Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) give 254850309. Forfatterne takke Madlen Luckner for kritisk læsning af manuskriptet.

1. Prøvetilberedning: Celle-celle blanding Assay
Bemærk: Følgende protokol beskriver blanding proceduren for vedhængende celler. Det kan ændres til celler dyrkes i suspension.
<ol><li>Seed et passende antal celler på et 6-godt plade, fx 800.000 HEK 293T celler (tælles med en Neubauer tælle kammer), en dag før Transfektion. Antallet kan ændres afhængigt af tiden mellem såning og Transfektion og justeret i forhold til andre celletyper. Hvis du vil udføre en grundlæggende...

Eksperimentelle proceduren beskrevet her tillader undersøgelse af protein-protein trans interaktioner på celle-celle kontakter, beskæftiger fluorescens udsving spektroskopi teknikker, nemlig sFCCS og ccN & B. Disse metoder indebærer en statistisk analyse af fluorescens udsving udsendes af to spektralt adskilt FPs sammensmeltet til de(n) af interesse for en kontakt mellem to tilstødende celler, hver udtrykker én eller anden fusion protein. Tilstedeværelsen af trans komplekser er kvantificeret ved ...

Mange biologiske processer forekommer ved lokaliteter af celle-celle interaktioner, f.eks. celle-celle vedhæftning1,2,3, celle-celle fusion4 og cellular anerkendelse5. Sådanne begivenheder er særlig vigtigt i forbindelse med udviklingen af flercellede organismer og cell-celle kommunikation, fx under immunrespons. Disse processer er typisk formidlet af proteiner, der er lokaliseret på overfladen, dvs, på plasma membran (PM) af tilstødende celler og underkastes specifikke interaktioner på celle-celle-kontakt, der er præcist reguleret i tid og rum. I mange tilfælde disse interaktioner er direkte homo- eller Heterotypiske protein-protein trans interaktioner, men kan også involvere ioner eller ligander som ekstracellulære linkers1. Selv om af grundlæggende betydning, er der en mangel på assays sondering disse specifikke protein-protein interaktioner direkte i native miljøet af levende celler. Mange metoder enten kræve celle forstyrrelser (fx, biokemiske analyser som co-immunoprecipitation6), fiksering (f.eks. nogle af super-resolution Optisk mikroskopi-teknikker og elektronmikroskopi af celle-celle kontakter7), eller er ikke-specifikke, fx sammenlægning / vedhæftning-undersøgelser,8,9. For at afhjælpe dette problem, er blevet gennemført fluorescens teknikker, baseret på fluorescens resonans energi overførsel (FRET)10 eller fluorescens komplementering11. Disse metoder kræver dog, for at opnå tilstrækkelig små afstande mellem fluorophores, fluorescerende etiketter på den ekstracellulære side af proteiner10, potentielt forstyrre trans interaktioner.
Her præsenterer vi en alternativ fluorescens-baseret analyse for protein-protein interaktioner på celle-celle kontakter. Denne metode kombinerer fluorescens cross-korrelation tilgange (scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi (sFCCS), kors-sammenhæng antallet og lysstyrke (ccN & B)) og blanding af celler, der udtrykker en fusion konstruktion af protein af interesse, fx en vedhæftning receptor. De undersøgte receptorer i de to interagerende celler er mærket med to spektralt adskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulære side (Se figur 1A).
De erhvervsdrivende metoder er baseret på den statistiske analyse af fluorescens udsving induceret af diffuserende bevægelse af fluorescerende fusion proteiner gennem den fokale volumen af en Konfokal laser scanning mikroskop. Mere detaljeret sonder analysen Co udbredelsen af proteiner af interesse i både nærliggende PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteinerne undergår trans interaktioner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner udsender i begge spektrale kanaler, forårsager korreleret fluorescens udsving af begge udledere. På den anden side, hvis ingen bindende opstår, vil de nummer udsving af proteiner i forbindelse med PMs være uafhængige, forårsager ingen korreleret udsving. Erhvervelsen kan udføres på to måder: 1) sFCCS er baseret på en linie-formede scanning på tværs af celle-celle-kontakt og effektivt sonder interaktioner i et spot, beliggende i regionen kontakt. Gennem en tidsmæssig analyse af fluorescens udsving giver sFCCS også dynamics oplysninger, dvs., diffusion koefficienterne af proteinkomplekser; 2) ccN & B er baseret på en pixel-wise analyse af en sekvens af billeder erhvervet på celle-celle kontakt regioner. Det har evnen til at probe og kort interaktioner langs hele kontakte region (i en fokalplan), men indeholder ikke oplysninger om dynamik. Begge metoder kan kombineres med en analyse af den molekylære lysstyrke, dvs, gennemsnitlige fluorescens signalet udsendes i enheden af enkelt spreder proteinkomplekser og således give et skøn over støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter.
