Name: preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Detta arbete stöds av en gemensam PhD stipendium till IB från INRA växtbiologi och avel Division och från Labex GRALEN (ANR-10-LABX-49-01). Vi vill också uppmärksamma ANR projektet ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) för antikroppar mot LHCP och Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) för antikroppar mot KARI.

1. beredning av buffertar, stamlösningar och övertoningar
<ol><li>Förbered följande lager lösningar som kan lagras till 6 månader vid 4 ° C.<ol>
<li>Laga 1 L Tricine buffert (1 M, pH 8,4) och Tricine buffert (1 M, pH 7,6). Justera pH genom att lägga till KOH pellets.</li>
		<li>Förbereda 1 L av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA, 0,5 M, pH 8) och 3-(N-morpholino) propan sulfonsyra (moppar) buffert (1 M, pH 7,8). Justera pH genom att lägga till NaOH pellets.</li>
		<li>Förbereda 50 mL av MgCl2 (1 M).</li>
		<li>Förbereda 50 mL proteas hämmare lösningar: phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF in i isopropanol, 100 mM), benzamidinen hydroklorid hydrat (100 mM), och ε-amino kapronsyra (50 mM). Obs: Medan PMSF och amino kapronsyra är stabil i lösning för månader vid 4 ° C, benzamidinen lösning ska förvaras vid-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbereda följande lösningar dagen innan experimentet och lagra alla lösningar vid 4 ° C.<ol>
<li>Förbered 4 L av slipning medium pH 8,4 innehållande Tricine-KOH (20 mM, pH 8,4), sorbitol (0.4 M), EDTA (10 mM, pH 8) och NaHCO3 (10 mM). Justera pH genom att lägga till NaOH pellets. Lägg till bovint serumalbumin (BSA) på 0,1% (w/v) strax innan användning och blanda väl.</li>
		<li>Bereda 500 mL tvätt medium (2 x) pH 7,6 innehållande Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) och EDTA (2,5 mM). Justera pH genom att lägga till NaOH pellets. Späd sådan lösning efter beredning av Percoll lutning lösning att få tvätt medium (1 x).</li>
		<li>Förbereda 200 mL Percoll gradient lösning för kloroplast rening genom att blanda Percoll med tvätt medium (2 x) på en lika stor volym att få en slutlig lösning på 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitol.</li>
		<li>Förbereda 50 mL av sackaros lösningar för kloroplast fraktionering genom att blanda moppar (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) och olika koncentrationer av sackaros (0.3 M, 0,6 M och 0,93 M).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered följande övertoningar och buffertar före start experimentet.<ol>
<li>Förbereda sex rör med Percoll lutningar (varje innehållande 30 mL i en 50% Percoll / 0,4 M sorbitol) genom centrifugering vid 38,700 x g under 55 minuter vid 4 ° C. Håll bromsen borta för att hindra tillblandning av till övertoningar. Efter centrifugering, förvara rören som innehåller de förformade lutningarna i ett kallt rum fram till användning.</li>
		<li>Förbereda fyra rör av sackaros övertoningar, med varje övertoning som bildas av tre följande sackaros lager: 3 mL 0,93 M, 2,5 mL 0,6 M och 2 mL 0,3 M sackaros. Noggrant radarbild varje lager, med en peristaltiska pumpen börjar med 0,93 M längst och efterbehandling med 0,3 M överst.</li>
		<li>Förbereda 50 mL hypoton medium för kloroplast Lys som innehåller moppar (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, ställa in i isopropanol), benzamidinen hydroklorid hydrat (1 mM) och ε-amino kapronsyra (0,5 mM). Lagra bufferten på is fram till användning.</li>
		<li>Förbereda 50 mL av membran tvätt buffert innehållande moppar (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), benzamidinen hydroklorid hydrat (1 mM) och ε-amino kapronsyra (0,5 mM). Lagra bufferten på is fram till användning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tillväxt och skörd av Arabidopsis blad
<ol><li>För tillväxten av Arabidopsis växter, förbereda 4 stora plast kastruller (för en total yta av 0,5 till 1 m2) av Arabidopsis växter av sådd 30 mg frön i varje kastrull. Odla Arabidopsis växter i 5 veckor på 12-h ljus cykel vid 23 ° C (dag) / 18 ° C (natt) med låg intensitet 150 μM m-2 s-1.</li>
	<li>Inkubera växter i ett mörkt och kallt rum (4 ° C) över natten innan experimentet (för att minska mängden stärkelse granulat i kloroplaster).</li>
	<li>Pre väger en 1-litersbägare och sedan placera den på isen innan skörd av leaf material.</li>
	<li>Skörda Arabidopsis blad genom att undvika jord (kompost). Re väger bägaren och den vävnad vikten. Obs: 400-500 g blad material förväntas från fyra stekpannor.</li>
	<li>Homogenisera bladen i ett kallt rum med 2 L av slipning buffert (Lägg till BSA före användning) tre gånger / 2 s varje gång, i en mixer med hög hastighet.</li>
	<li>Filtrera Homogenatet i ett kallt rum med 4 lager av muslin och ett lager av nylon blutex. Kläm försiktigt Homogenatet bladen inuti den tunt nylon blutex till extraktet all vätska.</li>
	<li>Återställa den återstående vävnaden i mixer cup i en andra extraktionen. Upprepa steg 2.5 och 2.6 med 2 L av slipning medellång och nya 4-5 lager av muslin (i ett kallt rum).</li>
</ol>3. rening av rå kloroplaster använder differentiell centrifugering
<ol><li>Lika fördela råa cell extraktet till 6 500 mL flaskor och placera flaskorna på is innan centrifugering. Centrifugera i 2 min så snart den maximala hastigheten (2 070 x g) nås (maximal acceleration och broms på, 4 ° C).</li>
