Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

بتأييد هذا العمل جزئيا الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) منح 254850309. يشكر المؤلفون لوكنر مادلين لقراءة نقدية من المخطوطة.

1-نموذج إعداد: خلية خلية خلط الإنزيم
ملاحظة: بروتوكول التالية وصف الإجراء خلط للخلايا ملتصقة. فإنه يمكن تعديله للخلايا المزروعة في التعليق.
<ol><li>عدد مناسب من الخلايا على لوحة 6، حسنا، مثلاً، 800,000 الخلايا HEK 293T (عد مع نويباور العد الدائرة)، يوميا قبل تعداء البذور. العدد يم?...

الإجراء التجريبي الموضح هنا يسمح التحقيق في البروتين-بروتين التفاعلات عبر جهات الاتصال خلية خلية، تستخدم تقنيات التحليل الطيفي تقلب الأسفار، إلا وهي سفككس و ccN & b تشمل هذه الأساليب تحليل إحصائي لتقلبات fluorescence المنبعثة من اثنين FPs طيفيا المنفصلين تنصهر فيها protein(s) للفائدة في جهة اتصال...

العديد من العمليات البيولوجية التي تحدث في مواقع التفاعلات خلية خلية، مثل خلية خلية التصاق1،2،3، خلية خلية الانصهار4 والاعتراف الخلوية5. هذه الأحداث تمثل أهمية خاصة أثناء تطوير الكائنات الحية متعددة الخلايا، وخلية خلية الاتصالات، مثلاً، أثناء الاستجابات المناعية. وساطة هذه العمليات عادة من البروتينات التي تكون مترجمة على السطح، أي في غشاء البلازما (م) من الخلايا المجاورة وتخضع لتفاعلات معينة في خلية خلية الاتصال التي هي على وجه التحديد الخاضعة للتنظيم في المكان والزمان. في كثير من الحالات، هذه التفاعلات المباشرة هومو-أو التفاعلات عبر الغيروية البروتين-بروتين، ولكن قد ينطوي أيضا على أيونات أو يغاندس بوصفها linkers خارج الخلية1. على الرغم من أهمية أساسية، وهناك نقص في فحوصات سبر هذه تفاعلات البروتين البروتين محددة مباشرة في البيئة الأصلية للخلايا الحية. تتطلب العديد من الأساليب أما تعطيل الخلية (مثل فحوصات الكيمياء الحيوية مثل شركة إيمونوبريسيبيتيشن6)، التثبيت (مثلاً، بعض تقنيات بصرية مجهرية فائقة القرار والمجهر الإلكتروني لخلية خلية اتصالات7)، أو هي غير محددة، مثل التجميع/التصاق فحوصات8،9. للتغلب على هذه المشكلة، تم تنفيذ fluorescence تقنيات استناداً إلى الأسفار الرنين الطاقة نقل (الحنق)10 أو الأسفار التكامل11. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق تحقيقا لمسافات صغيرة بما فيه الكفاية بين فلوروفوريس، تسميات الفلورسنت على الجانب خارج الخلية البروتينات10، يحتمل أن تتداخل مع التفاعلات عبر .
نقدم هنا، تحليل القائم على الأسفار بديلة لتفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال. هذا النهج يجمع بين النهج عبر الارتباط الأسفار (الأسفار المسح الضوئي عبر ارتباط مطيافية (سفككس)، وعدد عبر الارتباط والسطوع (ccN & ب)) وخلط الخلايا معربا عن بناء انصهار من البروتين من الفائدة، مثلاً، مستقبلات التصاق. تتم تسمية مستقبلات التحقيق في الخليتين التفاعل مع البروتينات الفلورية طيفيا فصل اثنين (FPs)، من داخل الخلايا الجانب (انظر الشكل 1A).