I denne artikel leverer vi detaljerede protokoller for prøveforberedelse, instrument kalibrering, dataopsamling og analyse til at udføre præsenteres analysen på en kommerciel Konfokal laser scanning mikroskop. Forsøgene kan udføres på ethvert instrument udstyret med photon optælling eller analog detektorer og et mål med høj numerisk blænde. Vi videre diskutere kritisk trin i protokollen og give korrektion ordninger for flere processer, der forårsager artefactual signal udsving, fx detektor støj, photobleaching eller celle bevægelse. Oprindeligt udviklet til at probe interaktioner mellem vedhængende celler, analysen kan ændres for affjedring dataceller eller tilpasset model membran systemer, fx giant unilamellar vesikler (GUVs) eller kæmpe plasma membran vesikler (GPMVs), så den kvantificering af interaktioner i forskellige lipid miljøer eller i mangel af en organiseret cytoskeleton12,13.
Scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi er en modificeret version af fluorescens cross-korrelations-spektroskopi14 og var specielt designet til at probe langsom diffuserende dynamics i lipid membraner15. Det er baseret på en line scan erhvervelse vinkelret på PM indeholdende de fluorescerende proteiner af interesse. For at sonde vekselvirkninger mellem to anderledes mærket protein arter, udføres erhvervelse i to spektrale kanaler ved hjælp af to laser linjer og to påvisning windows for spektralt adskilte fluorophores. På grund af den langsomme diffusion dynamics af proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan udføres ved vekslende excitation ordningen fra linje til linje15. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for laterale celle bevægelse baseret på block-wise gennemsnit af ~ 1000 linjer, 2) bestemmelse af position med maksimal fluorescens signaldet vil sige, PM position, i hver blok og 3) skiftende af alle blokke til en fælles oprindelse12,15, separat i hver kanal. Derefter udføres en automatisk valg af pixels svarende til PM ved at vælge den centrale region fra en Gaussisk pasform af summen af alle linje linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integration af signalet i hver linje udbytter membran fluorescens tidsserien f(v) i hver kanal (g = grøn kanal, r = rød kanal). Bemærk, at pixelstørrelse har at være lille nok, f.eks < 200 nm, at rekonstruere form af punkt spredt funktion og finde sin center, svarende til placeringen af PM. Ved tilstedeværelse af betydelige photobleaching, fluorescens tidsserier i hver kanal kan modelleres med en dobbelt-eksponentiel funktion og derefter korrigeres med følgende formel:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Det er vigtigt at bemærke, at denne formel effektivt korrigerer både amplituder og diffusion gange korrelation analysen af f(v)c, sammenlignet med parameteren skøn, der ville være opnået fra den ukorrigeret f(v). Derefter, auto - og cross-korrelation funktioner (ACFs / CCFs) af fluorescens signaler beregnes:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
hvor δFjeg = Fjeg(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>, F,jeg(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> og jeg = g, r.
En to-dimensionel diffusion model monteres derefter at alle korrelation funktioner (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Her, angiver N antallet af fluorescerende proteiner i observation volumen og τd diffusion tid for hver kanal. Denne model tager hensyn at i indstillingen beskrevet eksperimentelle diffusion af proteiner i PM opstår i x-z planet, i modsætning til den anvendte konfiguration af fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner sondering Diffusion i x-y plane Konfokal bind17. Taljen w0 og struktur faktor S, der beskriver brudforlængelse wz af fokale volumen i z, S = wz/w0, er fremstillet af et punkt FCS kalibrering måling udført med samme optiske indstillinger og spektralt lignende farvestoffer ved hjælp af allerede tilgængelige værdier for diffusion koefficient Dfarvestof:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
hvor τd, farvestof er den målte gennemsnitlige diffusion tid af farvestof molekyler, fremstillet af montering af en model for tre-dimensionelle diffusion til data, under hensyntagen til konto overgange i en brøk T af alle N molekyler til en triplet stat med en gang konstant ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Endelig, diffusion koefficienter (D), Molekylær lysstyrkeværdierne (ε) og den relative cross-samkøring af sFCCS data (rel.cc.) beregnes som følger:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
hvor Gcross(0) er amplituden af cross-korrelationsfunktionen og <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> er amplituden af funktionen autokorrelation i jeg-th kanal.