	<li>Försiktigt avlägsna supernatanten.</li>
	<li>Aspirera återstående supernatanten med hjälp av en vattenpump och hålla pellets som innehåller koncentrerad rå kloroplaster på is.</li>
	<li>Försiktigt Omsuspendera pellets genom att lägga till en minimal mängd tvätt medium (1 x) (slutlig volym av de kombinera kloroplast suspensioner = 36 mL) med hjälp av en pensel eller en böjd plast spatel. Använd en 10 mL Pipettera 3 ml av tvätt medium i varje flaska. Obs: Använd inte Pipettera med mycket fina tips för att undvika brott på kloroplaster. Alternativt skär en Pipettera med ett rakblad att generera ett större hål blå spets.</li>
	<li>Samla de återsuspenderade kloroplaster i en tub med en 10 mL Pipettera. Blanda försiktigt genom att invertera röret för att erhålla en homogen suspension före lastning på Percoll övertoningar.</li>
</ol>4. rening av intakt kloroplaster på kontinuerlig Percoll lutning
<ol><li>Långsamt Ladda 6 mL av suspensionen kloroplast på toppen av varje av de sex Percoll övertoningar med en 10 mL Pipettera för att undvika brott på kloroplaster.</li>
	<li>Centrifugera Övertoningarna för 10 min vid 13,300 x g, 4 ° C med en svängande-hink rotor. Obs: Acceleration bör vara långsam och bromsen ska vara frånkopplad (broms off eller långsam retardation) för att förhindra blandning av Percoll Övertoningarna.</li>
	<li>Aspirera den övre fasen som innehåller trasiga kloroplaster och intakt mitokondrier med hjälp av en vattenpump, och sedan hämta intakt kloroplaster i lägst fas (bred mörkgrön bandet) med en 10 mL Pipettera. Var noga med att inte aspirera kärnor och cellfragment (finns på botten av röret) med de intakt kloroplaster (figur 2A).</li>
	<li>Späd ut 3-4-faldig intakt kloroplast fjädringen med tvätt buffert (1 x). Centrifugera i 2 min så snart den maximala hastigheten (2 070 x g, 4 ° C) uppnåtts (maximal acceleration och broms på).</li>
	<li>Noggrant avlägsna supernatanten.</li>
	<li>Helt aspirera återstående supernatanten med en vattenpump och hålla pelleten av koncentrerad intakt kloroplaster på is.</li>
	<li>Innan kloroplast Lys, hålla en alikvot av intakt kloroplast bråkdel i ca 1 mL tvätt medium (1 x) för ytterligare analyser med hjälp av sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och western blotting. Hålla en liten delmängd av dessa intakt kloroplaster för bestämning av proteinkoncentration. Lagra den intakta kloroplast-fraktionen i flytande kväve för ytterligare experiment.</li>
</ol>5. lys av intakt kloroplaster med en hypoton buffert och rening av kloroplast sub fack på diskontinuerligt sackaros övertoningar
<ol><li>Lysera de renade intakt kloroplaster av omblandning pelleten i hypoton medium som innehåller proteashämmare (den slutliga volymen inte bör överstiga 12 mL). Obs: Från detta steg, användning av Pipettera med fina tips (blå tips) är möjligt eftersom orördhet av kloroplaster är inte mer viktigt (pipettering kloroplaster upp och ner så länge pellet inte är helt resuspended). Arabidopsis kloroplaster är mycket bräcklig (jämfört med ärt kloroplaster, till exempel) och deras lysis är nästan omedelbar efter inkubation i hypoton medium.</li>
	<li>Långsamt Ladda 3 mL de lyserat kloroplaster på toppen av varje förformade sackaros övertoningar med hjälp av en Peristaltisk pump.</li>
	<li>Ultracentrifugen Övertoningarna för 1 h på (70 000 x g, 4 ° C). Par av rör med hypoton medium buffert före centrifugering i balans.</li>
	<li>Försiktigt återställa de lösliga stromal proteinerna genom pipettering den övre fasen av övertoningen (3 mL från varje övertoning) (figur 2B). Ta en alikvot för bestämning av protein koncentration7. Lagra stroma i flytande kväve för ytterligare experiment.</li>
	<li>Aspirera den återstående övre fasen av varje lutning upp till gula bandet med hjälp av en vattenpump.</li>
	<li>Hämta gula bandet (kuvertet) med en Pipettera (ca 1 mL från varje övertoning). Poolen kuvert i en tub.</li>
	<li>Ta bort den återstående etappen av varje lutning upp till tylakoida pelleten med hjälp av en vattenpump.</li>
</ol>6. tvätt och koncentration av tylakoida och kuvert membransystem
<ol><li>Återsuspendera tylakoida pellets (grön pellets) i en minsta volym (2 mL) av membran tvätt buffert (1 x) (med proteashämmare).</li>
	<li>Späd de kuvert och tylakoida suspensioner 3-4-faldigt i membran tvätt medium (justera volym 10 ml) och ultracentrifugen för 1 h vid (110 000 x g, 4 ° C). Balansera par av rör med membran tvätt buffert före centrifugering.</li>
	<li>Aspirera försiktigt supernatanterna använder en vattenpump.</li>
	<li>Tillsätt cirka 100 µL av membran tvätt buffert (med proteashämmare) till kuvert pelleten. Ta en alikvot för bestämning av protein koncentration7. Lagra renat kuvert membran preparatet i flytande kväve.</li>