أساليب العاملين تقوم على التحليل الإحصائي للأسفار التقلبات الناجمة عن الحركة انتشارية البروتينات الفلورية الانصهار من خلال حجم ليزر [كنفوكل] مجهر مسح التنسيق. أكثر في التفاصيل، ويَسْبِر المقايسة نشر المشارك من البروتينات ذات الاهتمام في كلا PMs المجاورة في خلية خلية الاتصالات. إذا البروتينات الخضوع عبر التفاعلات، سيحمل هذه المجمعات عبر البروتينات الفلورية التي تنبعث منها في كل القنوات الطيفية، تسبب تقلبات fluorescence مرتبطة من بواعث كلا. من ناحية أخرى، في حالة حدوث لا ملزمة، تقلبات عدد من البروتينات التي تواجه الدورة الشهرية ستكون مستقلة، مما تسبب في لا تقلبات مرتبطة. اكتساب يمكن أن يؤديها بطريقتين: 1) سفككس يستند على شكل خط المسح الضوئي عبر الاتصال خلية خلية ويَسْبِر فعالية التفاعلات في بقعة تقع في منطقة الاتصال. من خلال تحليل الزمانية لتقلبات الأسفار، سفككس يوفر أيضا معلومات حيوية، أي معاملات نشر مجمعات البروتين؛ 2) ccN & ب يستند إلى إجراء تحليل بيكسيلويسي لسلسلة من الصور التي حصلت في مناطق الاتصال خلية خلية. قد القدرة على التحقيق وخريطة التفاعلات على طول كامل الاتصال بالمنطقة (في المستوى البؤري واحد)، ولكن لا يقدم معلومات عن ديناميات. يمكن الجمع بين كلا الأسلوبين مع تحليل للسطوع الجزيئية، أي إشارة fluorescence متوسط المنبعثة في الوحدة الزمنية من مجمعات البروتين نشرها مفردة، وهكذا، تقديم تقديرات ل stoichiometry مجمعات البروتين في خلية الاتصالات.
في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد عينة وأداة المعايرة، الحصول على البيانات وتحليلها لإجراء التحليل المقدم على ليزر [كنفوكل] تجارية المسح مجهر. يمكن إجراء هذه التجارب على أي صك مجهزة بالعد فوتون أو كاشفات التناظرية وموضوعي مع ارتفاع الفتحة العددية. علينا مواصلة مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول وتقديم مخططات تصحيح للعديد من العمليات التي تسبب تقلبات إشارة أرتيفاكتوال، مثلاً، للكشف عن الضوضاء، وحركة فوتوبليتشينج أو الخلية. وضعت أصلاً للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا ملتصقة، التحليل يمكن تعديلها لتعليق الخلايا، أو تكييفها لنظم الغشاء النموذجي، مثلاً، أونيلاميلار العملاقة حويصلات (جوفس) أو البلازما العملاقة غشاء الحويصلات (جبمفس)، مما يسمح التحديد الكمي للتفاعل في البيئات المختلفة الدهن، أو في حالة عدم12،سيتوسكيليتون المنظمة13.
المسح الضوئي الطيفي الارتباط عبر الأسفار هو نسخة معدلة من الأسفار عبر ارتباط مطيافية14 وتم تصميمه خصيصا للتحقيق في ديناميات انتشارية بطيئة في الأغشية الدهنية15. أنه يستند إلى عملية شراء مسح خط عمودي إلى الساعة التي تحتوي على بروتينات الفلورسنت للفائدة. للتحقيق في التفاعلات بين نوعين من أنواع البروتين المسمى بشكل مختلف، يتم اكتساب في قناتين طيفية استخدام اثنين من خطوط الليزر وهما كشف windows ل fluorophores طيفيا المنفصلين عن ذويهم. سبب ديناميات نشر بطيئة من البروتينات في الساعة (D≤ ~ 1/ق2ميكرومتر)، يمكن أن يؤديها قياس خالية من الحديث عبر مخطط الإثارة من سطر إلى سطر15بالتناوب. يبدأ التحليل: 1) محاذاة خوارزمية تصحيح لحركة الخلية الجانبية استناداً إلى بلوكويسي في المتوسط من خطوط ~ 1000، 2) تحديد الموقف مع الموقف، أي الساعة fluorescence أقصى إشارة، في كل كتلة و 3) تحويل جميع القطع لمشترك منشأ12،15، كل على حدة في كل قناة. ثم، يتم تحديد تلقائي لتناظر الساعة بكسل بتحديد المنطقة الوسطى من نوبة ضبابي من مجموع كافة الأسطر الانحياز (أي، مركز ± 2.5σ). تكامل الإشارة في كل سطر غلة السلسلة الزمنية fluorescence غشاء F(t) في كل قناة (ز = الأخضر قناة، r = القناة الحمراء). علما بأن حجم بكسل يجب أن تكون صغيرة بما يكفي، مثلاً، < 200 نانومتر، إعادة بناء شكل النقطة نشر وظيفة والعثور على مركزها، المقابلة لموقف رئيس الوزراء. حضور فوتوبليتشينج كبيرة، قد يكون على غرار مع دالة آسيه مزدوجة السلسلة الزمنية الأسفار في كل قناة وثم تم تصحيحها بالصيغة التالية:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
من المهم ملاحظة أن هذه الصيغة بفعالية تصحيح كلا من الاتساع ونشر الأوقات التي تم الحصول عليها من تحليل الارتباط F(t)ج، مقارنة بتقديرات المعلمة التي يمكن الحصول على من غير المصححة F(t). ثم، مهام الارتباط التلقائي والصليب (أكفس/أطر التعاون القطري) وتحسب للأسفار إشارات:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">، (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">، (3).