Denne definition af den relative Kors-sammenhæng, dvs bruger max i stedet for at betyde i ligning 9, tager i betragtning, at det maksimale antal komplekser af to protein der forekommer i forskellige koncentrationer er begrænset af den arter, der forekommer i et lavere tal.
Kors-sammenhæng antallet og lysstyrke er baseret på et øjeblik analyse af fluorescens-intensiteten for hver pixel i en billedstak erhvervet over tid til en fast stilling i stikprøven, typisk bestående af ~ 100-200 billeder, med to spektrale kanaler () g = grøn kanal, r = rød kanal). Fra den tidsmæssige betyder <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>jeg<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">jeg og varians <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, Molekylær lysstyrke εjeg og nummer, njeg beregnes i hver pixel og spektral kanal (jeg = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Det er vigtigt at bemærke, at de givne ligninger gælder den ideelle sag af en ægte photon-optælling detektor. For analoge detektionssystemer gælder følgende ligninger19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Her, S er omregningsfaktoren mellem fundne fotoner og de optagede digitale tællinger, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> er udlæsning støj og offset henviser til detektor intensitet forskydning. Generelt bør disse mængder kalibreres, for enhver detektor type, baseret på måling detektor afvigelse som funktion af intensitet for jævn belysning19, fx en reflekterende metal overflade eller tørrede farvestof løsning. Forskydning kan bestemmes ved at måle count sats for en prøve uden excitations lys. Ved at udføre en lineær regression af detektor-associerede variansen <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> versus intensitet, (jeg) plot, S og <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> kan være beslutsom19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Endelig, cross-korrelation lysstyrke beregnes i hver pixel og defineres generelt som21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
hvor <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> er cross-afvigelsen <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
For at filtrere langlivede udsving, udføres alle ccN & B beregninger efter en boxcar filtrering, uafhængigt for hver pixel22. Kortvarigt, njeg, ε,jeg (jeg = g, r) og Bcc beregnes i glidende segmenter af fx 8-15 frames. De dermed opnåede værdier kan derefter gennemsnit for at opnå den endelige pixel antallet og lysstyrken værdier.
Støkiometrisk analyse For at kunne vurdere støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter, kan den molekylære lysstyrke analyseres separat i hver spektrale kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS opnås en lysstyrkeværdi pr. maaling i hver kanal. CcN & B, en lysstyrke histogram af alle pixels svarende til celle-celle-kontakt er opnået og den gennemsnitlige (eller median) værdi kan bruges som repræsentative lysstyrke til måling. Ved at udføre den samme analyse på en monomere reference, kan alle lysstyrkeværdierne normaliseres du kan direkte hente den gennemsnitlige oligomere stat af de fundne proteinkomplekser. På dette tidspunkt, er det vigtigt at korrigere for tilstedeværelsen af ikke-fluorescerende FPs, som kan resultere i en undervurdering af den oligomere stat. Dette er typisk udføres ved at måle lysstyrken af en homo-dimerisk reference protein23,24 ved hjælp af en farve sFCS eller antal og lysstyrke (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

En bred vifte af biologiske processer indebærer celle-celle interaktioner, typisk medieret af proteiner, der interagerer på grænsefladen mellem naboceller. Af interesse kan kun få assays specifikt sondering sådanne interaktioner direkte i levende celler. Her præsenterer vi en analyse for at måle bindingen af proteiner udtrykt på overflader af tilstødende celler på celle-celle kontakter. Denne analyse består af to trin: blanding af celler, der udtrykker interesse smeltet til forskellige fluorescerende proteiner proteiner, efterfulgt af fluorescens udsving spektroskopi målinger på celle-celle kontakter ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop. Vi bevise gennemførligheden af denne analyse i forbindelse med biologisk relevante ved at måle interaktioner af amyloid forløber-lignende protein 1 (APLP1) på tværs af celle-celle vejkryds. Vi leverer detaljerede protokoller på dataopsamling ved hjælp af fluorescens-baserede teknikker (scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi, kors-sammenhæng antallet og lysstyrke analyse) og nødvendigt instrument kalibreringer. Vi drøfte kritiske trin i dataanalyse, og hvordan at identificere og rette eksterne, falske signal variationer, som dem på grund af photobleaching eller celle bevægelse.