	<li>Återsuspendera thylakoids pellets i 3 mL av membran tvätt buffert (med proteashämmare). Ta en alikvot för bestämning av protein koncentration7. Store tylakoida membran fraktionen i flytande kväve.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+theory+for+organelle+origins.">Endosymbiotic theory for organelle origins.</a> Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).</li><li>Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+evolution.">Plastid evolution.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).</li><li>Linka, N., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+metabolite+transporters+in+plants.">Intracellular metabolite transporters in plants.</a> Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).</li><li>Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+envelope+membranes:+a+dynamic+interface+between+plastids+and+the+cytosol.">Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol.</a> Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Agrawal, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics:+collaborating+for+optimal+cell+function.">Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function.</a> Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).</li><li>Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[40]+Electrophoretic+analysis+of+chloroplast+proteins.">[40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins.</a> Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+intact+chloroplasts+from+Arabidopsis+and+spinach+leaves+by+isopycnic+centrifugation.">Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2008).</li><li>Ferro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT_CHLORO,+a+comprehensive+chloroplast+proteome+database+with+subplastidial+localization+and+curated+information+on+envelope+proteins.">AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).</li><li>Seigneurin-Berny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMA1,+a+new+Cu-ATPase+of+the+chloroplast+envelope,+is+essential+for+growth+under+adverse+light+conditions.">HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).</li><li>Vallon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+redistribution+of+cytochrome+b6/f+complexes+along+thylakoid+membranes+upon+state+transitions.">Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).</li><li>Douce, R. J. J., Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+chloroplast.">Purification of the chloroplast.</a> Methods in Chloroplast Molecular Biology. , 239-256 (1982).</li><li>Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+the+isolation+of+intact+chloroplasts+of+high+photosynthetic+capacity.">An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).</li><li>Kunst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+physiologically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis.">Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Protein+Import+into+Chloroplasts+Isolated+from+Stressed+Plants.">Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll-purified+and+photosynthetically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).</li><li>Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+chloroplasts+and+their+sub-organellar+compartments.">Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments.</a> Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).</li><li>Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , (1990).</li><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+membrane+fractions+enriched+in+outer+and+inner+envelope+membranes+from+spinach+chloroplasts.+II.+Biochemical+characterization.">Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization.</a> Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).</li><li>Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+and+protein-kinase+activity+in+isolated+envelopes+of+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 166 (3), 394-400 (1985).</li><li>Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Membrane+Fractions+(Envelope,+Thylakoids,+Grana,+and+Stroma+Lamellae)+from+Arabidopsis+Chloroplasts+for+Quantitative+Proteomic+Investigations+and+Other+Studies.">Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).</li><li>Tomizioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+thylakoid+sub-compartments+using+a+mass+spectrometry-based+approach.">Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).</li><li>Spicher, L., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+of+plastoglobules+(plastid+lipid+droplets)+in+vitamin+K1+and+E+metabolism.">Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Denna artikel syftar till att detalj steg protokollet som används för att rena kloroplaster (och deras sub fack) från Arabidopsis thaliana. Eftersom tillgängligheten av dess komplett genomsekvens nästan två decennier sedan, och av stora samlingar av införande mutanter till gemenskapens förfogande, är Arabidopsis nu allmänt accepterade som en modell växt. Men medan denna anläggning var perfekt anpassad för genetiska metoder, plantera forskare behövs för att anpassa biokemiska och fysiologiska verktyg till denna nya modell. Protokollen tillåter för att rena photosynthetically active kloroplaster från bladen av väletablerade biokemiska modeller som spenat12 eller ärta13 således hade anpassas. Den första metoden som beskriver rening av Arabidopsis kloroplaster publicerades 199814, strax före utgivningen av sekvensen Arabidopsis genomet. Flera år senare, enkla metoder för att isolera Arabidopsis kloroplaster kompatibel med studier som syftar till att analysera in vitro- import av proteiner i renat organeller gjordes tillgängliga15,16. Dock tillät dessa metoder inte för att kombinera hög grad av renhet och bevarande av fotosyntetiska aktivitet av de renade kloroplaster. Mer nyligen fastställdes17, en snabb metod, som bygger på användning av Percoll övertoningar, och gör det möjligt för att behålla nästan 90% av photosynthesis mätt i börjar bladen av Arabidopsis.
