloroplastbiogenesen og funksjonen ved hjelp av målrettet analyse av kandidatproteiner identifisert i plastid underrom. Ikke glem at å jobbe med volumblender, flytende nitrogen, på bestemte forbindelser som proteasehemmere, krever spesiell forsiktighet.Forholdsregler som bruk av hansker, laboratoriefrakk og vernebriller bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En massespektrometribasert proteomikktilnærming for global og høykonfidensprotein R-metyleringsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...