I almindelighed, præsenteres analysen er gældende til homo- eller Heterotypiske protein-protein interaktion på celle-celle kontakter, mellem celler i de samme eller forskellige typer og kan gennemføres på en kommerciel Konfokal laser scanning mikroskop. Et vigtigt krav er stabiliteten i systemet, som skal være tilstrækkelig til at probe diffuserende dynamics af proteiner af interesse over flere minutter.

En første test for protein-protein interaktion assay, dvs, blanding af celler, der udtrykker spektralt forskellige fluorescerende proteiner efterfulgt af sFCCS/ccN & B målinger (figur 1), bør udføres på proteiner, der ikke forventes at interagere på celle-celle kontakt (dvs. en negativ kontrol). Derfor HEK 293T celler, der udtrykker myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal var blandede, og sFCCS blev udført ...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Denne protokol beskriver et fluorescens udsving spektroskopi-baseret tilgang til at undersøge interaktioner mellem protein mægle celle-celle interaktioner, dvs protein lokaliseret i celle vejkryds, direkte i levende celler. Vi leverer detaljerede retningslinjer på instrument kalibrering, dataopsamling og analyse, herunder rettelser til mulige artefakt kilder.

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Denne metode kan hjælpe med at forstå centrale spørgsmål i celle-til-celle interaktion felt, såsom hvilke receptorer mægle vedhæftning eller anerkendelse i celle-til-celle kontakter, og om specifikke ligands udløse deres interaktioner. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en mulighed for at undersøge sådanne interaktioner direkte i levende celler uden behov for cellefiksering eller forstyrrelser. Selv om denne metode bruges til at undersøge interaktioner mellem dyrkede celler, det kan også anvendes på andre systemer mono-membran vesikler eller endda små model organismer.Generelt enkeltpersoner nye til denne metode bør kontrollere, at deres prøve er stabil nok til at tillade erhvervelse over et par minutter ved omhyggeligt at inspicere cellebevægelse og langsom signal variationer. Først frø det passende antal celler i mindst fire brønde af en seks-brønd plade om dagen før transfektion. Kultur cellerne ved 37 grader Celsius 5% kuldioxid i DMEM medium suppleret med 10% FBS og 1% L-glutamin.At udføre et grundlæggende eksperiment transfect plasmider for protein af interesse smeltet til en grøn eller en gul fluorescerende protein og en rød fluorescerende protein i separate brønde. Efter fire timer skal vækstmediet fjernes og hver brønd vaskes forsigtigt med en milliliter PBS suppleret med magnesium og calcium, der falder PBS på brøndkanten for at forhindre løsrivelse af cellerne under vask. Fjern derefter PBS.Tilføj ca. 50 mikroliter EDTA-opløsning falder klogt til hver brønd for at lette opløsningen af cellerne. Efter inkubering ved 37 grader Celsius i to minutter, langsomt ryste seks-brøndpladen sidet for at løsne cellerne. Dernæst tilsættes 950 mikroliter af vækstmedium til hver brønd og resuspenderede cellerne ved at pipettere et par gange op og ned og derved frigøre alle celler fra brøndbunden.Sørg for, at cellerne resuspended ordentligt og løsrevet fra hinanden ved visuelt at kontrollere for fraværet af store celle aggregater efter resuspension. Overfør celleopløsningen af en brønd til den tilsvarende brønd. Bland forsigtigt ved pipettering et par gange op og ned.Derefter frø de blandede celler på en 35-millimeter glas bund skål og kultur de seedede celler ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid for en dag. I laserscanning konfokal mikroskop software oprettet den optiske vej. For at undgå spektrale krydstale skal du vælge to separate spor for at ophidse og detektere mEGFP eller mEYFP og mCherry eller mCardinal sekventielt og vælge Skift spor hver linje.Til registreringen skal du bruge passende filtre til begge kanaler. Skålen, der indeholder de blandede celler, anbringes på prøveholderen. Når du har ventet 10 minutter for at sikre temperaturligevægt og for at reducere fokusafdrift, skal du fokusere på cellerne ved hjælp af transmissionslyset i Find-menuen.Søg efter et par røde og grønne celler i kontakt med hinanden. Vælg derefter en scanningssti vinkelret på celle-til-celle-kontakt ved hjælp af knappen Beskær. Zoom for at opnå en pixelstørrelse på 50 