Protokollet beskrivs här tillåter för att rena Arabidopsis kloroplaster på en utmärkt nivå av renhet. Faktiskt, immunologisk upptäckt av föroreningar från andra cell fack visat att renat organeller som saknar mitokondrie och plasmamembranet markörer9,10. Detta protokoll var också effektivt att rena kloroplaster från flera Arabidopsis ekotyper18, som Columbia (Col) eller Wassilewskija (WS), dvs de ekotyper som används för genomet eller uttryckt sekvens Taggar (EST) sekvensering projekt men också för att generera T-DNA införande mutanter i Arabidopsis. Med andra ord, när proteomik studier måste utföras, är detta protokoll kompatibel med dessa två referens ekotyper från Arabidopsis. Slutligen, utbytet av kloroplaster som använder detta protokoll är liknande den som erhålls när start från spenat eller ärt blad (dvs 3%, mätt från klorofyll innehållet i den Percoll-renat kloroplast jämfört med totalen klorofyll belopp i börjar bladen). När det gäller proteiner är avkastningen nära 50 mg kloroplast proteiner, när organeller renas från 500 g 5 veckor gamla Arabidopsis blad.
Att nå sådan god avkastning (och kloroplast integritet), en bör emellertid ägna särskild uppmärksamhet åt flera steg när du använder detta protokoll. Kloroplast i Arabidopsis är en ytterst bräcklig struktur (detta inte är fallet för ärt kloroplaster, till exempel). Särskild uppmärksamhet krävs således för att undvika storskaliga bristning av organeller under reningen. Antal och storlek av stärkelse granulat i kloroplaster är kritiska för beredning av intakt kloroplaster. Faktiskt, kloroplaster som innehåller stora stärkelse korn kommer generellt brytas under inledande differential centrifugations steg som syftar till att koncentrera de rå kloroplast fraktioner12. Växterna bör därför hållas över natten i ett mörkt och kallt rum (4 ° C) före experimentet, att minska mängden stärkelse.
Nya användare av detta protokoll skulle vara frestade att starta från större mängder löv material (stora rosetter från gamla Arabidopsis växter med större blad) försöker förbättra återhämtningen av renat kloroplaster. Men i våra händer, start från unga blad (5 veckor gamla) är den bästa kompromissen att kombinera avkastning, renhet och integritet av renat organeller. Alltför gamla löv är faktiskt mycket berikad med fenolföreningar som visade sig ha en negativ inverkan på kloroplast integritet19.
Slutligen är steget initial utvinning (slipning av vävnaden) ett annat viktigt steg. Blandning processen måste begränsas till några sekunder. Som nämnts ovan, kan nya användare frestas att använda längre blandning, således förväntar sig att starkt förbättra avkastningen av renat organeller. Om längre blandning effektivt släpper mer material från bladen, verkar det dock att andelen trasiga kloroplaster snabbt ökar i rå cell extrakt. På grund av denna hög andel brutna till intakt kloroplaster i mediet, ytterligare reningssteg (separation på Percoll lutningar) påverkas starkt och utbytet av rening är oväntat lägre.
Tillgänglighet av särskilda protokoll att rena organeller har låtit en rad högt dataflöde proteomik-baserade experiment skall utföras på kloroplast prover. Dessa data har gjorts tillgängliga i flera offentliga databaser6, vilket ger för biologer i fältet en korrekt subcellulär (och subplastidial) lokalisering för många kloroplast proteiner. Detta var särskilt sant för kuvert proteiner vars identitet och läge förblev mestadels okända innan dessa analyser, sedan kuvertet membran utgör en mindre kloroplast komponent (1-2% av kloroplast proteiner) medan du spelar en nyckelroll i kloroplast metabolism och biogenes5,20. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, vi nyligen analyserat sammansättningen av de tre viktigaste kloroplast fack från Arabidopsis (dvs, stroma, thylakoids och kuvert membran systemet)9. Baserat på en semi Kvantitativ proteomik strategi (spektral räkna), har vi kunnat bedöma delningen av hundratals proteiner i dessa tre kloroplast-fack.
Medan detta protokoll tillåter för att rena de tre avdelningarna av kloroplast från Arabidopsis, är det också möjligt att urskilja ytterligare sub fack i kloroplast. Kuvert membran systemet är faktiskt gjord av inre och de yttre kuvertet membran (figur 1). Dock till bäst av vår kunskap, en metod att rena inre och yttre kuvert membran från Arabidopsis kloroplaster fortfarande fastställas. Inre och yttre kuvert membran kan renas från spenat21 eller ärt22 kloroplaster. Den största begränsningen av Arabidopsis resulterar mestadels från de begränsande mängder av utgångsmaterial. Start från 500 g Arabidopsis blad (som redan kräver 1 m2 yta i en tillväxt kammare) tillåter renande bara 100 µg av kuvert proteiner. Däremot, är det lätt att börja med 5-10 kg spenat blad från marknaden, att rena stor mängd kloroplaster8 och avsluta med en avkastning på 3 till 10 mg av kuvert proteiner från detta material.