حيث δوأنا = وأنا(t)- <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> وأنا(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> و أنا = ز، والبحث والتطوير.
نموذج نشر ثنائي الأبعاد ثم مزودة بجميع مهام الارتباط (لجنة الأمن الغذائي العالمي):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
هنا، تشير N إلى عدد البروتينات الفلورية في حجم المراقبة و τد وقت نشرها لكل قناة. هذا النموذج يأخذ في الاعتبار أن في وصف الإعداد التجريبية، يحدث انتشار البروتينات في الساعة في الطائرة x-z، خلافا لتكوين علاقة الفلورية استخداماً التحليل الطيفي (FCS) تجارب على الأغشية السبر نشر في الطائرة x-y من حجم [كنفوكل]17. الخصر ث0 وعامل البنية S، واصفاً الإطالة wض حجم التنسيق في z, S = ثضث0، يتم الحصول عليها من قياس معايرة FCS نقطة أدوا بالأصباغ طيفيا مماثلة ونفس إعدادات البصرية استخدام القيم الموجودة بالفعل لأن معامل نشر دصبغ:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">، (5).
حيث τد، وصبغ هو وقت نشر متوسط قياس جزيئات الصبغة، التي تم الحصول عليها من تركيب نموذج لنشر ثلاثية الأبعاد للبيانات، ومراعاة التحولات حساب الكسر ر كل ن الجزيئات إلى الدولة الثلاثي مع ثابت وقت ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
وأخيراً، نشر معاملات (د) وقيم السطوع الجزيئية (اليورو) والصليب-الارتباط النسبي للبيانات سفككس (rel.cc.) يتم حساب كما يلي:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">، (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">، (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">، (9).
زالصليب(0) من حيث السعة للدالة عبر الارتباط و <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> هو السعة للدالة ترابط تلقائي في القناة-ال أنا.
هذا التعريف نسبي الصليب-العلاقة المتبادلة، أي استخدام كحد أقصى بدلاً من يعني في المعادلة 9، يأخذ في الاعتبار أن يقتصر الحد الأقصى لعدد من المجمعات من نوعين من أنواع البروتين الحالية بتركيزات مختلفة الأنواع الموجودة في عدد أقل.
عدد عبر الارتباط وسطوع يستند إلى تحليل هذه لحظة لشدة الأسفار لكل بكسل من رصة صور اكتسبت على مر الزمن في موقع ثابت في العينة، تتألف عادة من ~ 100-200 الإطارات، مع اثنين الطيفية القنوات ( g = أخضر القناة، r = القناة الحمراء). من الوسط الزماني <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>أنا<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">أنا والفرق <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>، وتحسب سطوع الجزيئية اليوروi وعدد نأنا في كل بكسل وقناة الأطياف (أنا = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">، (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
من المهم ملاحظة أن معادلات معينة تنطبق على الحالة المثالية لكاشف فوتون العد الحقيقي. لأنظمة الكشف التناظرية، تطبيق المعادلات التالية19،20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">، (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
هنا، هو S معامل التحويل بين الفوتونات المكتشفة والتهم الرقمية المسجلة، <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> ضجيج قراءات و إزاحة يشير إلى الكشف عن كثافة الإزاحة. عموما، يجب معايرة هذه الكميات، لأي نوع الكاشف، استناداً إلى قياس الفرق كاشف كدالة كثافة لإنارة مطرد19، مثلاً، سطح معدني عاكس أو حل صبغ المجففة. يمكن تحديد الإزاحة عن طريق قياس معدل العد في عينة دون ضوء الإثارة. عن طريق إجراء انحدار خطي للفرق المرتبطة بالكشف عن <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> مقابل الأرض كثافة (أنا), S و <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> يمكن أن تكون حازمة19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
وأخيراً، يحسب في كل بكسل سطوع عبر الارتباط ويتم تعريفها بشكل عام21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">، (15).