til 200 nanometer, og vælg Linje i scanningstilstand.Indstil rammestørrelsen til 128 med en pixel. Indstil scanningshastigheden til den maksimalt tilladte værdi. Derefter indstille cykler til 100, 000 til 500, 000.Efter dette skal du vælge de relevante laserkræfter. Indstil detektorerne til tilstanden Fotontælling. Tryk på Start eksperiment for at starte anskaffelsen.Eksporter de rå datafiler til et RGB TIF-billede i råt dataformat. Denne fil vil indeholde en kymograph med den grønne og røde kanal data i kanalen betegnes G og R af billedet, henholdsvis. Importer derefter TIF-filen med den relevante analysesoftware, og fortsæt med at udføre analysen.Juster linjerne ved at udføre et segmentmæssigt tidsgennemsnit med blokke på 500 til 1000 linjer. Membranpositionen i hver blok bestemmes. Skift derefter alle blokke til den samme sidestilling.Sammenfat alle justerede linjer langs tidsaksen, og tilpas den gennemsnitlige intensitetsprofil ved hjælp af en gaussisk funktion. Definer de pixel, der svarer til membranen, som alle pixel i plus eller minus 2,5 sigma af membranens position, og sammenstak intensiteten af disse pixel i hver linje, der opnår en enkelt fluorescerende signalværdi for hvert tidspunkt. Hvis der observeres fotoblegning, skal der anvendes en blegningskorrektion ved at montere membranfluorescenstidsserien med en dobbelt eksponentiel funktion og anvende den relevante korrektionsformel.Beregn de automatiske og krydskorrelationsfunktioner i henhold til de relevante ligninger. For at forbedre pålideligheden af analysen og undgå artefakter udføre beregningerne for 10 til 20 lige store segmenter af den samlede måling. Undersøg fluorescenstidsserier og korrelationsfunktioner i hvert segment, og fjern klart forvrængede segmenter.Endelig gennemsnitlige alle ikke-forvrængede segmenter. Mens du analyserer dine data, skal du omhyggeligt undersøge intensitetstidsserien og korrelationsfunktionerne fra hvert segment for at undgå forvrængninger, for eksempel på grund af intracellulære vesikler i membranperiferisfæren. Et intensitetsbillede af HEK 293T-celler, der udtrykker myristolyated-palmitoylated-mEYFP eller mCardinal, vises her.Der blev observeret en relativ krydskorrelation tæt på nul, mens autokorrelationsfunktionerne viser karakteristiske henfaldstider på 10 til 20 millisekunder for diffusion af myristolyated-palmitoylated-mEYFP og mCardinal i plasmamembranen. De tværkorrelationsfunktioner af sFCCS målinger af HEK 293T celler udtrykker membran-forankret heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP havde positive amplituder og viste lignende henfald gange som autokorrelation funktion. sFCCS-målinger på celle-til-celle kontakter mellem APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal-udtrykserende celler resulterede i en positiv relativ krydskorrelation på 0,45.SFCCS-korrelationsfunktionerne fra målinger på tværs af APLP1-klynger ved cellecellekontakter viste stærkt reduceret dynamik som tydelig fra store henfaldstider i svingningerne i store lagtider. Ved tilsætning af zinkion steg den relative krydskorrelation til en gennemsnitsværdi på 0,8. Yderligere den molekylære lysstyrke betydeligt steget fra små oligomerer til større multimers bestående af 10 til 50 monomerer på hver celle.Forbigående ustabilitet kan resultere i en krydskorrelationsfunktion med negative værdier eller en høj falsk positiv krydskorrelation. De tilsvarende korrelationsfunktioner afviger typisk kraftigt fra de fleste segmenters. Som en supplerende tilgang til sFCCS krydskorrelation nummer og lysstyrke kan bruges til at opdage protein-protein interaktioner.Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske, at blanding af transficerede celler er et kritisk skridt. Bland forsigtigt cellerne og optimer transfektionseffektivitet for at øge risikoen for at finde røde og grønne celler i kontakt. Efter sin udvikling denne teknik er blevet brugt af forskere inden for immunologi til at udforske samspillet mellem signalering molekyler i immunologiske synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En Fluorescens-baseret assay phospholipid Scramblase Aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spot variation fluorescens korrelationsspektroskopi til analyse af molekylær diffusion ved plasmamembranen af levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...