Samma sak gäller för tylakoida sub fack. Ja, thylakoids är gjorda av ljus membranet blåsor (lameller) och täta strukturer (grana) (figur 1). Särskilda protokoll finns att skilja dessa två avdelningar i Arabidopsis23,24. Igen, utifrån en kvantitativ proteomik analys, vi nyligen inventerats proteinerna som finns i dessa två sub fack24. Dessa metoder, tillsammans med en fördjupad undersökning av litteraturen, tillåtet validera eller föreslår hypoteser för, subplastidial platsen för hundratals tylakoida proteiner. Det är dock viktigt att Observera att ytterligare membran microdomains finns på thylakoids böjda marginaler. Dessa lipoprotein sub fack, eller plastoglobules, är permanent kopplad till tylakoida membran och innehålla en specifik uppsättning proteiner25. Använder detta protokoll, går det således inte att skilja dessa specifika proteiner från andra tylakoida komponenter.
Vissa äkta (välkänd) kuvert, stroma eller tylakoida komponenter saknas fortfarande från förteckningarna över identifierade proteiner. Tillsammans med riktade biokemiska och immunologiska analyser, kommer kontinuerlig förbättring av MS känslighet vara till stor hjälp att återbesöka kloroplast innehållet mot en komplett repertoar av sammansättningen av dess olika sub fack.

Kloroplaster är viktiga komponenter i växtceller. De härrör från en cyanobakterie förfader som har genomgått en endosymbios och så småningom utvecklades som en organell under evolution1,2. Dessa organeller innehåller tre huvudsakliga fack (figur 1). De kuvert består av ett inre och ett yttre membran som omger organell. Detta dubbla membran system innehåller olika enzymer som är involverade i metabolismen av lipider och pigment och är mestadels ägnas åt kontroll av kommunikationen mellan plastids och cytosolen. Den innehåller olika transportsystem som tillåter import av kärn-kodade proteiner och utbyte av joner och metaboliter mellan cytosolen och den kloroplast således reglerar viktiga metaboliska funktioner av plant cell3,4 . Stroma, den lösliga fasen av kloroplast, innehåller enzymer av Calvin cykeln (CO2 assimilering), syntesen av olika metaboliter inklusive aminosyror och vitaminer, och de transkription och translation machineries av plastid. Tylakoida membranet är ett allmänt organiserade inre membran nätverk där den lätta fasen av fotosyntesen sker. Kloroplaster är därmed, den plats där grundläggande metaboliska vägar uppstår5.
För att dechiffrera nya reglerande mekanismer som styr kloroplast dynamics och fysiologi, är definiera den sub-plastidial lokaliseringen av kloroplast proteiner således avgörande för att stödja riktade undersökningar som syftar till att bättre förstå proteiner funktioner i modell organismer6. För att få tillgång till den äkta subplastidial lokaliseringen av dessa proteiner, är det därför nödvändigt att starta från högt rena subplastidial fraktioner (kuvert membran, stroma och thylakoids). I detta sammanhang, syftet med detta protokoll är att rena intakt kloroplaster från Arabidopsis blad med hjälp av differentiell centrifugations och kontinuerlig Percoll övertoningar och fractionate dem med diskontinuerlig sackaros lutningar, i tre sub fack (dvs. kuvert, stroma och thylakoids). Den metod som beskrivs här ger också instruktioner att bedöma renheten av renat sub-organellar fraktioner med hjälp av markörer associerade till olika kloroplast sub facken. Detta protokoll är värdefull för subplastidial lokalisering av proteiner med hjälp av immunoblotting och för ytterligare analys av renat fraktioner med hjälp av masspektrometri (MS)-baserat proteomiska studier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6977.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6213.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#949;-amino caproic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6979.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9286.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>USB</td>
			<td>US12370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel staining medium</td>
			<td>Clini-sciences</td>
			<td>GEN-QC-STAIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>528151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fat-free milk powder</td>
			<td>R&#233;gilait</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H/1150/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH pellets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.05012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>CARLO ERBA</td>
			<td>480507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMA1 antibody</td>
			<td></td>
			<td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KARI antibody</td>
			<td></td>
			<td>Ferro et al, 2010</td>
			<td>Used at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCP antibody</td>
			<td></td>
			<td>Vallon et al, 1991</td>
			<td>Used at a 1:25,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-coumaric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol (3-aminophalhydrazin)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO).</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large (30 cm &#215; 45 cm) plastic cases</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>162135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. thaliana seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Around 30 mg of seeds for a whole case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost &#34;Floragard&#34;</td>