حيث <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> هو الصليب-الفرق <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
من أجل تصفية تقلبات المعمرة، تتم جميع ccN & حسابات ب بعد النقل التصفية، بشكل مستقل لكل بكسل22. بإيجاز، ni, اليوروأنا (أنا = g, r) وتحسب بcc في انزلاق قطاعات مثل إطارات 8-15. يمكن أن متوسط القيم التي تم الحصول عليها ومن ثم ثم الحصول على بكسل النهائي القيم عدد والسطوع.
تحليل ستويتشيوميتري بغية تقدير stoichiometry مجمعات البروتين في الخلية جهات الاتصال، يمكن تحليل سطوع الجزيئية بشكل منفصل في كل قناة طيفية سفككس أو ccN & ب البيانات. في سفككس، يتم الحصول على قيمة سطوع واحدة كل قياس في كل قناة. في ccN & B، يتم الحصول على الرسم بياني سطوع لكل بكسل المقابلة لجهة الاتصال خلية خلية وقيمة متوسط (أو الوسيط) يمكن استخدامها سطوع الممثل للقياس. عن طريق إجراء نفس التحليل على مرجع أحادي، يمكن تطبيع جميع قيم السطوع مباشرة الحصول على الدولة oligomeric متوسط مجمعات البروتين تم الكشف عنها. في هذه المرحلة، من المهم تصحيح لوجود FPs غير الفلورية قد يؤدي التقليل من الدولة أوليجوميريك. وهذا عادة ما يقوم بقياس سطوع23،البروتين مرجع هومو dimeric24 استخدام سفكس لون واحد أو عدد والسطوع (ن وب).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ينطوي على التفاعل خلية خلية، عادة بوساطة من البروتينات التي تتفاعل في التفاعل بين الخلايا المجاورة. للفائدة، قادرون فقط بضعة فحوصات على وجه التحديد سبر هذه التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية. نقدم هنا، فحص لقياس ربط البروتينات التي أعربت في سطوح الخلايا المجاورة، وفي الاتصالات خلية خلية. هذا الإنزيم يتكون من خطوتين: خلط الخلايا معربا عن البروتينات التي تهم تنصهر فيها مختلف البروتينات الفلورية، تليها fluorescence تقلب التحليل الطيفي القياسات في خلية خلية جهات الاتصال باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر. نحن إثبات جدوى هذا التحليل في سياق بيولوجيا ذات صلة بقياس تفاعلات البروتين اميلويد السلائف مثل 1 (APLP1) عبر تقاطعات خلية خلية. نحن توفير بروتوكولات مفصلة في الحصول على البيانات باستخدام التقنيات المستندة إلى الأسفار (المسح الأسفار عبر ارتباط التحليل الطيفي، وعدد عبر الارتباط وتحليل السطوع) ومعايرات الصك المطلوب. علاوة على ذلك، فإننا نناقش الخطوات الحاسمة في تحليل البيانات، وكيفية تحديد وتصحيح التباينات الإشارات الخارجية، زائفة، مثل تلك التي تعزى إلى حركة فوتوبليتشينج أو الخلية.
وبصفة عامة، المقايسة المقدمة تنطبق على أي إنسان-أو التفاعل الغيروية البروتين-بروتين في خلية خلية الاتصالات، بين الخلايا بأنواع مختلفة أو نفسها ويمكن تنفيذها على ليزر [كنفوكل] تجارية المسح مجهر. هو شرط هام استقرار النظام، الذي ينبغي أن يكون كافياً للتحقيق ديناميات انتشارية البروتينات ذات الاهتمام خلال عدة دقائق.

أول اختبار لتحليل التفاعل البروتين البروتين، أي خلط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية طيفيا متميزة متبوعاً سفككس/ccN & ب القياسات (الشكل 1)، ينبغي أن يقوم على البروتينات التي لا يتوقع أن التفاعل في الخلية جهة الاتصال (أي، عنصر تحكم سلبية). ولذلك...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

ويصف هذا البروتوكول اتباع نهج قائم على التحليل الطيفي تقلب الأسفار للتحقيق في التفاعلات بين البروتينات بوساطة التفاعلات خلية خلية، أي البروتينات المترجمة في تقاطعات الخلية، مباشرة في الخلايا الحية. نحن توفير مبادئ توجيهية مفصلة على صك المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها، بما في ذلك تصحيحات لمصادر الحرفية الممكنة.