			<td>Puteaux</td>
			<td>16311770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth rooms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12-h light cycle, set at 23&#176;C (day) / 18&#176;C (night) with a light intensity of 150 &#956;mol/m2/s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muslin or cheesecloth</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70116</td>
			<td>80-cm-large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon blutex 50 &#956;m aperture</td>
			<td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td>
			<td></td>
			<td>50 &#956;m aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity</td>
			<td>Waring Blender</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 &#215; 500-mL plastic bottles)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JA-20 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-20 (6 &#215; 50 mL polypropylene tubes)</td>
			<td>Sorvall instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 &#215; 50 mL polycarbonate tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor (6 &#215; 13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge (Beckman L7)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman JSE-06D18)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5415D or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>BA85, Schleicher and Schuell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>3MM, Whatman, Maidstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System for protein transfer to nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad Protean 3 or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chloroplast sub-compartments from arabidopsis for the analysis of protein localization by immunoblotting or proteomics

Kloroplaster är viktiga komponenter i växtceller. Sådan plastids uppfylla många avgörande funktioner, såsom assimilering av kol, svavel och kväve samt syntes av viktiga metaboliter. Dessa organeller består av de följande tre viktiga sub fack. Kuvertet, kännetecknas av två membran, omger organell och kontroller av meddelande av plastid med andra cell-fack. Stroma är lösliga fasen av kloroplast och den viktigaste platsen där koldioxid omvandlas till kolhydrater. Tylakoida membranet är den inre membran nätverk bestående av grana (platt komprimerade SBO) och lamellerna (mindre täta strukturer), där syrerik fotosyntesen tar plats. Protokolls beskriver steg för steg förfaranden som krävs för rening, med hjälp av differentiell centrifugations och Percoll lutningar, av intakt kloroplaster från Arabidopsisoch deras fraktionering, använder sackaros lutningar, i tre sub fack (dvs. kuvert, stroma och thylakoids). Detta protokoll innehåller också instruktioner om hur man bedömer renheten av dessa fraktioner med hjälp av markörer associerade till olika kloroplast sub facken. Den metod som beskrivs här är värdefullt för subplastidial lokalisering av proteiner med immunoblotting, men också för subcellulär och subplastidial Proteomik och andra studier.

Successiva steg av förfarandet resulterar i renat kloroplast och deras sub fack återupptas i figur 2. Percoll lutning (figur 2A) kan skilja intakt kloroplaster från trasiga kloroplast och mitokondrier (överst på toningen) eller kärnor och cellfragment (nederst på toningen). Efter ruptur av Percoll-renat organeller tack vare en osmotiska chock separeras de resulterande fraktionerna på en sackaros lutning (figur 2B). Stroma (lösliga delen av kloroplast) är flytande på ytan av sackaros övertoningen. De lätta kuvert membranet blåsor återvinns som en diskret gula band vid 0,6/0,93 M sackaros gränssnittet. De tyngsta tylakoida membran blåsor är koncentrerade på botten av röret. Efter återhämtning, tvätt och koncentration av de två membran fraktionerna, proteiner är kvantifierade och sammansättningen av alla fyra fraktioner analyseras på en SDS-PAGE (figur 2 c). Köer som är laddade på grundval av lika protein (20 µg av varje renad fraktion). Att veta att kloroplaster innehåller endast 1% av kuvert proteiner och 50% av proteiner från stroma eller från thylakoids, tenderar detta att överskatta korskontaminering av renat kuvert preparat med andra kloroplast sub fack. Denna metod tillåter dock för att detektera minuten mängder proteiner cross-förorena det kuvert bråket. Markörer från varje fack (dvs riklig proteiner) är mycket hjälpsam i att utvärdera korskontaminering av fraktioner. Tylakoida och kuvert membran fraktioner förväntas faktiskt innehåller mycket låga mängder av den stora subuniten av RuBisCO (RBCL), det mest förekommande proteinet från stroma (50 kDa). Trasiga kloroplaster kan lätt skiljas från intakt kloroplast på grund av förlusten av detta stromal protein8. Ljuset skörd komplexa proteiner (LHCP) är 25-kDa rikligt tylakoida komponenter som bör knappt (mindre än 3%) förorena kuvert membran9. Slutligen den fosfat-delar-fosfat translocator (TPT) är en 30-kDa-protein som bara är synlig i det rena kuvert bråket på grund av dess starka anrikning (dvs 50 till 100 x) i kuvert fraktionen jämfört med hela kloroplast extrakt. Med metoden som beskrivs här, kloroplast sub fack är i allmänhet dåligt smittat som bekräftas med hjälp av western-blot analyser (figur 2D) förlitar sig på antikroppar riktade mot kända markörer för alla tre sub fack: de lösliga ketol-syra reductoisomerase (KARI) från stroma, kloroplast kuvertet koppar ATPas (HMA1), och ljuset skörd komplexa proteiner (LHCP) från tylakoida membran. Korskontaminering av de tre sub fack kan kvantifieras med både immunoblotting och mass spectrometry analyser9. Medan stroma inte är vanligtvis förorenad av kuvert eller tylakoida fraktioner, renat kuvert fraktioner innehåller 3% av tylakoida proteiner och upp till 10% av proteiner från stroma. Proteiner från stroma förorena dåligt tylakoida membran (mindre än 1%) men thylakoids innehåller upp till 3% av kuvert membranproteiner. Mer än att ha en avgörande roll i att identifiera äkta subplastidial placeringen av kloroplast proteiner, den nuvarande metoden således begränsar också felaktiga slutsatser om subplastidial lokalisering av proteiner som härrör från gränsöverskridande föroreningar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg"> Figur 1: representativa systemet av kloroplast sub fack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg"> Figur 2: rening av intakt kloroplaster och deras tre största sub fack med Percoll och sackaros övertoningar. A. Percoll lutning så att separationen av trasiga och intakt kloroplaster. B. sackaros lutning så att separationen av stroma, kuvert och tylakoida fraktioner. C. representant SDS-PAGE av proteiner från intakt kloroplaster och deras tre sub huvudfack som gör det möjligt för att visualisera riklig markörer från varje sub fack. Varje lane innehåller 10 µg av proteiner. Molekylvikt markörer: RBCL, stora subuniten av RuBisCO (markör för stroma); TPT, fosfat/delar-fosfat translocator (markör för kuvertet); LHCP, lätta skörd komplexa proteiner (markör för tylakoida). D. Western-blot experiment gör det möjligt för att upptäcka specifika markörer (med specifika antikroppar) från varje sub fack: kloroplast kuvert koppar ATPas HMA110, ljuset skörd komplexa proteiner LHCP från tylakoida membran11, och den ketol-syra reductoisomerase KARI från stroma9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics at JoVE.com

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Här, vi beskriver en metod för att rena intakt kloroplaster från Arabidopsis blad och deras tre sub huvudfack (kuvert, stroma, och thylakoids), med en kombination av differential centrifugations, kontinuerlig Percoll lutningar, och diskontinuerliga sackaros övertoningar. Metoden är värdefull för subplastidial och subcellulär lokalisering av proteiner av immunoblotting och proteomik.

Beredning av kloroplast sub fack från Arabidopsis för analys av Protein lokalisering av Immunoblotting eller proteomik

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter särskiljande proteiner av liknande aktiviteter som har olika roller, beroende på lokalisering i kuvert, stroma, eller thylakoid membran. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom de kommer att använda växter som är för gamla, blanda bladet för länge, eller kommer inte att vara tillräckligt försiktig när åter avbryta pellets av intakt, men bräcklig, kloroplast. Visuell demonstration av denna metod är kritisk, eftersom lastning eller återvinning av fraktion från percoll eller i sackaros gradient steg är svåra att lära sig.På grund av risken för blandning av gradienterna och därmed för korsförorenande de olika kloroplast subfraktionerna. Demonstrera förfarandet kommer att vara av Imen Bouchnak, en doktorand från vårt laboratorium och Lucas Moyet, en inomhus ingenjör. Till att börja, växa arabidopsis växter i fem veckor med en 12 timmars ljuscykel vid 23 grader Celsius på dagen och 18 grader Celsius på natten, med en ljusintensitet på 150 mikromol per kvadratmeter per sekund.Nästa dag, pre-väga en fem liters bägare och sedan placera den på is. Skörda arabidopsen blad, se till att undvika att plocka någon jord. Åter väga bägaren och registrera vävnadsvikten.Överför de skördade bladen till ett kylrum. Placera bladen i en mixer som innehåller två liter slipbuffert och homogenisera dem genom att blanda med hög hastighet tre gånger under en löptid på två sekunder varje gång. Placera fyra lager av muslin och ett lager av nylon blå tex i en sil och detta för att filtrera homogenatet.Pressa försiktigt de blandade bladen inuti muslin och blå tex för att extrahera all vätska. Återvinna den återstående vävnaden i mixerkoppen och upprepa homogeniseringsprocessen med hjälp av färsk slipbuffert. Använd fyra till fem lager nya muslin för att filtrera denna nya homogenate i en ny bägare som tidigare beskrivits.Fördela råcellsextraktet lika i sex 500 milliliterflaskor. Placera flaskorna på is. Centrifugera de kylda flaskorna vid 2070 G och fyra grader Celsius i två minuter.Efter detta, försiktigt kasta supernatanten. Använd en vattenpump för att aspirera eventuella återstående supernatant och hålla pellets, som innehåller koncentrerad rå kloroplast, på is. Med hjälp av en pipett på 10 milliliter, tillsätt tre milliliter tvättmedel till varje flaska, se till att inte använda fina pipettspetsar för att undvika att bryta kloroplasterna.Använd sedan en pensel eller böjd plastspatel för att försiktigt åter upphäva pellets. Med hjälp av en pipett på 10 milliliter samlar du upp de återuppdragna kloroplasterna i ett enda rör. Invertera försiktigt röret för att erhålla en homogen kloroplast suspension.Till att börja med, använd en 10 millileter pipetter för att långsamt