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين الخلايا إلى الخلية مثل أي مستقبلات تتوسط التصاق أو التعرف في اتصالات الخلية إلى الخلية وما إذا كانت يغاند محددة تؤدي إلى تفاعلاتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لأحد للتحقيق في مثل هذه التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تثبيت الخلايا أو تعطيل. على الرغم من أن يتم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا المستزرعة، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على النظم الأخرى أحادية الغشاء vesicles أو حتى الكائنات الحية نموذج صغير.عموما الأفراد الجدد لهذا الأسلوب يجب أن تحقق من أن العينة مستقرة بما فيه الكفاية للسماح اكتساب على مدى بضع دقائق عن طريق فحص بعناية حركة الخلية وبطء الاختلافات إشارة. أولاً، بذور العدد المناسب من الخلايا في ما لا يقل عن أربعة آبار من لوحة ستة جيدا في اليوم قبل نقل. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون في متوسط DMEM تكمل مع 10٪ FBS و 1٪ L-الجلوتامين.لتنفيذ تجربة أساسية عبر البلازميدات لبروتين الفائدة تنصهر إلى البروتين الأخضر أو الأصفر الفلورسنت والبروتين الفلورسنت الأحمر في آبار منفصلة. بعد أربع ساعات إزالة متوسطة النمو وغسل كل جيدا بلطف مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها المغنيسيوم والكالسيوم إسقاط برنامج تلفزيوني على حافة البئر لمنع انفصال الخلايا أثناء الغسيل. ثم إزالة برنامج تلفزيوني.إضافة ما يقرب من 50 ميكرولترات من EDTA حل إسقاط الحكمة إلى كل بئر لتسهيل انفصال الخلايا. بعد احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، هز ببطء لوحة ستة جيدا في شكل آخر لفصل الخلايا. المقبل، إضافة 950 ميكرولتررس من متوسطة النمو لكل بئر وإعادة ضغط الخلايا عن طريق الأنابيب عدة مرات صعودا وهبوطا وبالتالي فصل جميع الخلايا من أسفل جيدا.تأكد من أن الخلايا يتم إعادة اعتمادها بشكل صحيح وفصلها عن بعضها البعض عن طريق التحقق بصرياً من عدم وجود مجاميع خلايا كبيرة بعد إعادة التراكم. نقل حل الخلية من بئر واحد إلى البئر المقابلة. مزيج بلطف عن طريق الأنابيب عدة مرات صعودا وهبوطا.ثم بذور الخلايا المختلطة على طبق القاع الزجاج 35 ملليمتر والثقافة الخلايا المصنفة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون ليوم واحد. في الليزر المسح الضوئي المجهر برنامج إعداد المسار البصري. لتجنب التوك عبر الطيفية حدد مسارين منفصلين لإثارة واكتشاف mEGFP أو mEYFP و mCherry أو mCardinal بشكل تسلسلي وحدد تبديل المسارات كل خط.للكشف عن استخدام عوامل التصفية المناسبة لكلا القنتين. ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المختلطة على حامل العينة. بعد الانتظار 10 دقيقة لضمان توازن درجة الحرارة وتقليل الانجراف التركيز، والتركيز على الخلايا باستخدام ضوء انتقال في القائمة تحديد موقع.البحث عن زوج من الخلايا الحمراء والخضراء في اتصال مع بعضها البعض. بعد ذلك، حدد مسار فحص عمودي على جهة اتصال من خلية إلى خلية باستخدام زر الاقتصاص. التكبير لتحقيق حجم بكسل من 50 إلى 200 نانومتر وحدد خط في وضع المسح الضوئي.تعيين حجم الإطار إلى 128 بكسل واحد. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى الحد الأقصى المسموح به للقيمة. ثم تعيين دورات إلى 100، 000 إلى 500،000.بعد ذلك، اختر القوى الليزر المناسبة. تعيين أجهزة الكشف عن الفوتون وضع العد. اضغط على تجربة البدء لبدء عملية الاستحواذ.