ladda sex milliliter av kloroplast suspension ovanpå var och en av de sex beredda percoll lutningar. Med hjälp av en svängande hink rotor, centrifug lutningarna vid 13, 300 G och fyra grader Celsius i 10 minuter. Använd en vattenpump för att aspirera den övre fasen, som innehåller brutna kloroplaster och intakt mitokondrierna.Använd sedan en 10 milliliter pipett för att hämta intakta kloroplaster som finns i den nedre fasen, var noga med att inte aspirera kärnorna och cellskräp som finns längst ner i röret tillsammans med de intakta kloroplasterna. Späd den intakta kloroplastupphängningen tre till fyra gånger med tvättmedium. Förvara cirka 10 milliliter av en alikvot av intakt kloroplastfraktion för vidare analys av SDS-Page och Western blotting.Centrifugera vid 2070 G och fyra grader Celsius i två minuter. Efter detta, försiktigt kasta supernatanten. Använd en vattenpump för att aspirera eventuella återstående supernatant och hålla pelleten, som innehåller koncentrerad rå kloroplast, på is.För att lysa de renade intakta kloroplasterna, åter upphäva pelleten i hypotoniskt medium som innehåller proteashämmare. Överför de återupphängda kloroplasterna till ett 10 milliliter falkrör. Förbered sackarosgradienten enligt textprotokollet.Med hjälp av en peristaltisk pump, långsamt ladda tre milliliter av de lystna kloroplasterna ovanpå var och en av de förformade sackarosgradienterna. Använd hypotonmedelbuffert för att balansera par av rör, och sedan ultra-centrifug lutningen vid 70, 000 G och fyra grader Celsius i en timme. Ta en alikvot av de lösliga stromalproteiner som ska användas vid bestämning av proteinkoncentrationen.Därefter använder en vattenpump för att aspirera den återstående övre fasen av övertoningen fram till det gula bandet. Med hjälp av en pipett, hämta det gula bandet, som är kuvertet. Dra kuverten i ett rör.Ta sedan bort den återstående fasen av övertoningen upp till tylakoidpelleten. Åter uppskjut de thylakoidpellets i membrantvättbuffert med proteashämmare. Späd den thylakoid suspensionen och kuvertet tre till fyra gånger med tvättmedium, justera den slutliga volymen till 10 milliliter.Balansera par av rör med membran tvättbuffert och ultra-centrifug dem på 110, 000 G och fyra grader Celsius i en timme. Efter detta, använd en vattenpump för att noggrant aspirera supernatanten. Tillsätt cirka 100 mikroliter av membrantvättbuffert till kuvertpelleten.Därefter aspirera supernatanten från tylakoidröret. Åter upphäva tylakoid pellets i tre milliliter av membran tvätt buffert. Förvara de tre renade delutrymmena i flytande kväve för användning i ytterligare experiment.Efter att membranfraktionerna har återvunnits, tvättats och koncentrerats används SDS-Page för att kvantifiera proteinerna och analysera sammansättningen av alla fyra fraktionerna. Det vanligast förekommande proteinet från stroma är RBCL, och representativa resultat visar det förväntade resultatet, att mycket lite av den stora underenheten av detta protein innehålls de thylakoid och kuvert membranfraktioner. De lätta skördekomplexproteinerna är rikliga thylakoidkomponenter som knappt ska förorena kuvertmembranen.Slutligen är fosfattrisfosfatsfolocator endast synlig i den renade kuvertfraktionen, på grund av dess starka anrikning i kuvertfraktionen vid jämförelse med hela kloroplastextrakten. Korskontaminering av de tre delutrymmena, de lösliga ketol-syraredukoisomerasen från stroma, chloroplast-kuvertet koppar ATPase och de lätta skördekomplexproteinerna från tylakoidmembranen kan kvantifieras genom att både immunoblotting och masspektrometrianalys används. Medan stroma är vanligtvis inte förorenas av kuvert eller thylakoid fraktioner, den renat kuvert fraktioner innehåller 3%tyrelakoid proteiner och upp till 10%av proteiner från stroman.De thylakoids är dåligt förorenade av proteiner från stroma, men innehåller upp till 3%av kuvert membran proteiner. Kloroplaster utföra många avgörande funktioner såsom assimilering av kol, svavel, och kväve, samt syntes av väsentliga metaboliter. För att dechiffrera nya regleringsmekanismer som styr kloroplast fysiologi, definiera surplastik lokalisering av kloroplast proteiner är avgörande för super-riktade studier.Kloroplaster innehåller flera delutrymmen. Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i kloroplastfältet, till exempel var specifikt kloroplastprotein finns inom organellen. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att genomföra alla kloroplast isolering steg på fyra grader för att remitera protea motstå i renade fraktioner.Efter detta förfarande, andra metoder som lascare proteomiska metoder kan utföras för att besvara ytterligare frågor som sammansättning och dynamik av proteom av värdena plastid delavdelningar. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området växtfysiologi att utforska många olika aspekter av kloroplasten biogenes och funktion med hjälp av riktad analys av kandidatproteiner identifieras inom plastid delavdelningar. Glöm inte att arbeta med volym mixer, flytande kväve, på specifika föreningar som proteashämmare, kräver särskild omsorg.Försiktighetsåtgärder såsom att bära handskar, labbrock, och skyddsglasögon bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En masspektrometribaserad proteomikmetod för global och högkonfidensprotein R-metyleringsanalys

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...