قم بتصدير ملفات البيانات الأولية إلى صورة RGB TIF بتنسيق بيانات أولية. هذا الملف سوف يحتوي على kymograph مع البيانات قناة الأخضر والأحمر في قناة يطلق عليها G و R من الصورة، على التوالي. بعد ذلك، استيراد الملف TIF مع برنامج التحليل المناسب ثم تابع لتنفيذ التحليل.قم بمحاذاة الخطوط عن طريق تنفيذ متوسط وقت من فئة مع كتل من 500 إلى 1000 خط. تحديد موضع الغشاء في كل كتلة. ثم تحول جميع الكتل إلى نفس الموقف الجانبي.تلخص جميع الخطوط المحاذية على طول محور الوقت وتلائم متوسط الكثافة باستخدام وظيفة غاوسية. تعريف بكسل المقابلة للغشاء كما كل بكسل داخل زائد أو ناقص 2.5 سيغما من موقف الغشاء، وخلاصة كثافة هذه بكسل في كل خط الحصول على قيمة إشارة الفلورسنت واحد لكل نقطة زمنية. إذا لوحظ تبييض الصورة، وتطبيق تصحيح التبييض عن طريق تركيب سلسلة زمنية الغشاء fluorescence مع وظيفة أسية مزدوجة وتطبيق صيغة التصحيح المناسبة.حساب وظائف السيارات والارتباط المتبادل وفقا للمعادلات المناسبة. لتحسين موثوقية التحليل وتجنب القطع الأثرية تنفيذ العمليات الحسابية ل 10 إلى 20 قطاعات متساوية من القياس الكلي. فحص سلسلة زمنية fluorescence ووظائف الارتباط في كل قطعة وإزالة شرائح مشوهة بشكل واضح.وأخيراً، متوسط جميع الشرائح غير المشوهة. أثناء تحليل البيانات الخاصة بك، قم بفحص سلسلة وقت الشدة ووظائف الارتباط من كل جزء بعناية لتجنب التشوهات، على سبيل المثال، بسبب وجود تحويصلات داخل الخلايا في محيط الغشاء. تظهر هنا صورة كثافة لخلايا HEK 293T تعبر عن myristolyated-palmitoylated-mEYFP أو mCardinal.ولوحظ ارتباط بين تقاطعي نسبي قريب من الصفر في حين أن وظائف العلاقات الذاتية تظهر أوقات اضمحلال مميزة من 10 إلى 20 مللي ثانية لنشر myristolyated-palmitoylated-mEYFP و mCardinal في غشاء البلازما. وظائف الارتباط المتبادل من قياسات sFCCS من خلايا HEK 293T التعبير عن الغشاء الرسو heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP كان السعات الإيجابية وأظهرت أوقات تسوس مماثلة وظيفة التوثيق التلقائي. وقد أدت قياسات sFCCS على اتصالات الخلية إلى الخلية بين APLP1-mEYFP وAPLP1-mCardinal-التعبير عن الخلايا إلى ارتباط نسبي إيجابي من 0.45.وأظهرت وظائف الارتباط sFCCS التي تم الحصول عليها من القياسات عبر مجموعات APLP1 في اتصالات الخلية ديناميات انخفضت بقوة كما يتضح من أوقات الاضمحلال الكبيرة في التذبذبات في أوقات التأخر الكبير. وعند إضافة أيونات الزنك، زاد الارتباط النسبي المتبادل إلى متوسط قيمة قدره 0.8. كذلك زاد السطوع الجزيئي بشكل كبير من القلة الصغيرة إلى التعدد الأكبر التي تتكون من 10 إلى 50 مونومرات على كل خلية.قد يؤدي عدم استقرار عابر في دالة عبر الارتباط وجود قيم سالبة أو عالية خطأ تبادلية إيجابية الارتباط. عادةً ما تنحرف وظائف الارتباط المقابلة بشدة عن وظائف غالبية الشرائح. كما يمكن استخدام نهج مكمل لsFCCS عبر الارتباط عدد والسطوع للكشف عن التفاعلات البروتين البروتين.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن خلط الخلايا المصابة هو خطوة حاسمة. بلطف مزيج الخلايا وتحسين كفاءة transfection لزيادة فرصة العثور على الخلايا الحمراء والخضراء في اتصال. بعد تطورها تم استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف تفاعلات جزيئات الإشارة في نقاط الاشتباك العصبي المناعي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

مقايسة حركية بلاناية لقياس خصائص المنتجات الطبيعية ذات الخواص الحيوية

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...